全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学资助项目"
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%"-#-!-
#&高等学校博士学科点专项科研基金"
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%
$
#
作者简介$闫素丽"
#&!(
#!女!在读博士研究生!主要从事植物生理生态学研究
2)34/5
$
6
41075/!""*
!
#!+,893
"
通信作者$沈应柏!教授!博士生导师!主要从事植物生理生态学研究
2)34/5
$
6
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!
:
.
=7,<>7,81
$%&
诱导的拟南芥保卫细胞
(
)
*
)
积累
与质膜
(
+
,-./0%
的关系
闫素丽!董杉杉!张瑞鑫!沈应柏"
"北京林业大学 生物科学与技术学院!北京
#"""%
#
摘
!
要$茉莉酸类物质"
?@0
#作为与昆虫啃噬及损伤相关的植物激素和信号分子在植物防御反应中起重要作用!但
是茉莉酸引起的早期防御反应的机理仍不清楚该研究以拟南芥叶片保卫细胞为材料!结合非损伤微测"
ABC
#
及激光共聚焦技术探讨了茉莉酸诱导的保卫细胞中质膜
D
E
)@CF40<
与
D
!
G
!
积累的调控关系结果表明$茉莉
酸甲酯"
B#处理导致
D
E迅速跨膜外排和
D
!
G
!
积累!
D
E外排和
D
!
G
!
积累能够被钒酸钠抑制!而二苯基碘
"
HFI
#处理则对
B诱导的
D
E跨膜外排无显著影响研究结果证明!在
B诱导的早期信号事件中!质膜
D
E
)@CF40<
的激活先于
D
!
G
!
的产生
关键词$茉莉酸&质膜
D
E
)@CF40<
&
D
!
G
!
中图分类号$
J&$*,-
文献标志码$
@
1%2/3#"405#
6
"7(
)
*
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889:92/3#"4/4!.$(
+
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2
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HGAML;410;41
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Q
/845L8/<18<041>C<8;1959
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T9U<0VU
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W1/X6
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/1
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?403914V<
!
48V40/10<8V;Y971>/1
Q
U<54V<>
Z
541V;9U391<
!
Z
54
6Z
/X9V45U95<0/1
Z
541V
><=<10<41>>Z
3<1V,D9Y!
V;<3<8;41/039=
Z
541V><=<1078<>:
6
B0V7>/<0
Z
U<5/3/14U
6
UQ
754V/91U<54V/910;/
Z
:E
)@CF40<41>D
!
G
!
48873754V/91,
[<0;9Y<>V;4V
$
BV;E
)@CF40<=/U0V5
6
!
Y;/8;U<075V<>V;E
<==57P97V9=8<541>
8
6
V9095/845\45/1/]4V/91,T7UV;!
V;6
V9095/8
Z
D48V/X4V<>V;40<
!
Y;/8;
Z
U939)
V<>V;<48873754V/919=D
!
G
!
,C;<0QQ
<0V<>V;4VV;<48873754V/919=D
!
G
!
YQ
754V<>:
6
FB D
E
)@CF40<
!
Y;/8;Y975>:<1<=/V
Z
541V0=9U><=<1>/1
Q
4
Q
4/10V/10<8V4VV48\41>
Z
4V;9
Q
<1/1=<8V/91,
?%
@
A"$
.
403914V<
&
FB D
E
)@CF40<
&
D
!
G
!
!!
茉莉酸类"
?@0
#物质是包含茉莉酸及其衍生物
"
?@
!
