全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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#"*+,",
%
-
*.//0*#""")$"!*!"#$*#"*#&#
收稿日期$
!"#$)")"$
&修改稿收到日期$
!"#$)"1)%#
基金项目$遵义医学院硕士启动基金"
2),%+
#
作者简介$程小玲"
#&1+(
#!女!讲师!主要从事植物分子生物学方面研究
3)45.6
$
786
99
44#&1+
!
!#70*7:4
"
通信作者$杨加伟!博士!副教授!主要从事分子生物学方面研究
3)45.6
$
&&"#",)
;-
<
!
#,%*7:4
水稻
$%
&
"()*+,
蛋白的原核
表达与多克隆抗体制备
程小玲!杨加伟"
"遵义医学院 细胞生物学与遗传学教研室!生物化学教研室!贵州遵义
,%"""
#
摘
!
要$为了制备水稻
=>
?
:05@AB!
"
=CD!
#的多克隆抗体!该研究采用
EF)GHE
扩增
D/=CD!
蛋白
#,
"
$"#55
片段和
$$"
"
+"55
片段的编码序列!并构建了
!
个原核表达载体诱导表达重组蛋白后注射家兔!制备了相应的
多克隆抗体!最后利用
IB/AB>0J6:A
初步分析水稻
=CD!
蛋白的表达模式结果表明$成功构建
!
个表达载体!通
过诱导获得了分子量约为
%"KL
和
!%KL
的重组蛋白其中!以
$$"
"
+"55
片段为抗原所制备的多克隆抗体免
疫印记效果较好
IB/AB>0J6:A
表明在水稻花药(愈伤组织及小穗中检测到
D/=CD!
表达该研究为进一步深入
探讨水稻
!"#$!!
基因的特性与功能奠定了基础
关键词$
D/=CD!
&原核表达&多克隆抗体&水稻
中图分类号$
M+1,
文献标志码$
=
-%".(%
/
"*#012
3
%+44#"(!-"5
/
05"(5$*#6"!
/
-%+
3
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"()*+,#8#0+
"
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HN3OCP.5:6.0
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D/=CD!
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9
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9
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9
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@/BU5/50A.
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B0A:.44@0B>5JJ.A/*FVBB8
9
>B//.:0
9
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50A.J:U.B/
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>B
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9
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B7.S.7.A
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AB/ABUJ
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5056
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756@/50U/
9
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AVB
9
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9
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$
=CD!
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9
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:A.7B8
9
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9
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;
&
>.7B
"
!%
&
("()*+(\*
#
!!
=>
?
:05@AB
"
=CD
#蛋白是一类高度保守的蛋白
家族!为
EO=
诱导的沉默复合体"
EO=.0U@7BU/.)
6B07.0
?
7:4
9
6B8
!
E]WH
#的核心元件)#)!*
=CD
蛋
白既能与小
EO=/
形成沉默复合体参与转录后基
因沉默!又能够参与
EO=
指导的
LO=
甲基化!有
着多样的生物学功能
=CD
家族蛋白的分子量约
为
#""KL
!其成员均为强碱性蛋白且均含有
!
个标
志性保守结构域$
G=X
和
G]I]
结构域)%*其中!位
于
=CD
蛋白
O
端的
G=X
结构域含有约
#%"
个氨
基酸!普遍认为其功能是与
EO=
单链的
%^
末端相
互作用!促进
/.EO=
(靶
4EO=
和
E]WH
的特异结
合)$)*位于
=CD
蛋白
H
端的
G]I]
结构域含有约
%""
个氨基酸!推测其功能与
EO5/BN
相似!在
/.E)
O=
与靶
4EO=
配对后切割靶
4EO=
!从而导致
转录后基因沉默),*通过对突变体的研究发现!
=CD
蛋白在植物分生组织的维持(生长时相转换的
控制!以及动物干细胞的维持(肿瘤发生等过程中均
起重要作用)+)#"*
目前!在拟南芥中植物
=CD
蛋白家族的功能
研究较多!但在单子叶模式植物水稻中的报道相对
较少)##*现有研究表明!水稻含有
#&
种
=CD
蛋
白!它们可以分成
,
个分支$
Y3\#
(
=CD#
(
=CD$
(
=CD+
(
=CD#+
和
=CD#1
其中!本研究选择的
=CD!
