全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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+/001+#"""($"!)+!"#$+"#+""%!
收稿日期$
!"#%(#"("*
&修改稿收到日期$
!"#%(#!(#*
基金项目$国家自然科学基金"
%##-""$
#
作者简介$王海霞"
#*,&
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物基因工程研究
2(34/5
$
641
7
84/9/46:4
!
#-%+;<3
"
通信作者$祝建波!博士!研究员!主要从事植物基因工程研究
2(34/5
$
:
.
=08:
!
#!-+;<3
天山雪莲未知蛋白基因的克隆及其耐铝特性分析
王海霞#!张林华#!杨
!
晶#!张亚敏#!张
!
伟#!王爱英!!胡鸢雷%!祝建波!"
"
#
石河子大学 生命科学学院!新疆石河子
*%!""%
&
!
石河子大学 农业生物技术重点实验室!新疆石河子
*%!""%
&
%
北京大学 生
命科学学院!北京
#""*,#
#
摘
!
要$从天山雪莲叶片低温诱导的
;>?@
文库中克隆了一个未知蛋白基因"
!"#!$(*!
#
;>?@
全长序列生物信
息学分析表明
!"#!$(*!
基因共编码
!-!
个氨基酸!具有小麦铝诱导蛋白
A45/,
的保守结构域!属
B1
(
@C
(
"
家族
的可溶性蛋白&其氨基酸序列与蓖麻的茎部特异性表达蛋白相似性最高为
-"+*D
&进化树分析显示!该蛋白与番
茄的茎部特异性表达蛋白关系最近亚细胞定位结果表明!
"#!$(*!
蛋白主要定位于细胞核在铝胁迫条件下!
转
!"#!$(*!
烟草幼苗根的伸长明显优于野生型!根部铝离子和丙二醛含量均显著低于野生型烟草!转
!"#!$(*!
烟草显示出较强的耐铝性
关键词$天山雪莲&铝胁迫&基因克隆&亚细胞定位&功能分析
中图分类号$
E,*)
&
E,*
文献标志码$
@
$%"&(&!)%*+#&*+,"%-(&.)&(%
/
0#0"12&3&"4&
5&1-"+0$1221()$-/3&*1"($#$6(-786#-7
A@?BF4/9/4
#
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GF@?BH/18I4
#
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J@?BK/1
7
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GF@?BJ43/1
#
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GF@?BAL/
#
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M
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S7
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M
I1ZLS;<5Z(0TSL00+[8
M
0/;<;8L3/;45
Y
S<
Y
LST/L041Z3<5L;I54SPL4TISL0Y
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Z/;TLZ=
M
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0/008<6LZT84T!"#!$(*!
7
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M
Y
L;/P/;
Y
SM
5<
7
L1LT/;
4145
M
0/0/1Z/;4TLZT84T!"#!$(*!
Y
SM
SL54TLZT2
.,
3
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Y
L;/P/;
Y
SM
/1T8L1I;5LI0 +N1ZLS45I3/1I3
0TSL00
!
"#!$(*!TS410
7
L1/;
Y
541T4;;I3I54TL5L00@#41Z\>@;<1;L1TS4T/<1/1S<T
MY
L
Y
541T0
!
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L
Y
541T0
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L
Y
541T0+
6
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&
45I3/1I30TSL00
&
7
L1L;5<1L
&
0I=;L5I54S5<;45/:4T/<1
&
PI1;(
T/<14145
M
0/0
!!
铝是地壳中含量最高!分布最广的金属元素!中 性土壤溶液中铝主要以不溶性的硅酸盐和氧化物的
形式存在*#+!对植物无毒性然而在酸性土壤中!铝
胁迫被认为是限制作物生长的最重要因素*!(%+植
物在受到铝毒胁迫时会表现出多方面的应对机制!
如通过诱导有机酸,磷酸盐,酚类物质和黏胶的分泌
或是根际
Y
F
的提高将大量的铝拒于根表之外而免
受毒害*$(-+早在
##*
年!
F4ST6L5
等*,+首次发现
了铝对植物的毒害作用以来!越来越多的学者对此
进行了大量研究进入
*"
年代以来!有关铝的研究
报道成为热点!特别在小麦*+,大麦*+,玉米*#"(##+,花
生*#!+,大豆*#%+等作物中做了大量研究!但对于铝对
植物毒害的机理和植物的耐铝机制还需大量的实验
证明
以往的报道中!许多学者已经对一些植物的耐
铝蛋白基因进行了克隆和功能分析!如从谷子未成
熟种子的
;>?@
文库中克隆的
!"-
基因在拟南芥
中过表达提高了转基因拟南芥的耐铝性*#$+&在烟草