B#的一类脂溶性物质!广泛分布于植物的
幼嫩组织(花和发育的生殖器官中!是植物体内起整
体调控作用的植物激素茉莉酸类物质调控植物生
长发育的多个过程!如植物生长(果实成熟(块茎生
成及衰老等)#*作为信号分子!茉莉酸在抵御昆虫
取食(病原菌侵染等植物防御反应中起关键作用
当遭受昆虫啃噬或其它环境胁迫时!植物合成
并积累茉莉酸)!)%*大量研究证实茉莉酸信号通过
RGOGA@CIA2IAL2ALICI^ 2#
"
RGI#
#
)
$)+
*感知并
招募
?403914V934/1
"
?@N0
#
)
-
*蛋白泛素
化!而后
?@N0
蛋白通过
!+L
蛋白酶体降解!导致下
游多种转录因子释放))&*并调控下游信号级联反应
及各个转录因子调节的防御应答!诱导相关防御基
因的表达使用茉莉酸处理植物后!多种蛋白表达
发生显著变化!从而增强植物的防御反应!其中包括
蛋白酶抑制剂(多酚氧化酶(过氧化物酶(光合作用
相关的酶等)#"*但有关植物感知茉莉酸并导致这
些防御反应的早期信号事件目前仍不清楚
研究表明!活性氧"
OGL
#尤其是过氧化氢
"
D
!
G
!
#作为重要的信号分子参与植物的生长发育
及对各种逆境的响应)##)#!*植物细胞的叶绿体(线
粒体和质膜等是活性氧产生的主要场所!但在植物
响应逆境时!质膜
A@HFD
氧化酶也参与调控了
OGL
的产生)#%*茉莉酸处理植物导致
D
!
G
!
增加!
且
D
!
G
!
的增加可能与胞质
Z
D
的升高有关)#$*
质膜
D
E
)@CF40<
通过将质子从质膜内侧泵到
外侧维持植物细胞
Z
D
相对稳定!同时产生跨质膜
的
D
E电化学势梯度为其它各种离子及代谢产物的
次级运输提供动力有研究证实!茉莉酸处理绿豆
根
#;
后质膜
D
E
)@CF40<
活性显著增强!
%;
后活
性达到最高值)#**&合作杨细胞经茉莉酸诱导后!
D
E
迅速跨膜外排)#+*!且可能由质膜
D
E
)@CF40<
被激
活所导致由于茉莉酸激活了质膜
D
E
)@CF40<
!且
诱导产生
D
!
G
!
!同时
D
!
G
!
产生受胞内
Z
D
影响!
因此推测质膜
D
E
)@CF40<
影响了胞内
D
!
G
!
的合
成但这一推测仍缺乏相关的实验证据
因此!本试验以拟南芥"
!"#$%&
(
)%)*+#,%#-#
!
R95"
#叶片保卫细胞为材料!研究茉莉酸信号途径
中质膜
D
E
)@CF40<
与
OGL
积累的调控关系!证实
茉莉酸诱导的
D
!
G
!
产生和积累受质膜
D
E
)@C)
F40<
的调控对揭示植物细胞对茉莉酸的识别机
理及茉莉酸介导的植物对昆虫的响应具有一定
意义
#
!
材料和方法
B,B
!
材料培养及处理
B,B,B
!
材料培养
!
将经
$_
储藏的拟南芥种子播
种在营养土
`
蛭石为
#`#
的基质中!在光周期为
#+;
光照(
;
黑暗的拟南芥培养箱中培养
$
"
*
周培养箱中温度为
!!_
!相对湿度为
+"a
!光照
强度为
#*"
#
395
+
3
(!
+
0
(#

B,B,)
!
样品制备
!
将培养
$
"
*
周的拟南芥叶片表
皮轻轻撕下!固定在
%*33
培养皿底部!加入测试
液"
,#395
%
bcR5
!
",#3395
%
bR4R5
!
!
",#3395
%
bB
Q
R5
!
!
",*3395
%
bA4R5
!
",%3395
%
b B2L
!
",!3395
%
bA4
!
LG
$
!
Z
D+,*
#平衡
!"3/1

B,B,C
!
样品处理
!