蛋白属于
=CD+
分支)#!*!该蛋白目前在水稻
中的生物学功能尚不清楚因此!本研究利用
GHE
技术扩增水稻
#$!!
"
!"#$!!
#基因的部分
DE2
"开放阅读框#区域!构建其原核表达载体!获得重组
蛋白并免疫家兔制备
D/=CD!
多克隆抗体!最后用
IB/AB>0J6:A
验证抗体的免疫效果以及
D/=CD!
在水稻中的表达情况!为进一步研究
D/=CD!
蛋白
在水稻中的生物学功能奠定基础
#
!
材料和方法
=*=
!
材
!
料
本研究所用材料为粳稻"
!%
&
("()*+(\*/
99
*
,
(
-
./*0(
#品种+中花
##
,!由华南农业大学遗传工程
室保存&所用家兔为广东省动物实验中心提供的雄
性新西兰白兔&原核表达载体
9
3F)!%U
与菌株
T\!#
"
L3%
#由华南农业大学遗传工程室保存&主要
试剂购自上海生工公司(大连宝生物工程有限公司(
广州化学试剂厂等
=*,
!
方
!
法
=:,:=
!
>4$?>,
生物信息学分析
!
D/=CD!
蛋白
抗原表位分析采用
LO=WA5>
软件的
G>:AB50
程序
采用
R54B/:0)I:6S
法预测
D/=CD!
蛋白抗原指
数!根据
34.0.
原则分析
D/=CD!
表面可及性!按
照
_
;
KB)L::6.AA6B
的氨基酸亲水性标准预测
D/=)
CD!
的亲水性
=:,:,
!
3
1@A,B!A$?>,
原核表达载体的构建
!
参
照
F>.Z:6
试剂盒说明书提取水稻叶片
EO=
!反转录
得到
7LO=
第一链用上游引物
D/=CD!)#2
"
^)
====CC=FHH=CHCH=FFCHFFHF=HFC=)
CC)%^
!
1(2N
#
酶切#和下游引物
D/=CD!)#E
"
^)
====CFHC=HH=H=C=HFFHFC==H==C=)
FH)%^
!
3(4
#
酶切#!以及上游引物
D/=CD!)!2
"
^)
====CC=FHHC=CCFFC=HFC=F===HHF)
CH)%^
!
1(2N]
酶切#和下游引物
D/=CD!)!E
"
^)
====CFHC=HCCFHHF=HH=CFC=HFFHH=)
%^
!
3(4
#
酶切#进行
EF)GHE
扩增
!"#$!!
基因编
码区内
!
段不同序列将纯化后的目的片段和质粒
9
3F)!%U
分别用内切酶
1(2N
#
和
3(4
#
进行双酶
切!酶切产物用
F
$
LO=
连接酶"
F5_5E5
#进行连
接!构建原核表达载体
9
3F)!%U)=CD!)#
和
9
3F)
!%U)=CD!)!
!然后将重组质粒电击转化到大肠杆菌
菌株
T\!#
"
L3%
#中!提取质粒酶切鉴定重组载体!
并进行
LO=
测序验证
=*,*B
!
重组蛋白的诱导表达
!
重组蛋白的诱导方
法参见文献)
#%
!
#$
*进行并适当改进!详细操作如
下$分别挑取阳性单菌落和含空载体的菌株于
\T
液体培养基"含
#""
$
?
%
4\=4
9
#中!
%+`
振荡培
养过夜!次日以
#a#"
的体积比接种于另一新鲜的
含抗生素的
\T
液体培养基!
%+`
(
!"">
%
4.0
继续
振荡培养至
DL
"
#
"*
!取
#4菌液作为对照备
用加入终浓度为
#44:6
%
\]GFC
诱导蛋白表达!
在加入
]GFC
后
#
(
!
(
%
(
$
和
V
取菌液
#4菌液
离心收集菌体后悬浮于
!""
$
\UUN
!
D
中!超声波
破碎后!取
!"
$
样品加入
!bWLW
样品缓冲液!
#""`
加热
4.0
!
#!""">
%
4.0
离心
4.0
后进行
聚丙烯酰胺凝胶电泳检验蛋白表达情况
=*,*C
!
