全 文 ：书西北植物学报!
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收稿日期$!"#$)"%)%#
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基金项目$国家自然科学基金" %#%,##$"%,$! %##+#,, #& 1$&
计划"
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作者简介$田跃辉" #1&&( #!男!在读硕士研究生!主要从事玉米耐低磷机制方面的研究 4)56.7$
8
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"
通信作者$高世斌!博士!教授!博士生导师!主要从事玉米遗传育种及抗逆性分子生物学的研究 4)56.7$
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玉米
1234,$基因家族克隆 及其低磷胁迫下的表达 田跃辉!吴 ! 玲!刘 ! 丹!张素芝!聂 ! 治!张 ! 啸!苏顺宗!罗博文!高世斌" "四川农业大学 玉米研究所!成都 ,###%" # 摘 ! 要$
!"#!
"编码一个泛素结合酶
4!
#作为磷高亲和转运体
ABC#
的负调控子!在维持植物体内磷的动态平衡
中发挥重要作用该研究以拟南芥和水稻中的
!"#!
为基础!从玉米自交系
D+%
基因组中鉴定出
1
个
$%!"#! 基因家族成员!在系统进化关系上将其分为 % 类在玉米自交系 #+& 中克隆了上述 1 个基因的 EFG 全长序列!保 守结构域分析发现! 35ABH! 蛋白质序列中均有 # 个由约 #%" 个氨基酸组成的泛素结合酶 4! 催化结构域" ID) E= #!其中包含 # 个重要的保守氨基酸"半胱氨酸#实时荧光定量结果表明!低磷胁迫处理后!所有$%!"#!
基因
均有表达!并呈现不同的表达模式!主要表现为叶与根之间的组织差异和玉米自交系
#+&
与
1+&!
之间的基因型差
异!而在同一组织多数基因间的表达差异不明显其中!
$%!"#! & "! 在自交系 1+&! 的根中持续下调表达!但在 叶中持续上调表达!表明$%!"#!
&
"!
可能参与调控磷素在叶与根之间的运输!以维持地上部分和地下部分磷的
平衡
关键词$玉米&$%!"#!
基因家族&低磷胁迫&定量分析
中图分类号$J+&1 文献标志码$
K
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(
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4
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[
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!!
磷是植物体内核酸(磷脂和
KCA
的重要组成
成分!并作为植物体内能量转移物质!能够活化体内
蛋白质!调控植物体整个代谢过程)#*植物主要以
无机磷"
A.
#的形式吸收土壤中磷素土壤对磷的强
烈吸附使土壤溶液中植物可吸收的可溶性无机磷含
量非常低!通常小于
#"
"
5>7
%
P
因此!土壤有效磷
的供应状况和植物对磷素营养的吸收能力便成为植
物生长发育的决定因素之一)!*在低磷条件下!植
物会通过自身对低磷胁迫信号通路作出应答!从而
介导根系对介质中磷的吸收!以及磷在细胞(组织和
器官中的转运!以维持植株体内磷素稳定与平衡)%*
通过对模式植物磷利用相关转录因子
!"6#
(
!"#!
和
!"7#
等功能的研究!对植物磷信号途径
及分子机制有了更多的认识)$*其中! !"#! ( %*8 9,6:&%11 " %*6%11 #家族和 &/;!< % &/$
家族构成
的信号通路在磷的吸收(转运中发挥着重要作用
F:7;6.Q:
等)*从拟南芥中鉴定出了突变体
-
0,!
!与
野生型相比!
-
0,!
根系中的磷没有变化!但叶片中
磷含量增加
!