实验处理分为三组!第一组为拟
南芥叶片保卫细胞经
!*
#
395
%
b
茉莉酸甲酯"
B<)
?@
#瞬时处理后!或用
#3395
%
b
质膜
D
E
)@CF40<
抑制剂钒酸钠"
A4
%
G^
$
#预处理
%"3/1
后再用
!*
#
395
%
bB瞬时处理!测定其
D
E离子流(胞质
Z
D
第二组为拟南芥叶片保卫细胞经
!*
#
395
%
b
B处理后!或
#3395
%
bA4
%
G^
$
预处理后再经
B处理!测其胞质
D
!
G
!
积累第三组为拟南
芥叶片经质膜
A@HFD
氧化酶抑制剂二苯基碘"
>/)
Z
;<1
6
5<191/73
!
HFI
#预处理后!再用
B瞬
时处理测
D
E 离子的流变化各组的对照分别为
B处理前的
D
E
!胞质
Z
D
和
D
!
G
!
值
B,)
!
测定指标及方法
BD)DB
!
(
+离子流测定
!
D
E离子流速测定采用非
损伤微技术"
A91)/1X40/Xd
7<
!
ABC
#"
SIG)IB
!
ABC
系统!美国杨格公司#
!
#
"
D
E电极制作过程
!
首先将灌充液"
D
E
$
"
3395
%
bcD
!
FG
$
!
#*3395
%
bA4R5
!
Z
D-,"
#注入
经过硅烷化处理(尖端直径为
$
"
+
#
3
的玻璃微电
极"旭月"北京#科技有限公司#前端!然后在选择性
离子电极制备装置下将电极前端装入
!*
#
3
左右
的选择性离子交换剂"
bIe
#制作好的电极通过氯
化的
@
Q
%
@
Q
R5
电极固定架与放大器相连
!"电极校正
!
测量前!制作好的电极要进行校
正校正液为
Z
D+,"
和
Z
D-,"
的测试液"
",#
3395
%
b cR5
!
",# 3395
%
b R4R5
!
!
",# 3395
%
b
B
Q
R5
!
!
",*3395
%
bA4R5
!
",%3395
%
bB2L
!
",!
3395
%
bA4
!
LG
$
#!校正斜率在
*%
"
+%3^
%
59
Q
之
间的电极可以用于实验
!
%
"
D
E离子流测量过程
!
向样品中加入
%3b
测试液!在显微镜下找到形态良好的保卫细胞!缓慢
放下电极并通过三维运动系统将电极移动到细胞上
方
!
"
*
#
3
处!放入参比电极开始测试采样规则
为
#"
#
3
!采样频率
",!D]
开始测试后首先进行
*3/1
背景电位测量!再加入
%3b
终浓度为
!*
#
395
%
b
的
B!立即测量观察并记录
D
E离子
流的计算采用公式为$
.f/
#
)
0
E
*
E1
*
"
213
%
4
#
#
#
)
0
E
*
#
5
式中!
.
为离子流速"
#
395
+
83
(!
+
0
(#
#!
/
为质子
的扩散系数"
&,!!g#"
(*
83
!
+
0
(#
#!)
D
E
*为测得
&&!
!
期
!!!!!!!!
闫素丽!等$
B诱导的拟南芥保卫细胞
D
!
G
!
积累与质膜
D
E
)@CF40<
的关系
的质子浓度差"
Z
395
+
3b
(#
#!
4
#
为
:7==的酸解
离常数!
$
5
为采样规则"
83
#!本文中采样规则为
#"
#
3

BD)D)
!
胞质
6
(
及
1*E
测定
!
保卫细胞胞质
Z
D
及
OGL
测定参照
L7;/V4
等)#$*的方法将培养
$
"
*
周的拟南芥表皮固定在激光共聚焦皿底部!用
%"
3395
%
bcR5
和
#"3395
%
b B2L
"
Z
D+,*
#光下
"
#*"
#
395
+
3
(!
+
0
(#
#孵育
!;
!然后加入
#"
#
395
%
bSR2RT)@B
"细胞质
Z
D
荧光探针#或
*"
#
395
%
bD
!