和大麦中过表达编码苹果酸转运子的
4567#
基
因!都能够提高植株对铝胁迫的耐受性*#)+&油菜中
过表达
6*!8$
基因能够获得耐铝表型*#-+等等
天山雪莲"
!%&&()%"*+,-&.(%/%V4S+LTV/S+
#为菊
科凤毛菊属!又名新疆雪莲,雪荷花,雪莲花等*#,+!
主要生长在海拔
!$""
#
$#""3
的雪线附近的岩
缝,石壁,冰碛砾石滩中!其生长的原始土壤母质中
铝金属离子可能随着风化过程通过雪水进入土壤
中!从而形成植物的铝胁迫环境
实验室前期从天山雪莲叶片低温诱导的
;>?@
文库中克隆了一个未知蛋白基因"
!"#!$(*!
#
;>?@
全长序列通过对转天山雪莲
!"#!$(*!
基因的烟
草抗逆性分析!表明转基因烟草具有一定的抗旱性!
但抗寒效果不明显"数据还未发表#本研究对该基
因编码的氨基酸序列进行保守结构域的分析!发现
该基因含有小麦铝诱导蛋白
A4/5,
的保守结构域
为分析其在植物耐铝性中的作用!本试验对转该基
因的烟草进行耐铝性研究分析!并构建了该基因的
B][
融合表达载体!分析了其在细胞中的定位结
果表明转基因烟草能够显著提高植物对铝的耐受
性!为利用基因工程提高作物耐铝胁迫能力奠定
基础
#
!
材料和方法
:+:
!
材
!
料
:+:+:
!
植物材料
!
转
!"#!$(*!
"
Y
W^#!#(!"#!$(
*!
#基因的烟草
C
#
代种子!野生型"
AC
#烟草"
9".:
,/"%*%/%;%.&1H+
#-
?O*
)!由石河子大学农业生
物技术重点实验室保存
:+:+;
!
菌株,质粒及试剂
!
天山雪莲
;>?@
文库,
大肠杆菌"
<.=)(".="%.,-"
#
>F)
$
菌株,根瘤农杆
菌"
4
>
(,;%./)("&1/&1)
?
%.")*
#菌株
B_%#"#
,植
物表达载体
Y
W^#!#
,中间载体
Y
@,(@AB
均为本实
验室保存限制性内切酶,反转录酶,
7%
C
>?@
聚
合酶,
C
$
>?@
连接酶,
?`@
提取试剂盒和凝胶回
收试剂盒均购于宝生物工程大连有限公司!
Y
B\(C
载体购自北京天根公司!其他化学试剂均为国产或
进口分析纯
:+;
!
方
!
法
:7;7:
!
0-405<=;
目的基因克隆
!
利用本实验构建
好的天山雪莲叶片低温诱导的
;>?@
文库!采用通
用引物
\#%
进行
[O`
扩增并测序!根据天山雪莲
;>?@
文库单克隆测序结果以及其在
?OW^
上的比
对结果!使用
[S/3LS)+"
设计特异性引物
Q>#
"
)a(
@O@@CCOCCO@@CBCOCOCOCOC@O(%a
#和
Q>!
"
)a(@@O@OOCCBBOOOO@@CC@B(%a
#提取天
山雪莲幼苗总
?`@
!通过
C`([O`
方法 扩 增
!"#!$(*!
目的片段!
[O`
扩增条件为
$b
预变性
%3/1
!
$b
变性
$)0
!
-$b
退火
$)0
!
,!b
延伸
$)
0
!循环
%"
次!
,! b
终延伸
,3/1
扩增产物与
Y
B\(C
载体连接!对重组克隆进行
[O`
鉴定!小量
提取质粒经酶切鉴定正确后交由北京华大基因公司
进行测序
:7;7;
!
0-405<=;
基因编码蛋白的生物信息学分析
!"#!$(*!
基因编码蛋白序列的基本理化性质分析
采用
29[@Q
M
数据库中的
[S在线工具
"
[8
M
0/;<(;8L3/;45
Y
4S43LTLS0 Y
Sc
IL1;L
!
8TT
Y
$%%
L9
Y
40
M
+7
%
T<<50
%
Y
SY
4S43+8T(
35
#借助
[S在线分析工具"
8TT
Y
$%%
L9(
Y
40
M
+7
%
T<<50
%
Y
S#对
Q/XQ>(*!
进行
氨基酸的亲%疏水性分析为预测
Q/XQ>(*!
蛋白在
细胞内的定位分别采用了在线蛋白质分析软件
A$
[SZ/;T/<1
"
8TT
Y
$%%
6<5P
Y
07
%#和
W4541;LZ0I=;L5(
5I54SH<;4T/<1
Y
SLZ/;T"
W4OL5H<
#"
8TT
Y
$%%
7Y
;S+
=/<;<3
Y
+I1/=<+/T
%
=4;L5<
%#通过
?OW^
的
O>>
"
O<10LSRLZ ><34/1 >4T4=40L
#数 据 库 "
8TT
Y
$%%
666+1;=/+153+1/8+
7
%
QTSI;TISL
%
;ZZ
%
6S
Y
0=+
;
7
/
#及
W540T
Y
分别对
Q/XQ>(*!
蛋白序列的保守结
构域及其他物种同源氨基酸搜索进行分析!利用
>?@\@?
软件进行相似性分析使用
\2B@$
和
O5I0T459
软件构建系统进化树
%%
#
期
!!!!!!!!!!!!
王海霞!等$天山雪莲未知蛋白基因的克隆及其耐铝特性分析
:7;7>
!
0-405<=;
绿色荧光蛋白融合表达载体的构
建
!
按照
!"#!$(*!
基因序列设计含有
D=,
%
和
!%-
%
酶切位点的引物"
Q>#
,
Q>!
#!
[O`
扩增
Y
B\(
C
中
!"#!$(*!
基因的全长!将获得的片段与经
D=,
%
和
!%-
%
限制性内切酶酶切的
Y
@,(@AB
载
体连接!从而构建出
Y
@,(!"#!$(*!(@AB
中间载
体用
E"*Z
&
和
<.,`
%
双酶切植物表达载体
Y
W^#!#
!电泳回收
Y
W^#!#
大片段
Q#
!用
E"*Z
&
和
D=,
%
双酶切空的中间载体
Y
@,(B][
!回收含有
%)Q
强启动子的小片段
Q!
&用
D=,
%
和
<.,`
%
双酶
切鉴 定 正 确 的
Y
@,(!"#!$(*!(@AB
!回 收 含 有
!"#!$:*!
基因和
@AB
基因的小片段
Q%
!为了得到
融合表达载体!进行
%
片段连接!从而构建出
Y
W^#!#(
Y
@,(!"#!$(*!(@AB
的融合表达载体
:+;+?
!
烟草的遗传转化及转基因植株的鉴定
!
将
质粒
Y
W^#!#(
Y
@,(!"#!$(*!(@AB
和空载体
Y
@,(
@AB
通过冻融法导入农杆菌
B_%#"#
中并通过叶
盘法转化野生型烟草将浸染的烟草叶片置于含
*"