#
$倍!茎杆(花序和种子中磷含量也 有所增加功能分析表明该基因产物是一个 4! 泛 素结合酶" IDE #在低磷处理的 - 0# 拟南芥突变 体中证实了 %*6%11 和 !"#! 是在磷信号通路 !"6# 的下游),*与野生型相比! - 0# 突变体和过 表达的 &/!"6# ( #.!"6! 也会导致叶中磷含量积 累!与 %*6%11 的过表达植株或是 - 0,! 突变体植株 类似)+)&*进一步研究表明 &/!"#! 上游存在重要 调控因子 %*9,6:&%11. " %*6%11. #!且两者共存于 维管束中)1*低磷处理下! %*6%11 上调表达!而 &/!"#! 基因下调表达!同时!在转基因植株中过 表达 %*6%11 !增强了磷的吸收和从根到叶中的转 运!而从叶向根的运输被抑制!使磷元素在叶中大量 积累!从而导致磷中毒的现象!与 - 0,! 突变体表型 一致)#")##*在 &/!"#! 的 ^)ICU 区域包括有 个约有 !# 个核苷酸基序可以和拟南芥 %*6%11. 互 补!其中! %*6%11 = 对 &/!"#! 的抑制作用比 %*6%11) ( %*6%119 更明显)#!*此外! &/!"#! 在 根中的表达受到叶中磷稳态和韧皮部中 %*6%11 的 迁移系统调控)#%)#$*同时有研究表明!在低磷条件
下!由于上调
%*6%11
抑制了
!"#!
表达!
!"##
下调表达得到缓解!并且突变体
-
0,!
中
!"##
表
达量明显上调烟草叶片中的瞬时表达系统表明了
ABH#
和
ABH!
蛋白在内质网膜上有生理水平上
的相互作用同时酵母双杂交系统进一步证实了
ABH!
介导的
ABH#
降解过程中!
ABH#
的
M
末端
起作用)#*
目前在拟南芥和水稻中对
!"#!
相关基因功能
有了较深认识!但对玉米中该基因克隆和组织特异性
表达及胁迫应答模式仍不清楚本研究首先选用拟
南芥和水稻中
!"#!
基因氨基酸序列在玉米
D+%
氨基酸序列库中进行本地化
D76/<
[
同源搜索!并将
得到的氨基酸序列使用
AZ65
进行结构域分析!最
终获得
$%!"#! & # ($%!"#!
&
!
以及
$%!"#! & "# 等 1 个家族成员通过同源克隆方法!在自交 系 #+& 中得到$%!"#!
基因家族
EFG
全长序列!
并通过实时荧光定量
AEU
方法检测其在
5UMK
水
平上的时空表达特征!以初步探索它们在低磷胁迫
下的表达变化规律!为深入探究玉米
$%!"#! 基 因在磷转运下游信号通路中的作用奠定基础!进而 为玉米磷高效育种提供理论依据和技术支撑 # ! 材料和方法 B*B ! 实验材料及处理 实验材料为玉米自交系 #+& 和 1+&! !由四川农 业大学玉米研究所提供)#,*在三叶一心期选取整 齐一致幼苗移进 B>6 @ 760X 全素营养液)#+*!适应性 培养 !X !再设置低磷" # " 5>7 % P #和正常磷" # 55>7 % P # ! 个供磷水平分别进行培养!每 !X 换 # 次 营养液每天光照 #!; !通气 #!; !温度保持在 ! _ # !&_ 分别在正常磷浓度"对照#处理 "; !低 磷处理 , ( #! ( !$
(
$& ( +! 和 1,; 时!取玉米自交系 #+& 和 1+&! 幼苗根系和叶片约 "* @ " % 株混合取 样#!液氮研磨成粉末!用 CV.Q>7 试剂完全溶解!并 于 (+"_ 保存备用 BC$
!
总
DE?
提取及
@FE?
合成
UMK
操作中的各种溶液均采用
UMK6/:ZV::
S6<:V
配制用
CV.Q>7
法提取不同处理自交系叶和
根的总
UMK
!用适量
UM6/:)ZV::
的
XXB
!
H
溶解
UMK
!取
!
"
P
充分溶解的总
UMK
!稀释
#"
倍后!
##
&
期
!!!!!!!!!!!
田跃辉!等$玉米$%!"#!
基因家族克隆及其低磷胁迫下的表达
M60>FV>
[
MF)!"""
超微量核酸蛋白测定仪检测其
浓度和纯度凝胶成像系统照相鉴定
UMK
完整
性!然后按照宝生物公司"
C6` 6U6
#试剂盒
AV.5:)
G=V.
