全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(2): 139-145(2012)
收稿日期: 2011-06-27; 修回日期: 2011-11-18
基金项目: 转基因生物新品种培育重大专项 (2009ZX08002-002B); 国家自然基金项目(31000886); 河南省超级产粮大省奖励资金项
目(2011-196-31)
通讯作者: 薛保国,研究员,主要从事微生物分子生物学和植物病理学研究; Tel: 0371-65852150, E-mail: xuebbb@gmail. com
第一作者: 杨丽荣(1976 - ),女,内蒙古通辽人,副研究员,博士,主要从事基因工程与分子生物学研究; E-mail: yanglirong0224@yahoo.
com. cn。
绿色木霉几丁质酶基因 Tvchi cDNA的克隆、
原核表达与活性分析
杨丽荣1, 孙 虎1, 雷振生2, 赵献林2, 全 鑫1, 薛保国1*
( 1河南省农业科学院植物保护研究所 /河南省农作物病虫害防治重点实验室 /农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室,
郑州 450002; 2河南省农业科学院小麦研究中心, 郑州 450002)
摘要:利用 RT-PCR方法从绿木霉 ZBS-6 中扩增了几丁质酶基因 Tvchi,序列分析表明 Tvchi 开放阅读框为 1 293 bp,编码
430 个氨基酸残基,Blast 分析表明,与多种木霉 18 家族内切几丁质酶具有较高的同源性。 将该基因克隆到原核表达载体
pET-28a上,转化大肠杆菌 BL21(DE3),经 IPTG诱导,SDS-PAGE和Western印迹分析表明成功的获得了 47 kD 的融合蛋
白。 该融合蛋白经 Ni-NTA柱亲和纯化,获得了纯度较高的融合蛋白 Tvchi。 Tvchi最适酶活温度为 37℃,最适酶活 pH 值
为 6. 8。 表达产物对小麦全蚀病、赤霉病、纹枯病病原菌显示出较好的抑菌活性。 本研究结果将为进一步研究木霉几丁质
酶的应用提供了基础。
关键词:绿色木霉; 几丁质酶基因; 基因克隆; 原核表达
Cloning,prokaryotic expression and activity assay of chitinase (Tvchi) from Tri-
choderma viride 　 YANG Li-rong1, SUN Hu1, LEI Zhen-sheng2, ZHAO Xian-lin2, QUAN Xin1,
XUE Bao-guo1 　 ( 1Plant Protection Institute, Henan Academy of Agricultural Science, Henan Key Laboratory for Control of
Crop Diseases and Insect Pests, IPM Key Laboratory in Southern Part of North China for Ministry of Agriculture, Zhengzhou
450002, China; 2Research Centre for Wheat, Henan Academy of Agricultural Science, Zhengzhou 450002, China)
Abstract: The cDNA of chitinase Tvchi gene was isolated from Trichoderma viride by using RT-PCR. Se-
quence analysis showed that the ORF of Tvchi was 1 293 bp in size and encoding 430 amino acid residues .
The Blast showed that the Tvchi had high nucleotide sequences homology with other Trichoderma spp. Tvchi
was further ligated with pET-28a vector and then transformed into Escherichia coli BL21 (DE3) . SDS-PAGE
and Western-blot results revealed that Tvchi was expressed a 47 kD recombinant protein in E. coli. The imida-
zole at the concentration of 100 mmol·L -1 could efficiently elute higher and purer purified protein. Affinity
purification by Ni-NTA, high quality fusion protein was obtained. The optimum temperature and pH for reac-
tion of the enzyme were 37℃ and 6. 8, respectively. Analysis of antibacterial activity revealed that the expres-
sion products displayed better inhibiting ability on Fusarium graminearum Schw, Rhizotonia cerealis vander
Hoeven and Gaeumannomyces graminis var. tritici Walker. The result applies a base for further research on
chitinase Tvchi gene from T. viride.