7
%
3H
卡那霉素"
V41
#抗性的培养基上进行初
步筛选!待烟草叶片的边缘分化出
%;3
左右的丛生
芽时!使其置于卡那霉素抗性的生根培养基中作进
一步筛选生根培养的丛生芽长至
!"Z
左右!采用
OC@W
法提取烟草基因组
>?@
*
#*
+
!以
Y
W^#!#(
Y
@,(
!"#!$(*!(@AB
质粒为阳性对照!空白烟草为阴性
对照!
[O`
检测
!"#!$(*!
和
@AB
目的基因将
[O`
检测为阳性的转基因烟草无菌幼苗移入营养
钵培养几天后!采用
C` ?:<5
法提取阳性植株及空
白烟草的总
?`@
!以质粒为阳性对照!相应的空白
烟草为阴性对照!进行
C`([O`
*
#
+检测
:+;+@
!
亚细胞定位
!
取转
Y
W^#!#(!"#!$(*!(@AB
和
[@,(@AB
基因烟草的根尖制作压片!用
$**13
波长激发
B][
蛋白荧光!在激光共聚焦显微镜
"
HQ\)#"
#下观察
:7;7A
!
0-405<=;
基因在转基因烟草中耐铝性的初
步验证
!
!
#
"氯化铝胁迫对转基因烟草和野生型烟
草幼苗根尖铝离子积累的影响
!
转
Y
W^#!#(!"#!$(
*!
基因
C
#
代烟草种子在含
*"