HRTH@
"
OGL
荧光探针#避光孵育
#"
3/1
!装载好荧光探针的样品用测试液轻轻冲洗
!
次!以去掉多余的荧光探针做好的样品在激光共
聚焦显微镜"
b#下观察并拍照记为对
照以后加入终浓度
!*
#
395
%
bB!每隔
*3/1
扫描
#
次!连续扫描
%"3/1
利用
bZZ
5/84)
V/91L7/V@>41X418计算每
个细胞的荧光强度!每个数据代表至少
!"
个保卫细
胞的平均荧光强度
B,C
!
数据分析
实验中所得到的离子流速(
Z
D
及
OGL
数据用
LFLL!"
软件检测各处理间的差异显著性多重比
较采用
bLH
(
H711或独立样本
*
检验
!
!
结果与分析
)DB
!
$%&
对拟南芥保卫细胞跨膜
(
+离子流的影响
图
#
显示!
B处理前!拟南芥保卫细胞的跨
膜
D
E处于微弱外流的状态!且内外流保持平衡&当
保卫细胞受
!*
#
395
%
bB刺激后!
D
E迅速跨膜
外流!
*3/1
后
D
E离子流缓慢恢复到处理前水平
#3395
%
b
钒酸钠预处理后的保卫细胞
D
E流速稍
低于未处理的细胞!这是由于质膜
D
E
)@CF40<
被
抑制后!
D
E外排减少所致而向测试液中加入终
浓度为
!*
#
395
%
b
的
B后!
D
E外排受到明显
抑制这说明
B诱导的
D
E跨膜外排是由质膜
D
E
)@CF40<
介导的
整合离子流可以反映某种离子进出细胞的情
况如图
!
整合离子流结果显示!
B处理拟南芥
保卫细胞后!
D
E整合离子流显著升高"
6
$
","*
#!说
明
B诱 导 大 量
D
E 跨 膜 外 排
# 3395
%
b
A4
%
G^
$
预处理细胞后的整合
D
E离子流显著降低
"
6
$
","*
#!而
A4
%
G^
$
预处理后的细胞再经
B处理!
D
E也无显著外排这也说明
B诱导的
D
E外排是由质膜
D
E
)@CF40<
介导的为进一步
证实此实验结果!我们通过激光共聚焦技术检测了
B对细胞质
Z
D
的影响!结果表明
B诱导
了拟南芥保卫细胞胞质
Z
D
升高!而钒酸钠则抑制
了胞质
Z
D
升高"图
%
!
@
#图
%
!
S
为装载有
SR2RT
图
#
!
B瞬时处理对拟南芥保卫
细胞跨膜
D
E离子流的影响
正值代表外排!负值代表内流!箭头代表
B加入时间&
每个点代表至少
*
个保卫细胞的
D
E流速平均值&误差线
代表
*
个细胞
D
E离子流速平均值的标准误差图
*
同
T/
Q
,#
!
2==<8V9=BE
=57P
/1!7*+#,%#-#
Q
74U>8<50
C;<
Z
90/V/XZ
U<0<1V<==57P
!
41>1<
Q
4V/X<91<00V41>=9U
V;Z
U<0<1VV;>/1
Q
B248;X457Z
U<0<1VV;<3<41X457<9=D
E
=57P4V5<40V*
/1><
Z
<1><1V
Q
74U>8<50,2UU9U:4U0U<
Z
U<0<1V0V;<0V41>4U>
E
=57P/1V;<0<8<50,C;<043<40T/
Q
,*
图
!
!
B诱导的拟南芥保卫细胞中
D
E整合离子流
不同大写字母表示处理间在
","#
水平存在显著差异&
误差线代表细胞整合离子流的标准误差"
1f*
#&图
+
同
T/
Q
,!
!