多克隆抗体的制备
!
大量诱导
D/=CD!
重
组蛋白进行
#"c WLW)G=C3
电泳后!切割目的条
带!取约含
#4
?
重组蛋白
WLW)G=C3
凝胶带!液氮
磨碎后!与等体积的弗氏完全佐剂进行乳化!乳化好
的匀浆即用于多点注射雄性新西兰大白兔以后的
!
"
%
次加强免疫注射蛋白量减半!且采用不完全佐
剂乳化注射!各次免疫的时间间隔为
#
周!最后
#
次
加强免疫注射
+
"
#"U
后采血!离心收集抗血清
=:,:D
!
E+4*+%65"*
分析
!
称取
"*#
?
水稻材料于
研钵!加入
#4蛋白抽提液"
"44:6
%
\F>./)
NH6
!
#"44:6
%
\O5H6
!
"*#c OG)$"
!
$44:6
%
Y
?
H6
!
!
44:6
%
\LFF
!
9
N+*
#
)
#
*
!磨成匀浆!
#!""">
%
4.0
离心
#"4.0
!取上清于
(+"`
冷冻保
存备用取适量体积的蛋白样品于等体积
!bWLW
样品处理缓冲液于
#""`
煮沸
4.0
后即可上样
蛋白样品进行
#"c WLW)G=C3
电泳!当溴酚蓝跑
至胶底部时停止电泳剪与凝胶大小相同的硝酸纤
维素膜和
$
块滤纸!与电转仪方框同在转移缓冲液
中浸泡
#4.0
在电转缓冲液中按照从负极向正
!&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
极的顺序进行以下组装$海绵垫
)
滤纸
)
凝胶
)
硝酸纤
维素膜
)
滤纸
)
海绵垫!注意赶走气泡!恒流
!""4=
电转移
!V
将膜浸入
c
脱脂奶粉中常温封闭
%V
"或
$`
封闭过夜#后用
#bFFTW
清洗

次!每次

"
#"4.0
!在
c
脱脂奶粉中按
#a!"""
的稀释比
例加入一抗!膜浸入其中常温杂交
!V
将杂交膜
#
bFFTW
清洗

次!每次

"
#"4.0
!在
c
脱脂奶
粉中按
#a#""""
的稀释比例加入二抗"辣根过氧
化物酶标记的羊抗兔
]
?
C
#!膜浸入其中常温杂交
#
V

#bFFTW
清洗

次!每次

"
#"4.0
!
#bFTW
洗
#
次!
#4.0
&将洗好的膜加入
HWF
化学发光试
剂进行发光!在暗室中压胶片!最后将胶片依次置于
显影液和定影液中!胶片干燥后照相
!
!
结果与分析
,:=
!
>4$?>,
蛋白抗原表位分析
搜索
OHT]
水稻基因数据库发现
#
个编码
=CD!
的基因序列"
OHT]
序列号
OY
-
""#","$",
#!命名为
!"#$!!
进一步分析发现
!"#$!!
基因位于第
$
号
染色体上!编码区全长
%#"J
9
!相应的蛋白序列号
为
H=L$#+&
!全长
#"%$
氨基酸!预测其蛋白分子量
为
###*$KL
利用
LO=WA5>
软件
G>:AB50
程序对该
蛋白序列进行分析!利用
R54B/:0)I:6S
法预测
D/=)
CD!
蛋白抗原指数!结果显示
D/=CD!
蛋白从
O
端
至
H
末端大部分区域抗原指数均较高!可能的抗原表
位区多且分散!如$
#
"
%%55
(
#1"
"
%""55
(
$$"
"
$+"
55
(
"1
"
!&55
等"图
#
#根据
34.0.
原则分析表面
可及性!结果显示!
D/=CD!
蛋白中表面可及性较
高的区域主要分布在
#1"
"
!&"55
(
$!1
"
$%+55
(
$1,
"
$&$55
(
"1
"
%+55
等区段"图
#
#&按照
_
;
KB)L::6.AA6B
的氨基酸亲水性标准!得出
D/=)
CD!
蛋白具较高的亲水性!如$
#
"
%#55
(
$!
