全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(４): ４３８￣４４２(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０７￣１６ꎻ 修回日期: ２０１５￣０４￣２２
基金项目: 国家自然科学基金(３１２７１７８７)ꎻ河北省自然科学基金(Ｃ２０１３３０１０３７)
通讯作者: 李志勇ꎬ副研究员ꎬ主要从事谷子病害研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｌｉｚｈｉｙｏｎｇｄｓ＠１２６.ｃｏｍ
董志平ꎬ研究员ꎬ主要从事谷子病害研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｄｚｐｉｎｇ００１＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０４.０１３
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研究简报
谷子锈菌巢式 ＰＣＲ检测体系的建立
王 楠１ꎬ ２ꎬ 李志勇１∗ꎬ 董 立 １ꎬ 白 辉１ꎬ 朱彦彬１ꎬ 全建章１ꎬ 董志平１∗
( １河北省农林科学院谷子研究所 /河北省杂粮重点实验室 /国家谷子改良中心ꎬ石家庄 ０５００３５ꎻ
２河北师范大学生命科学学院ꎬ石家庄 ０５００２４ꎻ)
Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ ｏｆ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ 　
ＷＡＮＧ Ｎａｎ１ꎬ ２ꎬ ＬＩ Ｚｈｉ￣ｙｏｎｇ１ꎬ ＤＯＮＧ Ｌｉ１ꎬ ＢＡＩ Ｈｕｉ１ꎬ ＺＨＵ Ｙａｎ￣ｂｉｎ１ꎬ ＱＵＡＮ Ｊｉａｎ￣ｚｈａｎｇ１ꎬ ＤＯＮＧ
Ｚｈｉ￣ｐｉｎｇ１ 　 ( １Ｍｉｌｌｅｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｈｅｂｅｉ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ / Ｍｉｎｏｒ Ｃｅｒｅａｌ Ｃｒｏｐｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｈｅｂｅｉ
Ｐｒｏｖｉｎｃｅ / Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｆｏｘｔａｉｌ Ｍｉｌｌｅｔ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ Ｃｅｎｔｅｒꎬ Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５００３５ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ Ｈｅｂｅｉ Ｎｏｒｍａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｓｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇ ０５００２４ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｈｅ ｒＤＮＡ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｐａｃｅｒ ( ＩＧＳ) ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｗｉｔｈ
ｒＤＮＡ￣ＩＧＳ１ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ. Ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ＩＧＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅꎬ ｔｗｏ ｐａｉｒｓ ｏｆ ｓｐｅｃｉｅｓ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｓｉｇｎｅｄ.
Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒｓꎬ ａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｎｄ ｏｆ ２０３ ｂｐ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ａｌｌ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ ａｎｄ
ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｌｅａｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ. Ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ １ ０００
ｔｉｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔꎻ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅꎻ ＩＧＳꎻ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０４￣０４３８￣０５
　 　 由粟单胞锈菌(Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ)引
起的谷子锈病是一种危害严重的真菌性病害ꎬ该病
可在短期内大面积流行ꎬ通常导致减产 １０％ ~
３０％ꎮ 谷子锈病病原菌 Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅꎬ属担子
菌亚门(Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔｉｎａ)、柄锈菌科(Ｐｕｃｃｉｎｉａｃｅ￣
ａｅ)、单胞锈菌属(Ｕｒｏｍｙｃｅｓ)ꎬ是一种多孢型转主
寄生真菌[１]ꎮ
　 　 在真核生物的核糖体 ＤＮＡ( ｒＤＮＡ)中ꎬ编码区
保守性较强而非编码区具有较大的可变性ꎬ是进行
真菌分类的有效序列ꎮ 在非编码区ꎬ相对于核糖体
基因内转录间隔区( ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ)ꎬｒＤＮＡ 基因间隔
区 ＩＧＳ( ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｐａｃｅｒ )变异性更高ꎬ是真菌内
进行种间比较和分类的重要 ＤＮＡ 片段[２]ꎮ 本研
究基于真菌 ＩＧＳ 区域ꎬ设计了检测谷子锈菌的巢
式 ＰＣＲ特异性引物ꎬ为快速、准确的检测谷子锈菌
提供了技术支持ꎬ对谷子锈病的早期诊断和监测具
有重要意义ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 供试菌株:谷子锈菌(Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ)、谷
子白发病菌( Ｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ)、谷瘟病菌
(Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｓｅｔａｒｉａｅ)、谷子纹枯病菌(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ
ｓｏｌａｎｉ)、粟粒黑穗病菌(Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｃｒａｍｅｒｉ)、粟胡麻
斑病菌(Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｅｔａｒｉａｅ)、粟弯孢霉病菌(Ｃｕｒｖｕ￣
ｌａｒｉａ ｌｕｎａｔａ)、粟灰斑病菌(Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｅｔａｒｉａｅ)ꎬ
　
　 ４期 王 楠ꎬ等:谷子锈菌巢式 ＰＣＲ检测体系的建立
均由本实验室提供ꎮ
　 　 供试谷子品种:豫谷 １号ꎬ由本实验室提供ꎮ
１.２　 ＤＮＡ的提取
　 　 采用 ＣＴＡＢ 法[３]提取供试菌株基因组 ＤＮＡ
以及植株叶片基因组 ＤＮＡꎮ
１.３　 ｒＤＮＡ￣ＩＧＳ区的 ＰＣＲ扩增及测序
　 　 使用真核生物 ｒＤＮＡ￣ＩＧＳ１ 通用引物 ＬＲ１２Ｒ
(５′￣ＣＴＧＡＡＣＧＣＣＴＣＴＡＡＧＴＣＡＧＡＡ￣３′)和 ５ＳＲＮＡ
(５′￣ＡＴＣＡＧＡＣＧＧＧＡＴＧＣＧＧＴ￣３′)扩增谷子锈菌
的 ｒＤＮＡ￣ＩＧＳ区域ꎮ ＰＣＲ反应体系为:２５.０ μＬꎬ其
中 ２ × Ｔａｑ ＭａｓｔｅｒＭｉｘ １２. ５ μＬꎬ上、下游引物 １０
μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１各 １.０ μＬꎬＤＮＡ模板 １.０ μＬꎬｄｄＨ２Ｏ ９.５
μＬꎻ反应程序为:９４℃ ５ ｍｉｎꎻ９４℃ ３０ ｓꎬ５６℃ ３０ ｓꎬ
７２℃ １ ｍｉｎꎬ３５ 个循环ꎻ７２℃ １０ ｍｉｎꎮ 扩增产物电
泳分析后回收特异片段送上海生工测序ꎮ
１.４　 ＩＧＳ序列同源性分析
　 　 对测序结果处理分析后ꎬ使用 ＣｌｕｓｔａｌＸ １.８１将
谷锈菌 ＩＧＳ序列与其他同源性较高的序列进行多
重比对ꎬ最后用ＭＥＧＡ ５.０ 软件的邻接法进行系统
进化树的构建ꎮ
１.５　 特异性引物设计
　 　 根据 ＩＧＳ 基因序列ꎬ通过 Ｐｒｉｍｅｒ Ｐｒｅｍｉｅｒ ５.０
设计两对特异性引物 Ｕｒｓ１￣Ｆ / Ｕｒｓ１￣Ｒ 和 Ｕｒｓ２￣Ｆ /
Ｕｒｓ２￣Ｒꎬ分别作为巢式 ＰＣＲ 扩增的外侧和内侧引
物对ꎬ 序列分别为: Ｕｒｓ１￣Ｆ: ５′￣ＧＣＣＴＣＴＡＡＧＴ￣
ＣＡＧＡＡＴＣＣＧＴＧＣ￣３′ꎻ Ｕｒｓ１￣Ｒ: ５′￣ＧＡＣＧＧＧＡＴ￣
ＧＣＧＧＴＡＡＧＴＴＣＡ￣３′ 和 Ｕｒｓ２￣Ｆ:５′￣ＣＧＴＧＣＡＴＣＴ￣
ＴＡＴＡＡＡＴＧＴＧＴＣＡ￣３′ꎻ Ｕｒｓ２￣Ｒ: ５′￣ＡＧＴＧＧＡＴＣＧ
ＴＡＧＣＡＡＣＡＡＧＧ ￣３′ꎮ
１.６　 引物特异性检测
　 　 以引物对 Ｕｒｓ２￣Ｆ / Ｕｒｓ２￣Ｒ 对谷子锈菌以及谷
子上其他真菌的基因组 ＤＮＡ 进行扩增ꎬ检测其特
异性ꎮ 以无菌水作为阴性对照ꎮ ＰＣＲ 反应体系与
程序同前ꎬ仅退火温度变为 ５３℃ꎮ 反应结束后进
行电泳检测ꎮ
１.７　 特异性引物灵敏度检测