C;Q
U4V<>D
E
=57P/1>78<>:
6
B/1!7*+#,%#-#
Q
74U>8<50
C;<>/==Z
/V455/84V<0/
Q
1/=/841V>/==4V","#5Z
U<0<1VV;<0V41>4U>"
LH
#
9=
V;Q
U4V<>D
E
=57P/1V;<0<8<50
"
1f*
#
,C;<043<40T/
Q
,+
""%
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
%
!
B对拟南芥保卫细胞胞质
Z
D
变化的影响
@,B处理后
SR2RT
荧光的相对增长量将
B处理前的荧光值标准化为
"
!每个值代表至少
!"
个细胞
荧光值的均值!误差线代表这些细胞的标准误差
S,
装载
SR2RT@B
荧光探针的拟南芥保卫细胞胞质
Z
D
荧光观察
T/
Q
,%
!
R
6
V9095/8
Z
D8;41
Q
<0/1>78<>:
6
BQ
74U>8<50
@,C;<=579U<08<186
:<=9UQ
4U><>40",248;X457Z
U<0<1V0V;<4XQ
<
=579U<08<18Z
U<0<1VV;<0V41>4U>E
=57P/1V;<0<8<50,
S,C;Z
U<0<1V4V/XQ
<09=V;<
Q
74U>8<50594><>SR2RT@B=579U<08<1V
Z
U9:<:<=9U<41>4=V图
$
!
B对拟南芥保卫细胞胞质
D
!
G
!
的影响
@,B及钒酸钠处理后
D
!
HRTH@
荧光的相对增长量
B处理前的细胞质
D
!
G
!
荧光标准化为
"
图中每个点代表至少
!"
个细胞荧光值的平均值误差线代表
!"
个细胞的标准误差&
S,
装载
D
!
HRTHB
荧光探针的拟南芥保卫细胞
D
!
G
!
荧光观察
T/
Q
,$
!
C;<<==<8V9=B!
G
!
/1!7*+#,%#-#
Q
74U>8<50
@,C;<=579U<08<186
:<=9UQ
4U><>40",248;X457Z
U<0<1V0V;<4XQ
<=579U<08<18<
9=4V5<40V!"8<50,2UU9U:4U0U<
Z
U<0<1VV;<0V41>4U>E
=57P/1V;<0<8<50,S,C;Z
U<0<1V4V/XQ
<0
9=V;<
Q
74U>8<50594><>D
!
HRTHB=579U<08<1V
Z
U9:<:<=9U<41>4=V@B
荧光探针的保卫细胞经
B处理前后的荧光
图像
)D)
!
$%&
对拟南芥保卫细胞
(
)
*
)
积累的影响
装载有
D
!
HRT)H@
荧光探针的保卫细胞经
!*
#
395
%
bB处理后!保卫细胞内
D
!
G
!
含量持续
上升!处理
#*3/1
时达到最大值&而
#3395
%
b
钒
酸钠预处理则显著抑制了
B诱导
D
!
G
!
积累
"图
$
!
@
(
S
#这说明
B促进了保卫细胞
D
!
G
!
的产生和积累!且
D
!
G
!
的产生和积累能够被钒酸
钠抑制此结果也暗示了质膜
D
E
)@CF40<
与
D
!
G
!
存在调控关系
)DC
!
质膜
FG.(
氧化酶抑制剂
G.H
对
(
+离子
流的影响
为进一步研究质膜
D
E
)@CF40<
与质膜
A@H)
FD
氧化酶的调控关系!我们检测了质膜
A@HFD
氧化酶抑制剂
HFI
预处理拟南芥保卫细胞后
B对保卫细胞
D
E离子流的影响结果显示!
HFI
预
处理保卫细胞后!
B诱导的
D
E外排与未经
HFI
处理的保卫细胞
D
E离子流保持一致"图
*
#整合
离子流也显示出类似的结果"图
+
#!
HFI
预处理拟
南芥保卫细胞对
B诱导的
D
E跨膜外排无显著
影 响以上结果说明
B诱导的早期信号事件
#"%
!