Key words: Trichoderma viride; chitinase gene; gene cloning; prokaryotic expression
中图分类号: S432. 1　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)02-0139-07
　
植物病理学报 42 卷
　 　 自 1921 年发现真细菌和放线菌在含有几丁质
的琼脂上可形成透明圈[1],从而证明这些培养物
内有水溶性的几丁质酶存在以来,人们从未间断对
几丁质酶的研究,从多种微生物(细菌、放线菌、真
菌)中分离和克隆了几丁质酶,并对微生物源几丁
质酶的理化特性及生物学性状进行了大量研
究[2 ~ 5]。 几丁质酶生产菌对真菌具有拮抗作用,在
离体情况下也能抑制真菌的生长,且与其他细胞壁
降解酶、植物病程相关蛋白(PR)、杀菌剂、生防因
子具有协同增效作用[6],因此几丁质酶应用于生
物防治受到人们广泛的关注。
木霉菌(Trichoderma spp. )属于半知菌类的常
见土壤丝孢菌,广泛存在于土壤、根围、叶围、种子
和球茎等生态环境中,且可应用于植物病害生物防
治。 木霉菌能够分泌产生细胞壁降解酶类,其中几
丁质酶尤为重要,而且不同种类的几丁质酶表现出
对作用底物和病原微生物拮抗活性的特异性。
Lorito等[6 ~ 8]研究表明,木霉几丁质酶的生物防治
效果要比植物、细菌和其他真菌的几丁质酶好。 最
初从哈茨木霉菌株发现分子量分别为 42、37 和 33
kD 的 3 种内切几丁质酶[5]。 后来有学者确定了哈
茨木霉 P1 菌株的 5 个几丁质酶基因 Chi18-2、
Chi18-3、Chi18-4、 Chi18-10 和 Chi18-13[9]。 其中
ech42 是第一个被克隆的几丁质酶基因,该基因是
目前进行遗传和转化研究的常用材料[10 ~ 14]。
笔者所在研究室从河南省不同小麦产区采集
和分离获得 12 株木霉分离物,经小麦全蚀(Gaeu-
mannomyces graminis var. tritici)、纹枯病(Rhizoc-
tonia cerealis Vander Hoeven)及赤霉病菌(Fusari-
um graminearum)室内对峙试验,筛选获得 1 株对
3 种病原真菌均具有良好抑制效果的木霉 ZBS-
6[15]菌株,经形态分类学及 ITS序列分析鉴定为绿
色木霉(T. viride),已应用于田间小麦全蚀病防治
试验。 但目前对木霉及其几丁质酶基因的认识还
很有限,制约了其在生物防治中的应用。 而大量的
基因组数据给研究提供了几丁质酶的信息,寻找具
有重要生物学功能的几丁质酶基因可为生物技术
和基因工程提供重要的基因资源。 针对木霉几丁
质酶基因的研究现状,本研究选取 ZBS-6 为研究
对象,克隆和原核表达分析了几丁质酶 Tvchi 基
因,以期为木霉抗病基因及抗病机制的分子机理及
作物病害生物防治提供新思路。
1　 材料与方法
1. 1　 试验材料
绿木霉(T. viride)ZBS-6 、大肠杆菌 JM109、
BL21(DE3 )、小麦全蚀病菌 (G. graminis var.
tritici)、纹枯病菌(R. cerealis Vander Hoeven)及赤
霉病菌(F. graminearum)、载体 pET-28a均由本实
验室保存;pMD 19T-vector购自 TaKaRa公司;
T4DNA连接酶、限制性内切酶 BamHⅠ、Xho
Ⅰ、反转录试剂盒、蛋白质分子量标准购自 TaKaRa
公司;凝胶回收试剂盒和质粒小量快速抽提试剂盒
购自 U-gene 公司; CTAB、X-gal、IPTG、卡那霉素
(Kan)、丙烯酰胺十二烷基磺酸钠、甘氨酸等均购
自上海生工生物技术有限公司;其他常用化学试剂
为国产或进口分析纯。
1. 2　 Tvchi基因的克隆和序列测定
1. 2. 1　 引物设计　 根据 GenBank 中已经登录的其
他木霉的 CHI-42 基因序列设计并合成引物。 上游
引 物 TVchi-F: 5′-GGATCCATGTTGAGCTTC-
CTCGGCAAAT-3′;下 游 引 物 TVchi-R: 5′-CTC-
GAGTTAGTTGAGACCCTTCCTGATGT-3′,分别引
入了 BamHⅠ和 XhoⅠ酶切位点(以下划线表示)。 以
上引物由上海生工生物技术有限公司合成。
1. 2. 2　 Tvchi基因的获得　 总 RNA的提取与反转
录:以 RNAisoTM Plus 说明书方法提取的绿木霉
ZBS-6 总 RNA。 反转录按 PrimeScriptTM RT-PCR
Kit说明书方法获得 ZBS-6 全长 cDNA。 PCR扩增
Tvchi基因体系(25 μL):2. 5 μL10 × buffer(Mg2 +
free),2. 5 μL MgCl2 (25 mmol·L -1 ),0. 4 μL
dNTP(10 mmol·L -1 ),上下游引物(10 μmol·
L -1)各 1 μL,0. 2 μL Taq 聚合酶,6 μL 模板 cD-