　 　 将菌株基因组 ＤＮＡ浓度调整为 １０ μｇ􀅰μＬ￣１ꎬ
并按 １０倍梯度依次稀释为 １ μｇ􀅰μＬ￣１、１００ ｎｇ􀅰μＬ￣１、
１０ ｎｇ􀅰μＬ￣１、１ ｎｇ􀅰μＬ￣１、１００ ｐｇ􀅰μＬ￣１和 １０ ｐｇ􀅰μＬ￣１ꎬ
分别取１ μＬ作为灵敏度检测的模板ꎬ以Ｕｒｓ２￣Ｆ/ Ｕｒｓ２￣Ｒ
为引物进行 ＰＣＲ反应ꎮ 反应结束后进行电泳检测ꎮ
　 　 此外ꎬ以 Ｕｒｓ１￣Ｆ / Ｕｒｓ１￣Ｒ 和 Ｕｒｓ２￣Ｆ / Ｕｒｓ２￣Ｒ 组
合进行巢式 ＰＣＲ反应ꎮ 首先以梯度稀释标准品为
反应模板ꎬＵｒｓ１￣Ｆ / Ｕｒｓ１￣Ｒ 为第一轮 ＰＣＲ 反应引
物ꎬ进行常规 ＰＣＲ 反应ꎮ 第一轮扩增产物用水稀
释 ２０倍后作为第二轮扩增模板ꎬ以 Ｕｒｓ２￣Ｆ / Ｕｒｓ２￣Ｒ
为引物进行第二轮 ＰＣＲ扩增ꎮ 反应结束后进行电
泳检测ꎮ
１.８　 发病谷子叶片中锈菌的检测
　 　 无菌栽培 １５ 盆谷子感病品种豫谷 １ 号ꎬ每盆
５株苗ꎬ在培养箱中(温度 ２８℃ꎬ湿度 ６０％ꎬ光照 １４
ｈ􀅰ｄ￣１ꎬ光强 ６ ０００ ｌｕｘ)培养至谷子幼苗长到 ６ ~ ７
叶期时用于试验ꎮ 将谷子锈菌夏孢子配成 ５×１０６
个孢子􀅰ｍＬ￣１的孢子悬浮液ꎬ均匀的喷洒在叶片
上ꎬ黑暗条件下 ２８℃保湿 ４８ｈ 后置于培养箱中继
续培养ꎮ 在谷子接种锈菌 １、２、３、４和 ５ｄ后分别采
集谷子叶片样本ꎬ每盆采集 １ 片叶子ꎬ共 １５ 片ꎬ作
为１个重复ꎬ总共设置 ３ 个重复ꎮ 将各时间点采集
的叶片样本提取总 ＤＮＡꎬ 然后分别以提取的 ＤＮＡ
为模板进行 ＰＣＲ扩增ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＩＧＳ序列同源性分析
　 　 使用 ＩＧＳ通用引物从谷子锈菌基因组中扩增
出一条 ７２０ ｂｐ 左右的条带ꎬ 并且测序结果
(ＧｅｎＢａｎｋ登录号:ＫＪ８０１９４２)与 ＧｅｎＢａｎｋ 中其他
锈菌 ＩＧＳ基因具有较高的同源性ꎮ 构建的系统进
化树(图 １)显示ꎬ谷子锈菌与柄锈菌科的屈恩柄锈
菌(Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｋｕｅｈｎｉｉ)相似度最高ꎮ 而黑顶柄锈菌
(Ｐ. ｍｅｌａｎｏｃｅｐｈａｌａ ) 与瘤病菌科的柱锈菌属
(Ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ ｑｕｅｒｃｕｕｍ) 和 内 柱 锈 菌 属 ( Ｅｎｄｏ￣
ｃｒｏｎａｒｔｉｕｍ ｈａｒｋｎｅｓｓｉｉ)的两种锈菌归为另一类群ꎮ
２.２　 引物特异性检测
　 　 以引物 Ｕｒｓ２￣Ｆ / Ｕｒｓ２￣Ｒ 对不同地区的谷子锈
菌以及其他 ７ 种真菌的基因组进行 ＰＣＲ 扩增ꎮ ５
个不同地理来源的锈菌样本中均扩增得到一条
２０３ ｂｐ的条带ꎬ而在其他 ７种真菌样本及阴性对照
中均未扩增出条带(图 ２)ꎮ
９３４
　
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. １　 Ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｒｅｅ ｏｆ ＩＧＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ
Ｆｉｇ. ２　 Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ｏｆ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｉｔｈ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｐｒｉｍｅｒｓ Ｕｒｓ２￣Ｆ / Ｕｒｓ２￣Ｒ ｆｏｒ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ
ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ
Ｍ:ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒꎻ１:Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ ｆｒｏｍ Ｊｉｎａｎꎬ Ｓｈａｎｄｏｎｇꎻ２:Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ ｆｒｏｍ Ｘｉｎｘｉａｎｇꎬ Ｈｅｎａｎꎻ
３:Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ ｆｒｏｍ Ｃｈａｏｙａｎｇꎬ Ｌｉａｏｎｉｎｇꎻ４:Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ ｆｒｏｍ ＳｈｉｊｉａｚｈｕａｎｇꎬＨｅｂｅｉꎻ
５:Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ ｆｒｏｍ ＣｈｅｎｇｄｅꎬＨｅｂｅｉꎻ６:Ｓｃｌｅｒｏｓｐｏｒａ ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａꎻ７:Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ ｓｅｔａｒｉａｅꎻ８:Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉꎻ
９:Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｃｒａｍｅｒｉꎻ１０:Ｂｉｐｏｌａｒｉｓ ｓｅｔａｒｉａｅꎻ１１:Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ ｌｕｎａｔａꎻ１２:Ｃｅｒｃｏｓｐｏｒａ ｓｅｔａｒｉａｅꎻ１３:Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
２.３　 引物灵敏度检测
　 　 以 Ｕｒｓ２￣Ｆ / Ｕｒｓ２￣Ｒ 为引物进行常规 ＰＣＲ
反应时ꎬ能检测到的锈菌基因组 ＤＮＡ 下限为
１００ ｎｇ􀅰μＬ￣１(图 ３￣Ａ)ꎮ 而进行巢式 ＰＣＲ反应时ꎬ
能检测到的锈菌基因组 ＤＮＡ下限为 １００ ｐｇ􀅰μＬ￣１
(图 ３￣Ｂ)ꎮ
２.４　 发病谷子叶片中锈菌的检测
　 　 对接种 Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ １、２、３、４ 和 ５ ｄ 的
谷子叶片基因组进行巢式 ＰＣＲ 检测时ꎬ均可扩增
出一条 ２０３ ｂｐ 的特异性条带ꎬ并且随着接种时间
的延长ꎬ叶片中锈菌含量增加ꎬ而健康植株叶片及
阴性 ｄｄＨ２Ｏ对照均未扩增出条带(图 ４)ꎮ
０４４
　
　 ４期 王 楠ꎬ等:谷子锈菌巢式 ＰＣＲ检测体系的建立
Ｆｉｇ. ３　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒ ＰＣＲ ａｎｄ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ
ａ: Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｒｅｇｕｌａｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ ｂｙ Ｕｒｓ２￣Ｆ / Ｕｒｓ２￣Ｒꎻ
ｂ: Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｎｅｓｔｅｄ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ ｂｙ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ｕｒｓ１￣Ｆ / Ｕｒｓ１￣Ｒ ａｎｄ Ｕｒｓ２￣Ｆ / Ｕｒｓ２￣Ｒ.Ｍ: ＤＬ２０００ ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒꎻ １￣７: Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ
ａｒｅ １０μｇ􀅰μＬ￣１ꎬ １μｇ􀅰μＬ￣１ꎬ １００ ｎｇ􀅰μＬ￣１ꎬ １０ ｎｇ􀅰μＬ￣１ꎬ １ ｎｇ􀅰μＬ￣１ꎬ １００ ｐｇ􀅰μＬ￣１ꎬ ａｎｄ １０ ｐｇ􀅰μＬ￣１ꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
Ｆｉｇ. ４　 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ ｉｎ ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｌｅａｖｅｓ
ｏｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ (ｄｐｉ)
Ｍ: ＤＬ２０００ ｍａｒｋｅｒꎻ １￣３: Ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｌｅａｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｎ １ ｄｐｉꎻ ４￣６: Ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｌｅａｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｎ ２ ｄｐｉꎻ
７￣９: Ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｌｅａｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｎ ３ ｄｐｉꎻ １０￣１２: Ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｌｅａｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｎ ４ ｄｐｉꎻ
１３￣１５: Ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｌｅａｆ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｎ ５ ｄｐｉꎻ １６: Ｈｅａｌｔｈ ｆｏｘｔａｉｌ ｍｉｌｌｅｔ ｌｅａｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡꎻ １７: Ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ.