[
<
$
UCV:6
@
:0< .`<
"
A:VZ:=#中的反
转录反应试剂 "
C6` 6U6E>X:
$FUU"%+G #将总 UMK 反转录成 =FMK !于 (!"_ 冰箱保存备用 BCG ! 玉米 1234,$
基因家族的鉴定
以拟南芥和水稻
!"#!
基因"
K@
%%++"
和
PHE
+
H/"
@
$&%1" #的氨基酸序列为模板!通过本地 化 D76/< [ 程序在玉米 D+% 的蛋白质数据库中进行 同源搜索!筛选出玉米基因组中$%!"#!
候选基
因)#&*将所得到的候选氨基酸序列在保守结构域
AZ65
数据库中进行比对!筛选出
$%!"#! 基因家 族的其余成员!并从 D+% 基因组数据库中获得候选 基因的序列信息通过在线工具 E>5 [ 9<: [ L % TS " ;<< [$%%
S:?*:]
[
6/
8
*>V
@
%
=>5
[
9<:
+
[
.
%#分析蛋白
质的分子量和等电点通过
E79/<67R
和
T42K
*"
在玉米(拟南芥(水稻和大豆等
!"#!
基因的氨
基酸序列中采用邻接法"
M:.
@
;?>V)a>.0.0
@
!
Ma
#进
行系统进化树分析!并用
FMKTKM
进行该家族氨
基酸序列的多重比对分析
BCH
!
1234,$基因克隆 根据上述获得基因的 =FMK 和 EFG 序列信息! 用 AV.5:V 设计 AEU 引物"表 # #!以玉米自交系 #+& 的 =FMK 为模板进行 AEU 扩增!扩增程序为 1$
_
预变性
%5.0
&
1$_%"/
!
%_
#
&_%"/
!
+!
_#
#
%5.0
!
%!
个循环&最后
+!_
延伸
#"5.0
!获
得完整的
EFG
全长序列
AEU
产物经凝胶回收后
连接至
[
TF#1)C
载体"
C6` 6U6
!大连#!送
L0W.)
@
:0
测序
BCI
!
1234,$家族成员在低磷胁迫下的表达分析 根据测序结果!用 D:6=>0F:/. @ 0:V 设计荧光定 量 AEU 引物"表 ! #!以不同时间低磷胁迫处理的 =FMK 作为 Y UC)AEU 模板!以玉米 >&!?" 为内 参对照!采用 G/>b6/<4W62V::0G9 [ :V5.] " DLH) UKF #!利用 D.>)U6XEbR1, 实时荧光定量 AEU 仪 进行实时荧光检测反应程序为 1_%"/ & 1_ / ! @ 5 !_ # &_%"/ !$"
个循环采用
!
(
%%
E<
进行数据的相对定量分析!每个处理的时间段和对
照时间段的样品均设
%
个重复
表
B
!
1234,$基因全长扩增引物序列 C6?7:# ! AV.5:V/9/:XZ>V=7>0.0 @ >Z$%!"#!
@
:0:/
基因名称
2:0:065:
正向引物
b>VS6VX
[
V.5:V
反向引物
U:W:V/:
[
V.5:V
退火温度
@
5
%
_
$%!"#! & # KC22KCCC2CCCKEKKCC2KECE CCKEE22CE2EC22C2K$*,
$%!"#! & ! KC2KKC2K22KKEKCKEKKC EKKKEKE2C2KCCCC2CEC %*!$%!"#!
&
"# KC22ECECEKK2KK2CC2E CEKKEKE2KCCCEKE2ECK %*%!"#!
&
"! KC2CCEC22EK222CKEK CEK2ECCCEC2CKKE22CC *%!"#!
&
"% KC22K22KC2KCC2C2KC2K CEK22E22EC2EK22CCC *%!"#!
&
"$KC22E2KEEE2E2EECE CCKEK2EECEKKE2C22C2C$*"
$%!"#! & " KC2K2CCKEECEC2E2E2 CCKEK2EECEKKC2C22C2$*,
$%!"#! & ", KC22KKK2CECKEEKKKC2 CEK2ECECECECKKE222 %*!$%!"#!
&
"+ KC22KEKEE2K2CKEE2E CEK22C2EEC2EK22CC2 $*" 表$
!