7
%
3H
卡那霉素的
筛选培养基上萌发
%
#
$Z
后!取其抗性苗和萌发相
同时间的野生型烟草幼苗"选择主根上还未生长侧
根的烟草幼苗#!使其烟草幼苗的根部分别垂直插入
到
"
,
!"
,
)"
和
#""

3<5
%
H
的
@5O5
%
.
-F
!
d
"
Y
F
$+%
#溶液中处理
!$8
!然后用去离子水冲洗根部表
面多余的铝离子使冲洗好的烟草幼苗根部放入苏
木精"
FL34T<9
M
5/1
#染色液"
"+#D
苏木素!
"+"#D
V^d
%
!
"+#33<5
%
H?4dF
#中
!"3/1
!用蒸馏水冲
洗烟草幼苗根部
#)3/1
!解剖显微镜下观察根尖染
色情况
!"氯化铝胁迫对转基因和野生型烟草幼苗根
部丙二醛含量的影响
!
取约
#
周龄的卡那霉素筛选
阳性转基因"
Y
W^#!#(!"#!$(*!
#
C
#
代和野生型烟草
幼苗!将其根部在
"
,
!"
,
)"
和
#""

3<5
%
H
的
@5O5
%
.
-F
!
d
"
Y
F$+%
#溶液中分别处理
!$8
!分别取转基
因和野生型烟草根部组织约
%"
#
)"3
7
!加入
)D
三
氯乙酸"
TS/;85!
CO@
#!充分研磨后倒
入离心管!
#!"""S
%
3/3
离心
#"3/1
吸上清于试
管中!加入
"+-,D
硫代巴比妥酸"
T8/<=4S=/TIS/;4;/Z
CW@
#!混匀后将试管放入沸水中煮
%"3/1
冷却
后分别测定
@
$)"
,
@
)%!
和
@
-""
!按照公式$
F
"

3<5
.
H
&#
#
e-+$)
"
4
)%!
&4
-""
#
&"+)-4
$)"
计算丙二醛
"
\>@
#的含量以上实验均至少重复
%
次
!
%
"数据分析
!
以上数据分析使用
29;L5!""%
及
Q[QQ#+"
软件
!
!
结果与分析
;7:
!
0-405<=;
的理化特性和胞内定位预测
[S<[4S43
预测显示!
!"#!$(*!
共编码
!-!
个
氨基酸!蛋白质分子式为
O
#!%
F
!""*
?
%%-
d
%,,
Q
#-
&相对
分子质量为
!**")+#XI
!理论等电点为
*+$$
!不稳
定参数是
%,+"
!属于稳定蛋白!含量较高的氨基酸
主要有
QLS
"
!*
个!
#"+,D
#,
HLI
"
!-
个!
+D
#,
B5
M
"
!!
个!
*+$D
#,
H
M
0
"
!"
个!
,+-D
#&总的带负电荷
的残基数"
@0
Y
fB5I
#为
!%
!带正电荷的残基数
"
@S
7
fH
M
0
#为
!-
&蛋白质亲水性平均数为
&"+#!*
!
预测该蛋白为可溶性蛋白
使用
A和
W4OL5H种不同的网
络工具进行
Q/XQ>(*!
亚细胞定位预测!分析结果均
显示
Q/XQ>(*!
在细胞中最可能的定位是在细胞核
中
A预测显示核定位可靠指数为

!
W4OL5H<
预测
Q/XQ>(*!
直接进入细胞核!或先进入
细胞质再进入细胞核
;7;
!
B#3BC<=;
结构域分析与氨基酸同源性分析
用
O>>
软件分析该蛋白的保守结构域!结果表
明
Q/XQ>(*!
与小麦的铝诱导蛋白
A45/,
一样具有
谷氨酸氨基转移酶的保守结构域!是
B1
(
@C
(
"
家
族中的一个成员
B1
(
@C
(
"
家族共有