NA(10 ng·μL -1),11. 4 μL ddH2O。 扩增条件:
94℃ 3 min;94℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃ 1 min,
30 个循环,72℃ 10 min;10℃保存。 PCR 结束后,
经 1%琼脂糖电泳,利用 DNA 凝胶回收试剂盒回
收目的 DNA片段。
1. 2. 3 　 PCR 产物的克隆与序列分析 　 将纯化后
的 PCR产物与 pMD19-T vector 连接,转化大肠杆
菌 JM109,再将成功的阳性克隆样品送至上海生工
生物工程有限公司进行 DNA 序列测定。 蛋白的
结构域、翻译后修饰的预测采用网上搜索工具
041
　
　 2 期 　 　 杨丽荣,等:绿色木霉几丁质酶基因 Tvchi cDNA的克隆、原核表达与活性分析
MotfScan (http: / / www. expasy. org / tools)。 利用
网站 http: / / genome. cbs. dtu . dk / services / Sig-
nalP-3． 0 / . 进行信号序列的预测。 同源蛋白的搜
索用 BLASTP ( http: / / blast. ncbi. nlm. nih. gov /
Blasp)工具进行。
1. 3　 Tvchi基因原核表达载体的构建
将重组的 pMD19-T / Tvchi 经 37℃、2 h BamH
Ⅰ和 XhoⅠ双酶切后,回收 1 200 bp 左右的片段,
与经同样酶切的原核表达载体 pET-28a 连接,在
T4 连接酶的作用下于 16℃恒温过夜。 转化大肠
杆菌 JM109,37℃、180 r / min 过夜培养,提取重组
质粒 pET-28a / Tvchi DNA,BamHⅠ和 XhoⅠ酶切
鉴定。
1. 4　 Tvchi基因的诱导表达与蛋白纯化
经酶切鉴定的 pET-28a / Tvchi 质粒转化大肠
杆菌 BL21(DE3)感受态细胞,挑取正确的转化子
克隆,具体步骤参照 Yang等[16]的方法进行。
1. 5　 Western印迹分析
Western 印迹分析参照 Sambrook 等的方
法[17],将蛋白从 SDS-PAGE 胶上转移到 PVDF 膜
上,以(谷胱甘肽巯基转移酶)单克隆抗体(表型:
小鼠的 IgG2a; 稀释度为 1∶ 2 000)作为一抗,以碱
性磷酸酶标记的小鼠 IgG(稀释度为1∶ 2 000)作为
二抗,用 DAB作为显色反应的底物。
1. 6　 表达产物的酶学特性分析
1. 6. 1　 几丁质酶最适温度和 pH 值的确定　 胶体
几丁质的制备按 Hsu &Lockwood 的方法[18]进行。
用 DNS还原糖法检测几丁质酶活性。 以胶态几丁
质为作用底物, 在 40℃反应 30 min, 测定 OD530值
并计算还原糖含量。 配制不同 pH 值(5. 8、6. 0、
6． 2、6. 4、6. 6、6. 8、7. 0、7. 2、7. 4、7. 6、7. 8、8. 0)的
磷酸盐缓冲液,求出反应体系中影响几丁质酶活力
的最适 pH值。 测定 pH 为 8. 0 时,以不同反应温
度 20、25、30、32、35、37、38、39、42 和 45℃测定温度
对表达产物活力的影响,从而确定最适温度。 设 3
次重复。
1. 6. 2　 抑菌活性　 取上述 1. 5 中超声破碎后的上
清液,经浓缩后用琼脂糖扩散法检测裂解液活性,
具体步骤参照 Yang等的方法[16]进行。
2　 结果与分析
2. 1　 Tvchi基因的克隆与序列分析
如图(图 1-A)所示,木霉 RNA 提取可见 3 条
带,获得了高纯度的 ZBS-6 RNA,为进一步的基因
扩增等提供了保障,以其 cDNA 为模板进行 PCR
扩增后,琼脂糖凝胶电泳分析,得到 1 300 bp 左右
的特异性 PCR 条带 (图 1-B)。 将目的片段与
pMD19-T载体酶连接,用氯化钙法转化大肠杆菌
JM109,并在带有 Ampicilin、X-gal、IPTG 的 LB 平
板上根据蓝白斑筛选阳性重组子,用 BamHⅠ和
XhoⅠ双酶切鉴定重组克隆,结果显示质粒被切为
约 2. 7 kb载体片段和 1. 3 kb 左右插入片段(图 1-
C),显示已得到插入目的片段的阳性克隆。 Tvchi
序列测定结果表明,其开放阅读框全长为 1 293 bp,
Fig. 1　 Agarose gel electrophoresis map for cloning of Tvchi gene
A:ZBS-6 of tal RNA; B: PCR product; C:Recombinant plasmid pMD19-T / Tvchi;
M1: DNA Marker DL10 000; Lane 1-2: ZBS-6 of tal RNA; M2: DNA Marker DL2000; Lane 3: PCR product;
Lane 4-5: Recombinant plasmid pMD19-T / Tvchi;M3: DNA Marker DL15000.