1234,$基因荧光定量引物序列 C6?7:! ! JUC)AEU [ V.5:V/9/:XZ>V$%!"#!
@
:0:/
基因名称
2:0:065:
正向引物
b>VS6VX
[
V.5:V
反向引物
U:W:V/:
[
V.5:V
退火温度
@
5
%
_
$%!"#! & # KEC22K2E2KKEK2CKKKC C2KEEC2KCKKE2KEECE$*"
$%!"#! & ! C2CCECC2K2KCCKEEKE 22CEEEK2CKCKC2KECE$*"
$%!"#! & "# 2ECEECEC2C2KKC2CE CCEECC2ECEC2CEECC %*,$%!"#!
&
"! C2KK2CEKECK2K2KCK KC2CKKE2KKCKK2K22 %*,
$%!"#! & "% E2KC2K2KK2CC2KK2KK2 EEKEEKK2KEEK2CCKC %*,$%!"#!
&
"$CC222E2CCCK222KEKE KEKK2EC2KK2EC2K22KE2$*&
$%!"#! & " EKK2KKCKK2EKKKEC2C K2CEKCEK2KKCK2CC2C %*,$%!"#!
&
", 2EKCKEEC2K2KKCK2EK KCK2EKCEE2K2CCC2KE !*"
$%!"#! & "+ 2EK22ECEKCCC2KCKEC 22CEECCECCEKKECCECE ,*, >&!?" "内参# KECCE22EKCC2CC2K22 KK2CE22CK2KKKEEK2KC ,*" ,## 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! %$
卷
!!
结果与分析
$CB ! 1234,$
基因家族及其序列特征分析
通过同源比对和氨基酸序列的分析!在玉米
D+%
的基因组序列中鉴定出
!
个
!"#!
基因!分别
命名为
$%!"#! & # "序列号 2UT3T!2%&#+"1 #和$%!"#!
&
!
"序列号
2UT3T!2$,$+!
#!并通过
在结构域
AZ65
数据库中比对鉴定出其余
+
个
$%8 !"#! 基因家族成员!分别命名为$%!"#!
&
"#
#
$%!"#! & "+ 对其蛋白质序列进行分析!得到相 应的氨基酸数目(等电点和分子量"表 % #经保守 结构域分析发现!该基因家族的氨基酸序列中存在 # 个泛素结合酶 4! 的催化结构域 IDE= "图 # #!其 中!半胱氨酸是重要保守氨基酸!为泛素结合酶复合 表 G ! 玉米自交系 JKG 中 1234,$
基因家族成员的蛋白特征
C6?7:%
!
AV><:.0=;6V6=<:V./<.=/>Z$%!"#! @ :0:Z65.7 8 5:5?:V/ZV>556.Q:.0?V:X7.0:D+% 序列号 K==://.>0095?:V 基因名称 AV> [ >/:X065: 推测氨基酸 A9<6<.W:65.0>6=.X 长度 P:0 @ <; % 66 分子量 T>7:=976VS:. @ ;< % \F 等电点 [ L 位置 P>=6<.>0 2UT3T!2%&#+"1$%!"#!
&
# &+# 1,*%+ $*++ E;V, 2UT3T!2$,$+!$%!"#!
&
! &+# 1,*%+ $*+$ E;V1
2UT3T!2"#"$,"$%!"#!
&
"# %+% $#*%1 &*%1 E;V% 2UT3T!2"&,&%$%!"#!
&
"! !,+ %&*%, ,*&% E;V%
2UT3T!2#!%#1 $%!"#! & "% %&$ $%*#$*1# E;V%
2UT3T!2"&&$1$%!"#!
&
"$"+ ,*&+ *,# E;V, 2UT3T!2"!+$, $%!"#! & " !" &*%+ *$! E;V&
2UT3T!2"+&%," $%!"#! & ", ##"! #!*!"$* E;V&
2UT3T!2#!!""% $%!"#! & "+$%& $1*,% *#$ E;V&
图
#
!
玉米
$%!"#! 基因家族氨基酸序列比对 图中横线部分为 IDE= 保守功能域!星号处为各序列中的催化位点 b. @ *# ! K7. @ 05:0<>Z65.0>6=.X/: Y 9:0=:/>Z$%!"#!