"
#%1
55
(
$""
"
1"55
等"图
#
#
,:,
!
,3!5,,
基因片段扩增与原核表达载体构建
综合分析
D/=CD!
蛋白抗原表位预测结果!本
研究分别选取了该蛋白
!
段不同区域$抗原指数较
高但表面可及性及亲水性稍差的
#,
"
$"#55
片段
"
D/=CD!)#
#!和抗原指数(表面可及性指数以及亲
水性指数均较高的
$$"
"
+"55
片段"
D/=CD!)!
#!
分别作为抗原进行抗体制备和比较对
D/=CD!)#
和
D/=CD!)!
与其它
D/=CD
蛋白进行同源分析!
结果显示!这
!
段蛋白序列和其它
D/=CD
蛋白相
应序列的一致性较低!和同一分支中的
D/=CD%
和
D/=CD+
蛋白的相应序列也仅有约
"c
和
%"c
的
序列一致性接着!根据其相应的核酸序列设计引
物!利用
EF)GHE
技术成功从水稻
7LO=
中扩增得
到了大小约为
+""J
9
和
$""J
9
的片段"图
!
!
=
#
回收目的片段后经过限制性内切酶酶切及体外连接
等方法!将其连接到原核表达载体
9
3F)!%U
!利用酶
切和测序确定载体构建正确最终获得了这
!
个片
段的原核表达载体"图
!
!
T
(
H
#
,:B
!
>4$?>,
重组蛋白的原核表达
取
9
3F)!%U
重组表达菌株划板!挑取单菌落摇
菌并培养至
DL
"
为
"*
"
"*,
!分别在加
]GFC
诱
导前和诱导后
#
(
!
(
%
(
$
和
V
时取菌液
#4!超声
波 破碎后进行
WLW)G=C3
电泳检测结果"图
%
#
图
#
!
D/=CD!
蛋白抗原表位分析
2.
?
*#
!
=0A.
?
B0.7.0UB8:SD/=CD!
%&#
#"
期
!!!!!!!!!!
程小玲!等$水稻
=>
?
:05@AB!
蛋白的原核表达与多克隆抗体制备
图
!
!
基因扩增与原核表达载体示意图
=*!"#$!!
基因片段扩增结果$
Y*LO=45>KB>
&
#*!"#$!!5#
&
!6!"#$!!)!
&
T
(
H*D/=CD!)#
"
T
#和
D/=CD!)!
"
H
#原核表达载体示意图
2.
?
*!
!
CB0B54
9
6.S.75A.:050U
9
>:K5>
;
:A.7B8
9
>B//.:0
9
65/4.U//7VB45A.7
9
>B/B0A5A.:0/
=*36B7A>:
9
V:>B/./>B/@6A/:S!"#$!!
?
B0BS>5
?
4B0A/
$
Y*LO=45>KB>
&
#*!"#$!!)#S>5
?
4B0A
&
!*!"#$!!)!
S>5
?
4B0A
&
T
!
H*W7VB45A.7
9
>B/B0A5A.:0/:SD/=CD!)#
"
T
#
50UD/=CD!)!
"
H
#
9
>:K5>
;
:A.7B8
9
>B//.:0
9
65/4.U/
图
%
!
D/=CD!)#
"
=
#和
D/=CD!)!
"
T
#原核表达蛋白电泳图
Y*
蛋白质
45>KB>
&箭头所示为目标蛋白条带
2.
?
*%
!
G>:K5>
;
:A.7B8
9
>B//.:0:SD/=CD!)#
"
=
#
50UD/=CD!)!
"
T
#
Y*G>:AB.045>KB>
&
=>>:B7:4J.050A
9
>:AB.0/
显示! 种载体和诱导前相比!含有重组质粒的菌株
在诱导
#V
时都能看到明显的重组蛋白条带!大小
分别约为
%"KL
"
D/=CD!)#
#和
!%KL
"
D/=CD!)
!
#!与理论预测值相符
!
个重组蛋白均在诱导
%V
时表达量达到峰值!且
D/=CD!)#
重组蛋白诱导表
达超过
%V
后!其表达量反而随着诱导时间的延长
而降低因此!本研究后续以
]GFC
诱导
%V
来获
得
!