141
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 2　 Signal peptide sequence analysis of amino acid sequence encoded by Tvchi gene
编码 430 个氨基酸残基,有其起始密码子 ATG 和
终止密码子 TAA。 Blast 分析结果表明该基因同
NCBI 上已知的绿色木霉 ( T. viride) ech1 基因
(AF397020. 1)有高度的同源性,同源性在 98%以
上。 与哈茨木霉(T. harzianum,U49455. 1)同源性在
90% ,与钩状木霉(T. hamatum,AB041754. 1)同源
性在 93% 。 该基因编码氨基酸序列的基本特征分
析显示:Tvchi所预测的蛋白质分子量为 46. 7 kD,
等电点为 5. 90,氨基酸组成中带正电荷氨基酸
(Arg、Lys) 37 个,占 8. 7% ,带负电荷氨基酸
(Asp、Glu)41 个,占 9. 5% ,疏水性氨基酸 189 个,
占 44. 06% ,亲水性氨基酸 162 个,占 37. 76% 。
其氨基酸序列第 39 ~ 390 处存在甘氨酸水解酶 18
家族典型的活性位点,在 164 ~ 172 位点具有典型
的 Chi18 家族的蛋白基序 FDGIDVDWE,说明本次
获得的绿木霉 Tvchi基因属于第 18 家族的几丁质
酶。 信号肽分析表明其前 22 个氨基酸为信号肽序
列。 以上结果显示该基因具有典型的 Chi 基因的
特征,说明本试验已经成功克隆到几丁质酶基因,
本研究命名为 Tvchi基因。
2. 2　 Tvchi基因的原核表达载体构建与诱导表达
pMD19-T-Tvchi 经 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切,
连接到同样由 BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切的 pET-28a
载体上,构建了 pET-28a / Tvchi 表达载体,酶切结
果表明本试验得到了 Tvchi 基因的原核表达载体
pET-28a / Tvchi (图 3)。 将该质粒经制备大肠杆菌
感受态细胞转化到 BL21(DE3)菌株中,经 1 mmol
的 IPTG 诱导和 SDS-PAGE 分离,含有 pET-28a /
Tvchi载体的样品显示出大约为 47 kD 的蛋白条
带,Western 印迹分析 pET-28a / Tvchi 原核表达载
体,检测到约 47 kD的 Tvchi-His融合外源蛋白,与
预测的融合蛋白分子量大小相符,而含 pET-28a的
工程菌和 BL21(DE3) (阴性对照)经 IPTG 诱导
表达无相应表达的条带,说明 Tvchi 基因得到正确
的表达(图 4)。
Fig. 3 　 Identification of recombinant plasmid
pET-28a / Tvchi by digestion(BamHⅠ、
XhoⅠ)
M: DNA Marker DL10000; 1-2: Recombinant plasmid pET-
28a / Tvchi.
241
　
　 2 期 　 　 杨丽荣,等:绿色木霉几丁质酶基因 Tvchi cDNA的克隆、原核表达与活性分析
Fig. 4 　 Western and SDS-PAGE analysis for
the expression of Tvchi gene
1: Escherichia coli BL21; 2: Expressed product of pET-28a;
3:Expressed product of pET-28a / Chi; 4: Purified pET-28a /
Chi; 5: Expressed product of pET-28a ; 6: E. coli BL21; 7:
Expressed product of pET-28a / Chi; M: Molecular weight
standard protein marker.