@
:0:Z65.7
8
.056.Q:
C;:=>0/:VW6<.W:Z90=<.>0X>56.0IDE=./90X:V7.0:X
!
60X<;:6/<:V./\.0X.=6<:/<;:=6<67
8
<.=/.<:.0<;:/:/:
Y
9:0=:/
+##
&
期
!!!!!!!!!!!
田跃辉!等$玉米$%!"#!
基因家族克隆及其低磷胁迫下的表达
体的形成起到重要的活化作用将玉米
ABH!
与
拟南芥(水稻(大豆等植物的
ABH!
进行比对!并用
邻接法"
M:.
@
;?>V)a>.0.0
@
!
Ma
#构建系统发育树"图
!
#从图中可以看出!该家族主要分为
%
个类群!其
中
35ABH!
&
#
(
35ABH!
&
!
聚为一个类群!且与水
稻(大麦和短柄草的
ABH!
亲缘关系最近!
35)
ABH!
&
B!
和
35ABH!
&
B,
聚在第二分支!与拟南
芥
ABH!
进化距离较近!其余则聚为第三类群
$C$
!
1234,$基因克隆及突变位点分析 利用设计的$%!"#!
基因的
1
对引物!以自
交系
#+&
苗期的
=FMK
为模板进行
AEU
扩增!产物
大小和预期相符!并通过
FMK/<6V
和
FMKTKM
对
测序结果进行分析结果表明!
$%!"#! 基因序列 在自交系 #+& 和 D+% 间存在碱基突变!并导致$%8
!"#!
&
"#
(
$%!"#! & "$
和
$%!"#! & ", 的氨 基酸序列发生变化"表$
#其中!在
35ABH!
&
B#
氨基酸序列的
IDE=
保守结构域内酪氨酸突变为半
胱氨酸!而半胱氨酸在泛素结合酶复合体形成中起
到非常关键的活化作用!这一变化是否与磷转运调
控有关值得进一步研究
$CG ! 1234,$
家族成员的不同组织表达分析
为进一步分析
$%!"#! 基因在玉米中的表达 模式!选用 ! 种玉米基因型自交系材料 #+& 和 1+&! 为研究对象荧光定量结果表明!$%!"#!
基因家
族成员在低磷胁迫处理下均有表达!且呈现不同的
表达模式!主要表现在不同基因型之间(叶与根组织
之间的显著差异"图
%
#低磷胁迫处理下!
$%8 !"#! 基因在自交系 #+& 根和叶中上调表达的 时段比自交系 1+&! 上调表达的时段多!其中!尤以$%!"#!
&
"!
和
$%!"#! & "$
最为明显此外!
图
!
!
不同植物
!"#!
基因氨基酸序列的进化树分析
图中分支点的数字表示
D>>[
验证中基于
#"""
次重复该节点
可信度的百分比&标尺代表遗传距离&选用的
ABH!
蛋白序列
分别为拟南芥
ABH!
"
KC!2%%++"
#(水稻
ABH!
"
H/"
@
$&%1" #( 大豆 ABH! " 27 8 56#% @ %#!1" #(本氏烟 ABH! " 4I%+&1! #( 大麦 ABH! " 2J&,##$
#和短柄草
ABH!
"
DV6X.!
@
#,1,"
#
b.
@
*!
!
A;
8
7>
@
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8
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和
1,;
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$%!"#! 基因在自交系 1+&! 的不同组织间的表达 差异不大!且多数基因在叶或根中为下调表达而 在自交系 #+& 中!$%!"#!