个重组蛋白!切割目的片段备用
,:C
!
>4$?>,
多克隆抗体制备与
E+4*+%65"*
检测
将乳化后的
!
种蛋白分别免疫家兔制备抗体!
在 第
%
次注射家兔
#
周后!小量取血并收集抗血清!
用
IB/AB>0J6:A
验证多克隆抗体是否制备成功分
别将水稻花药(愈伤组织(小穗的总蛋白进行
WLW)
G=C3
电泳后转膜!抗血清按
#a!"""
稀释比例进
行
IB/AB>0J6:A
分析结果"图
$
#显示!以
$$"
"
+"55
片段为抗原所获得的多克隆抗体在花药(愈
伤组织(小穗蛋白中均检测到了约
##"KL
大小的
D/=CD!
蛋白条带!且免疫印迹条带清晰!表明抗
体制备成功!也说明
D/=CD!
蛋白在水稻花药(小
穗及愈伤组织均具有表达此外!以
#,
"
$"#55
片段为抗原所获得的多克隆抗体在
##"KL
处未出
现特异性条带!暗示重组表达的
D/=CD!)#
制备抗体
图
$
!
IB/AB>0J6:A
检测水稻不同组织中的
D/=CD!
表达情况
Y*
蛋白质
Y5>KB>
&
#*
花药&
!*
愈伤组织&
%*
小穗&箭头示目标条带
2.
?
*$
!
IB/AB>0J6:A5056
;
/./:SD/=CD!
.0U.SSB>B0AA.//@B/:S>.7B
Y*G>:AB.045>KB>
&
#*=0AVB>
&
!*H56@/
&
%*W
9
.KB6BA/
&
=>>:9
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未获成功证明本研究以
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片段为抗原
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诱导的沉默复合体中必不
可少的成分之一随着对
EO=
沉默现象的深入研
究!越来越多的证据表明!这类在生物界非常保守的
蛋白家族与
EO=
介导的基因沉默机制密切相
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抗体!为深入探讨
=CD
蛋白的生物学功能
及其在
EO=.
途径中的作用!从分子水平揭示其作
用机理奠定了基础
抗体的制备是研究目的基因在翻译水平的表达
特性(蛋白之间互作以及蛋白质功能的基础目前!
利用重组蛋白免疫家兔制备多克隆抗体由于方法成
熟(过程简单(制备周期短!因此得到了广泛的应
用)#%)#$!#&*抗体制备成功的关键在于选择合适的抗
原区域!抗原区域的选择主要以亲水性(可及性(抗
原性(可塑性(二级结构预测和电荷分布等为参考!
而亲水性和可及性是形成抗原表位的首要条件此
外抗原性的有无还与序列中特定氨基酸的出现(片
段的活动性及二(三级结构的构象有关)!"*本研究
根据
=CD!
蛋白抗原指数(可及性(亲水性!选取了
抗原指数较高但表面可及性及亲水性稍差的
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指数以及亲水性指数均较高的
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片段
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并在大肠杆菌中进行高效表达在获得浓度较高的
重组
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蛋白后!以重组蛋白作为抗原免疫家
兔!成功地制备了
!
种
D/=CD!
多克隆抗体比较
发现以抗原指数(表面可及性指数和亲水性指数均
较高的
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体效果较好!效价高且特异性强!而抗原指数较高但
表面可及性及亲水性稍差的
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片段为抗
原所获得的多克隆抗体效果较差!说明抗体的制作
效果优劣与抗原区域的选择有关同时!这两段抗
原序列和其它
D/=CD
蛋白相应序列的一致性较
低!也在一定程度上保证了抗体的特异性
本研究利用
D/=CD!
多克隆抗体从蛋白水平
上分析得知该蛋白在水稻花药(愈伤组织(小穗中均
有表达!暗示了
D/=CD!
可能与水稻的生殖发育有
关!对下一步研究方向具有重要的指导意义接下
来本研究会利用相关植物基因工程技术!制备
D/)
=CD!
表达量上调或下调的转基因植株!研究和分
析对水稻发育的影响因此!
D/=CD!
多克隆抗体
的制备!为进一步研究
D/=CD!
在水稻中的表达模
式及其生物学功能奠定了基础
参考文献!
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