个成员类
型!且基本都与氮代谢有关其中天冬酰胺合成酶
W
是其中一类!并且与植物对抗病抗逆的响应机制
密切相关!最近!
UI
等*!"+发现番茄和烟草的天冬酰
$%
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
胺合成酶基因参与
F
?
%
4+(
介导的过敏性抗性反应
和水稻白叶枯病原菌"
D%*/=,1,*%,(
2
G%)
Y
R+
,(
2
G%)
#介导的非寄主抗性反应!而这与辣椒上的结
果是一致的*!#+由此发现植物天冬酰胺合成酶基
因在抗病抗逆过程中发挥着重要作用的雪莲
!"#!$(*!
基因是否介导植物抗病性方面需要进一
步的探讨
通过
W540T[
进行同源性搜索!应用
>?@\@?
软件进行氨基酸序列比对分析"图
#
#
!"#!$(*!
编码的蛋白与蓖麻"
0"."*&.,11&*"
#和番茄"
!,:
-%*&1-
2
.,
3
)(".&1
#的茎部特异性表达蛋白一致
性分别为
-"+*D
和
)+!-D
!与可可"
7=),;(,1%
.%.%,
#,拟 南 芥 "
4(%;"H,
3
"/=%-"%*%
#和 小 麦
"
7("/".&1%)/"+&1
#的铝诱导蛋白的一致性分别为
-"+,$D
,
)*+")D
和
$-+),D
与番木瓜未知蛋白
和苜蓿天冬酰胺合成酶的一致性分别是
-"+%D
和
-"D
这些蛋白都含有小麦铝诱导蛋白
A45/,
的保
守结构域应用
\2B@$+#
软件对
#!
个物种氨基
酸序列建立系统发育树!结果表明该蛋白与番茄
"
!,-%*&1-
2
.,
3
)(".&1
#茎部特异性表达蛋白亲缘
关系最近并在同一分支上"图
!
#
;7>
!
B#3BC<=;
绿色荧光蛋白融合表达载体的构建
用
E"*Z
&
和
<.,`
%
双酶切植物表达载体
Y
W^#!#
!电泳回收
Y
W^#!#
大片段
Q#
!用
E"*Z
&
和
D=,
%
双酶切空的中间载体
Y
@,(B][
!回收
%)Q
小
片段
Q!
&用
D=,
%
和
<.,`
%
双酶切鉴定正确的
Y
@,(!"#!$(*!(@AB
!回收含有
!"#!$(*!
基因和
@AB
基因的小片段
Q%
&将
Q#
,
Q!
和
Q%
连接转化大
肠杆菌!挑取单克隆!摇菌提取质粒对构建好的
Y
W^#!#(
Y
@,(!"#!$(*!(@AB
进行菌液
[O`
鉴定和
图
!
!
Q/XQ>(*!
氨基酸序列的进化树分析
]/
7
+!
!
[8
M
5<
7
L1LT/;TSLLY
541TQ/XQ>(*!
43/1<4;/Z0L
c
IL1;L0
图
#
!
!"#!$(*!
氨基酸与其它物种氨基酸序列比对
U[
(
""!)#"%,+#+
蓖麻&
2dJ!*!!+#+
可可&
@WQ"#%)%+#+
番木瓜&
U[
(
""$!%!*)"+#+
番茄&
U[
(
""%)%)!+#+
苜蓿&
?[
(
)-,,,)+#+
拟南芥&
@O_$$!#%+#+
小麦&
*!@@+
天山雪莲
!"#!$(*!
基因编码的氨基酸&
A45/,+
小麦铝诱导蛋白
,
]/
7
+#
!
@5/
7
13L1TY
SLZ/;TLZ43/1<4;/Z0L1;M
!"#!$(*!41ZY
541T
7
L1L0
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7
L1L
&
A45/,+A8L4T45I3/1I3(/1ZI;LZ
Y
S)%
#
期
!!!!!!!!!!!!
王海霞!等$天山雪莲未知蛋白基因的克隆及其耐铝特性分析
D=,
%
,
<.,`
%
双酶切鉴定!电泳显示!均可得到预
期大小的片段"图
%
!
@
,
W
#!说明植物融合表达载体
Y
W^#!#(
Y
@,(!"#!$(*!(@AB
构建成功
;7?
!
转
D
EF:;:<
D
)G<0-405<=;<678
基因和
D
)G<
678
基因烟草
H$I
检测和
I,检测
将转基因烟草基因组
[O`
检测为阳性的植株!
CS/:<5
试剂提取
?`@
!进行
C`([O`
检测!检测结
果表明!在
,*=
Y
及
)))=
Y
"图
$
!
@
,
W
#均能扩增出
目的条带!表明该转基因株系能正常转录
;7@
!
B#3BC<=;
的亚细胞定位
取转
Y
W^#!#(
Y
@,(!"#!$:*!:@AB
和
Y
@,(@AB
基因烟草的根尖制作压片!用
$**13
波长激发
B][
蛋白荧光!在激光共聚焦显微镜"
HQ\)#"
#下观察
"图
)
!
@
#
]
#!发现
Q/XQ>(*!(B][
主要在细胞核中
表达"图
)
!
]
#!而
B][
对照在整个细胞内均有绿色
荧光"图
)
!
O
#!由此推测!
Q/XQ>(*!
主要定位在细
胞核中
;+A
!
氯化铝胁迫对转基因烟草和野生型烟草幼苗
根尖铝离子积累及膜脂过氧化的影响
苏木素可与三价铝离子结合生成蓝紫色沉淀!
可用来检测植物根尖铝离子含量的高低转
!"#!$(*!
基因的烟草和野生型烟草分别用
"
,
!"
,
)"
和
#""