基因在叶和根中呈现相
反的表达规律其中!在低磷胁迫
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和
$%!"#! & " 仍 表现为下调外!其余 + 个基因均上调表达 综上!自交系 1+&! 根和叶中下调时段居多!初 步推测低磷胁迫下!根中吸收磷的能力增强而叶中 向下运输磷的能力减弱!有利于磷在叶中的积累 在低磷胁迫 !$
和
1,;
!自交系
#+&
的叶和根表达规
律相反!可能是应答低磷的关键时间段!在低磷胁迫
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基因在叶中上调表达而根中
下调!从而促进磷在根和叶之间的循环!有利于磷素
在不同组织间的平衡&随着低磷胁迫时间延长至
1,
;
!叶中下调表达而根中上调!则有利于磷在叶中的
积累因此!进一步鉴定
$%!"#! 基因家族成员 应答低磷胁迫的功能和作用!可以加深理解玉米耐 低磷胁迫的分子机制 % ! 讨 ! 论 磷元素是核酸与磷脂的结构组成成分!是物质 代谢和能量代谢的活化中间体!广泛参与植物体内 的信号级联传导和生化合成等代谢过程作为不可 或缺的营养元素对作物产量和种质资源特性的保持 起着重要作用!如何提高磷的利用率已成为一个研 究热点 ABH! 序列含有特定的 # 个泛素结合酶 4! 催化" IDE= #结构域!参与泛素介导的蛋白降解 途径该途径中在保守的半胱氨酸和泛素 E 末端 形成一个硫酯键!并和泛素连接酶 4% 形成复合体! 在细胞内选择性降解蛋白中起到重要作用!同时广 泛参与植物生长发育相关过程)#1*近年来 4! 蛋白 在植物抗逆胁迫相关的功能逐渐被揭示!蛋白的泛 素化在植物低磷胁迫的信号转导中起到重要作 用)!"*在水稻),*和拟南芥)1*中已报道 !"#! 基因 参与调控叶和根间的磷转运!以维持地上部分和地 下部分间磷素的动态平衡因此!分离和鉴定玉米 中的 !"#! 基因家族成员!进一步了解其低磷响应 分子机制!从而为玉米磷高效分子育种提供优良的 候选基因 利用比较基因组学的研究手段!本研究在玉米 基因组中筛选得到 1 个 !"#! 基因家族成员!并从 自交系 #+& 中分离得到所有家族成员的 EFG 全长 序列通过比对分析发现!$%!"#!
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$%!"#! & ", 序列均发生突变并导 致保守结构域氨基酸序列中也发生变化其中!$%!"#!
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酪氨酸变为半胱氨酸!而半胱氨酸在泛素结合酶复
合体形成中起到非常关键的活化作用因此!上述
基因催化结构域
IDE=
内部氨基酸的突变是否会影
响到该蛋白在后续磷转运上的功能!需要进一步对
该基因进行功能验证通过对野生型拟南芥和
-
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突变体根细胞膜内蛋白质组学分析!发现了
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下游受到其负调控的蛋白为
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和
1,;
!自交系
#+&
的根和叶中表达量变化呈现相反的趋势!而自
交系
1+&!
的叶和根中则呈现出了相似的表达特征
这种不同基因型组织间的差异与磷利用效率有一定
的关联!从上述两个低磷处理的时间段分析得到!该
家族基因表达特征利于自交系
#+&
根和叶间磷的平
衡!而在自交系
1+&!
的叶中磷得到一定程度的积
累同时!低磷胁迫
#!;
内!两种自交系的
$%8 !"#! 家族成员在根中总体表现为下调表达!推测 该基因上游存在重要调控因子抑制$%!"#!
基因
的表达!从而有利于积累根部的
ABC#/
等重要的
磷转运蛋白!促进磷的吸收另外!低磷胁迫
1,;
时!在自交系
#+&
叶和根中!
$%!"#! & "# 基因均 为下调表达!且在自交系 1+&! 根和叶中所有时段均 表现为下调!可能被抑制表达的时间比其它基因长! 利于根部磷的吸收和叶中磷的积累值得关注的 是!$%!"#!
&
"!
在自交系
1+&!
的根和叶中表达
模式明显不同!在根中持续下调表达有利于根对磷
的吸收!而在叶中的上调表达促使磷从叶向根的转
运!因此!该基因有可能在维持地上部分和地下部分
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西
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北
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物
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%$卷 磷素的平衡中起到重要作用然而!在植物组织间 的信号转导途径尚待进一步研究!$%!"#!
家族成
员在两种基因型自交系中的表达规律也将为进一步
探索和揭示
!"#!
基因在低磷响应长距离运输机
制中的作用奠定基础
参考文献!
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