期
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B诱导的拟南芥保卫细胞
D
!
G
!
积累与质膜
D
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)@CF40<
的关系
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HFI
对
B诱导的拟南芥保卫细胞
D
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)@CF40<
的激活先与
D
!
G
!
的产生
%
!
讨
!
论
在植物与昆虫共同进化的过程中!植物进化出
了一套精密的机制来有效抵御昆虫的危害)#-)#*昆
虫取食植物后!植物可以释放多种挥发物来吸引昆
虫天敌(驱避食草动物(进行植株间通讯等)#&)!"*茉
莉酸类物质是研究较多的一类植株间通讯的信号分
子)!#*!能够激发植物防御基因的表达!并诱导化学
防御的产生但是茉莉酸诱导的早期防御信号的传
导还不太清楚
D
E是质膜上多重离子交换通道的
离子交换物质!对维持质膜内正外负的膜电位起至
关紧要的作用
D
E跨膜外排建立的电化学势差为
其它电压门控离子通道的打开及代谢产物的次级运
输提供了动力本研究发现外源
B诱导胞质内
的
D
E迅速跨膜外排!并伴随着胞质碱化!同时
D
E
的跨膜外排被质膜
@CF40<
抑制剂钒酸钠抑制!这
表明
B激活质膜
D
E
)@CF40<
促进了
D
E跨膜
外排!并导致了胞质碱化胞质碱化作为第二信使
可能诱导气孔关闭)#$!!*这对于逆境胁迫下植物
保护体内水分平衡!防止病原菌侵染具有重要意义
但是在本研究中!
B诱导的
D
E跨膜外排持续
了
*3/1
左右!而在检测的
%"3/1
内!胞质
Z
D
持续
上升!这可能与
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E
)@CF40<
(
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*及一些代谢产物有关但是其具体机制有
待于进一步研究
活性氧"
OGL
#是植物
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信号传导过程中的一
个重要组分
OGL
可以在植物的叶绿体(线粒体或
者过氧化物酶体中产生!但是当植物响应激素刺激
时!质膜
A@HFD
氧化酶参与了
OGL
的产生)#%*
在保卫细胞中!
B诱发
OGL
的产生和积累!
OGL
积累反过来又激活质膜上超极化依赖的
R4
!E
离子通道)!$)!**!导致细胞内
R4
!E含量升高!并触发
阴离子流入细胞!从而完成电信号的传递并最终导
致气孔关闭)!+*在本研究中!外源
B诱导细胞
质中快速积累
D
!
G
!
!而
D
!
G
!
的积累可被钒酸钠抑
制!这表明质膜
D
E
)@CF40<
是
B诱发的
D
!
G
!
积累事件的必要条件一种可能的机制是
B激
活质膜
D
E
)@CF40<
促进
D
E 跨膜外排!引起胞质
Z
D
的升高!进而促进了
D
!
G
!
的积累即
D
!
G
!
的
产生受质膜
D
E
)@CF40<
的调控这与
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)
#$
*和
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!$
*等的研究结果相似
考虑到逆境胁迫下质膜
A@HFD
氧化酶参与
OGL
的产生!本实验结果也暗示了质膜
A@HFD
氧
化酶与质膜
D
E
)@CF40<
之间存在某种关系由于
D
!
G
!
的积累被质膜
@CF40<
抑制剂钒酸钠抑制!
而
D
E的跨膜外排没有受到
A@HFD
氧化酶抑制剂
HFI
影响说明拟南芥保卫细胞响应
B的过程
中!质膜
D
E
)@CF40<
的激活先于
A@HFD
氧化酶
综上所述!拟南芥保卫细胞在响应
B过程
中!质膜
D
E
)@CF40<
首先被激活!导致
D
E迅速跨
膜外排!伴随着胞质碱化细胞质碱化参与调控了
D
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的产生
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