3<5
%
H
的
@^O5
%
.
-F
!
d
"
Y
F$+%
#溶液
处理
!$8
!经过染色后发现!在
!"
到
#""

3<5
%
H
的
@5
%f处理下!野生型烟草根尖颜色从淡紫色逐渐变
成深紫色而转
!"#!$(*!
基因的烟草根尖在
)"

3<5
%
H
的
@5
%f 处理下才开始显现淡紫色"图
-
!
@
#苏木素染色结果表明在高浓度铝离子溶液中!
转
!"#!$(*!
基因烟草根尖铝离子的含量很有可能
比野生型烟草根尖要低
对于转
!"#!$(*!
基因的烟草是否会减轻对
@5
%f的胁迫!本实验测定了
@5
%f胁迫后转基因和野
图
%
!Y
W^#!#(
Y
@,(!"#!$(*!(@AB
融合表达载体的构建
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&
&
@+
Y
W^#!#(
Y
@,(!"#!$(*!(@AB[O`
电泳图$
#
#
-+!"#!$(*!(@AB[O`
&
,+
阴性对照&
W+
Y
W^#!#(
Y
@,(!"#!$(*!(@AB
酶切电泳图$
#+
酶切
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7
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!
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W^#!#(
Y
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Y
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&
&
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Y
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$
#
#
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7
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&
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3LZ/
7
L0T/<1Y
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Y
@,(!"#!$(*!(@AB
$
#+21:
M
3LZ/
7
L0T/<1
图
$
!
转基因烟草
C`([O`
及
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检测结果
\+\4SX
&
&
@+
转
Y
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烟草
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电泳图$
#+
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!+!"#!$(*!
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转
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Y
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烟草&
W+
转基因烟草
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电泳图$
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质粒&
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%
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转
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烟草&
)
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-+
转
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烟草
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卷
图
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的亚细胞定位
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空载体&
>
#
]+
Y
@,(Q/XQ>(*!(B][
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@
,
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W
,
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可见光下的显微图片&
O
,
]+
两者叠加的图片
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7
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#
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!
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!
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!
2
图
-
!
苏木精的根尖染色"
@
#及根尖丙二醛含量"
W
#
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7
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"
@
#
41Z\>@;<1TL1T/1S<"
W
#
图
,
!
野生型和
!"#!$(*!
转基因烟草幼苗铝胁迫下的主根形态"
@
#和根长"
W
#
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,%
#
期
!!!!!!!!!!!!
王海霞!等$天山雪莲未知蛋白基因的克隆及其耐铝特性分析
生型烟草根尖的
\>@
的含量!结果"图
-
!
W
#显示!
烟草植株根尖在
!"
#
#""