2. 3　 表达产物的纯化与抑菌活性分析
细胞裂解液上清经 Ni2 +2 琼脂糖层析树脂
柱,浓度为 100 mmol·L -1咪唑洗脱缓冲液时获得
较高浓度和纯度的纯化蛋白(图 4)。 测定所纯化的
表达产物的浓度为 0. 459 mg·mL -1。 其 80、100
和 150 mmol·L -1咪唑洗脱缓冲液对赤霉病、纹枯
病和全蚀病菌具有明显的抑菌活性(图 5-A、B、C)。
2. 4　 表达产物的酶学活性分析
经盐析处理 IPTG诱导培养 12 h 的 pET-28a /
TvChi质粒表达产物后, 测定不同反应温度对几
丁质酶活性的影响。 结果表明,几丁质酶的最适活
性温度为 37℃,从 20 ~ 37℃酶活迅速升高,在
37℃时达到最高,相对酶活力达 94. 5% (图 6-B),
随着温度不断提高,酶活迅速下降。 不同 pH 值对
几丁质酶的活性影响较大,通过对不同 pH 值条件
下几丁质酶活性的检测,最适 PH值为 6. 8,相对酶
活可达 91. 2% (图 6-A),适于在微酸和微碱性条
件下作用,当 pH 值到 8 时,酶的活性迅速下降,说
明该酶在强碱条件下失火,不利于发挥作用。
Fig. 5　 Antibacterial activities of expression products of TvChi
A: Fusarium graminearum; B: Rhizotonia cerealis vander Hoeven; C:Gaeumahnomyces graminis var. tritici;
1:Sterile water; 2: Concent rated soluble fractions from inducedpET-28a;
3:Concent rated soluble fractions from induced BL21 cells;
4:Culture supernatants from induced pET-28a / TvChi cells;
5: Purification protein of imidazole at the concentration of 80 mmol·L -1;
6:Purification protein of imidazole at the concentration of 100 mmol·L -1;
B-7: Purification protein of imidazole at the concentration of 150 mmol·L -1;
A-7,C-7,B-8: Sterile culture medium.
341
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 6　 The optimum pH (A) and temperature (B) for expressed product of Tvchi
3　 讨论
木霉生防机制主要有重寄生、竞争作用和抗生
作用,其中重寄生作用是拮抗作用的一种主要形
式,通过自身产生的真菌细胞壁降解酶如几丁质
酶、葡聚糖酶等溶解宿主真菌细胞壁并渗透进入其
细胞中,使病原真菌生长受抑制而死亡[18]。 随着
生物技术的发展,学者已将克隆的几丁质酶基因应
用于棉花[19]、玉米[20]、烟草[21]等许多植物抗病基
因工程中,使植物获得广谱的抗病性。 本试验中绿
色木霉 ZBS-6 Tvchi 基因的获得,对于明确 ZBS-6
的抑菌分子机理以及进行转基因研究具有重要的
意义。 Tvchi基因具有典型的几丁质酶 18 家族的
特征,且与木霉属 Chi 基因具有较高的同源性,有
其信号肽区、催化活性区,暗示着这些氨基酸残基
对维持 Tvchi蛋白的功能起着重要的作用。
木霉几丁质酶主要为内切酶, 且分子量多为
42 kD。 现已从哈茨木霉(T. harzianum) [5,7]、绿色
木霉(T. virida) [13]、棘抱木霉(T. asperellu) [14]、钩
状木霉 ( T. hamatum) [10 ~ 12]和粘帚绿木霉 ( T. vi-
rens) [22]分离或克隆了几丁质酶基因,最初从哈茨
木霉菌株中发现分子量分别为 42、37、33 kD 的 3
种内切几丁质酶,ech42 是研究最多的几丁质酶。
但多数只是克隆了基因,再根据核昔酸序列推出前
体蛋白的氨基酸序列,缺乏酶特性数据[22]。 大肠
杆菌表达系统与酵母等真核表达系统相比具有发
酵方式能够快速、高效地合成基因产物的特点,有
较丰富的理论指导意义。 本试验中构建了 Tvchi
原核表达载体,成功地获得了 47 kD左右的包涵体
表达蛋白,通过咪唑洗脱、复性获得了具有活性的
表达产物,不需其他表达系统复杂过程,为后续活
性检测以及 Tvchi功能域研究提供了简便的方法。
蛋白分子量与推测的 46. 7 kD差不多,但与前人报
道的 42 kD大了 5 kD左右,结合载体 pET-28 上的
表达序列综合分析基本与实际大小一致。 新近的
报道[13]显示绿木霉 UKM-1 菌株 430 个氨基酸残
基的几丁质酶在大肠杆菌中 20℃、4 h时获得了 42
kD的高活性表达,并在 30 ~ 50℃和 pH3-7 具有稳
定的活性,我们也试图在 25℃以下进行表达,但没
有检测到 Chi蛋白,且稳定性也与我们本次试验结
果不尽相同,本试验中原核表达的 Tvchi 在 20 ~
37℃酶活迅速升高, 在 37℃时达到最高, 在 pH6
~ 8 时具有较高的酶活活性,最适 pH 值为 6. 8。
这也许是由于表达条件所限制,包涵体处理过程中
影响到了酶的活性。 Tvchi外源表达策略有待于进
一步改善,以期为提高生防菌抑菌作用和小麦转基
因技术提供重要的科学依据。
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责任编辑:曾晓葳
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