3<5
%
H
的
@5
%f处理下!
野生型烟草根尖
\>@
的含量分别增加了
"+,
,
#+$
和
%+%
倍!而转
!"#!$(*!
烟草根尖
\>@
的含量仅
仅增加了
"
,
"+,
和
#+*
倍!且在
#""

3<5
%
H
的
@5
%f处理下与野生型相比差异显著&且刚萌发的转
基因烟草和对照烟草幼苗在
#""

3<5
%
H@5O5
%
.
-F
!
d
的
#
%
-\Q
液体培养基中处理
!"Z
后!转基因
烟草幼苗根长明显优于对照"图
,
!
@
,
W
#表明在
相同时间和相同
@5
%f离子浓度处理下!转
!"#!$(
*!
烟草受到
@5
%f 胁迫的程度要比野生型烟草轻
得多
%
!
讨
!
论
从天山雪莲叶片低温诱导的
;>?@
文库中克
隆了
!"#!$(*!
基因全长序列!经过测序!运用生物
信息学分析软件!结合生物信息数据库!发现其在数
据库中是一种未知功能蛋白基因!用
O>>
软件分析
该蛋白的保守结构域!结果表明
Q/XQ>(*!
与小麦铝
诱导蛋白
A45/,
具有相似的保守结构域!同属
B1
(
@C
(
"
家族的成员此家族成员多与氮代谢和抗逆
抗病有密切关系进一步的氨基酸序列相似性分析
发现!
Q/XQ>(*!
与番茄的茎部特异性表达蛋白的同
源性为
)+!-D
!系统发育树分析表明!
Q/XQ>(*!
与
番茄的茎部特异性表达蛋白处于同一分支!在进化
关系上非常接近!并且番茄茎部特异性表达蛋白也
含有铝诱导蛋白的保守结构域!因此预计天山雪莲
!"#!$(*!
基因可能与铝胁迫相关蛋白有关联
苏木素可与
@5
%f 形成一种蓝紫色沉淀复合
物*!!+!因此可以做为检测植物幼苗根尖早期受铝毒
程度大小的指示剂!此方法简便,快捷而且可靠*!%+
本实验中!转基因和野生型烟草幼苗根尖分别用
!"
,
)"
和
#""

3<5
%
H@^O^
%
.
-F
!
d
"
Y
F$+%
#处理
后!野生型烟草幼苗的根尖被苏木精染成深紫色!而
转基因烟草则在
)"

3<5
%
H@5O5
%
.
-F
!
d
中经苏
木素染色后才开始呈现出淡紫色!这个结果表明野
生型烟草根尖比转基因烟草积累了更多
@5
离子
丙二醛"
\>@
#是膜脂过氧化的最终产物!可以反映
植物在逆境中受伤害的程度!
@5
%f在根尖细胞壁和
外质体快速积累!与细胞膜上的磷脂极易结合!产生
自由基导致膜脂过氧化!影响细胞膜的稳定性*!$+!
而且
W40I
等*!)+发现欧洲油菜"
I(%".%*%
3
&
#在
含不同浓度的
@5
%f溶液中处理后!其根的长度受到
抑制而且其根尖的
\>@
的水平也随
@5
%f浓度的
增加而增加本实验数据分析表明!烟草在
!"
,
)"
,
#""

3<5
%
H@5O5
%
.
-F
!
d
溶液处理
!$8
后!转基
因烟草根尖
\>@
的含量都比对照要低铝胁迫主
要通过抑制根尖细胞分裂和伸长!而使根变得短粗
而扭曲!根毛和须根变少!根尖膨大植物根从土壤
吸收水分和养分的主要是根尖的根毛区!其次是伸
长区!当这两个部位受到铝胁迫时!其吸收功能减
弱!导致植物吸收水分和必需矿质元素的能力降
低*!)+研究的结果表明
!"#!$(*!
基因在烟草中的
过表达提高了烟草的耐铝性
通过荧光定位观察!证实
Q/XQ>(*!
主要定位于
细胞核中!与生物信息学分析结果基本一致该基
因是否具有转录调控因子的作用还需要进一步的研
究分析!将为今后更详尽的研究
!"#!$(*!
在耐铝
方面的功能提供参考和证据!同时也为将来阐明它
的分子机制奠定基础
参考文献!
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