３　 讨论
　 　 锈病是谷子上重要的气传流行性病害ꎬ目前ꎬ
对谷锈菌(Ｕ. ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅ)的研究主要局限在
常规生物学方面[１]ꎮ 由于该病在发病初期不易发
现ꎬ故建立快速、灵敏的检测体系对病害的早期诊
断具有重要意义ꎮ 近年来ꎬＰＣＲ 技术的发展为植
物体内病原菌的快速、准确诊断提供了有效的工
具ꎮ 通过 ＰＣＲ对植物病原菌检测主要用到 ３ 类基
因序列:一是 ｒＤＮＡꎬ如 ＩＴＳ区、ＩＧＳ区等ꎻ二是保守
蛋白基因ꎬ如微管蛋白基因、延伸因子基因等ꎻ三是
未知的特异 ＤＮＡ片段ꎬ如各类分子标记等ꎮ 本研
究在将谷锈菌的 ＩＧＳ区与其他已公布的 ＩＧＳ 序列
进行同源性比对时ꎬ发现其与屈恩柄锈菌(Ｐ. ｋｕｅ￣
ｈｎｉｉ)同源性最高ꎬ但也仅为 ９０％ꎮ 这一方面说明
锈菌 ＩＧＳ序列信息比较匮乏ꎬ另一方面也说明 ＩＧＳ
区的变异性很强ꎬ即使是同科物种同源性也仅为
９０％或更低ꎮ 因此ꎬＩＧＳ区可以作为物种鉴定的重
要分子标记ꎮ
　 　 与常规 ＰＣＲ方法相比ꎬ巢式 ＰＣＲ 技术因为通
过两次 ＰＣＲ扩增ꎬ增加 ＤＮＡ 扩增片段的浓度ꎬ大
大提高了检测灵敏性ꎮ 之前研究结果表明巢式
１４４
　
植物病理学报 ４５卷
ＰＣＲ技术的灵敏性是常规 ＰＣＲ 的 １００ ~ １ ０００
倍[４ꎬ ５]ꎮ 本研究中巢式 ＰＣＲ 能够检测到的锈菌基
因组 ＤＮＡ最低浓度为 １００ ｐｇ / μＬꎬ是常规 ＰＣＲ的
１ ０００倍ꎬ使得对谷子锈菌的 ＰＣＲ扩增更加灵敏和
准确ꎮ 另外ꎬ由于巢式 ＰＣＲ的高灵敏度ꎬ能够检测
低浓度病原菌ꎬ可用于对谷子锈病流行提早做出预
警ꎬ节约时间进行提早防控ꎬ有利于谷子安全生产ꎮ
但是在实际应用中ꎬ如果植株叶片中病菌分布不均
匀ꎬ可能发生漏检ꎮ 因此ꎬ在对植株样本进行病害
诊断时ꎬ每个植株要多采集几个样品ꎬ进行重复检
测ꎬ确保检测结果准确性ꎮ
参考文献
[１] 　 Ｎａｒａｓｉｍｈａｎ Ｍ Ｊꎬ Ｔｈｉｒｕｍａｌａｃｈａｒ Ｍ Ｊ. Ｈｅｔｅｒｏｅｃｉｓｍ ｉｎ
Ｕｒｏｍｙｃｅｓ ｓｅｔａｒｉａｅ￣ｉｔａｌｉｃａｅꎬ ｔｈｅ ｒｕｓｔ ｏｎ Ｉｔａｌｉａｎ Ｍｉｌｌｅｔ
[Ｊ] . Ｍｙｃｏｌｏｇｉａꎬ １９６４ꎬ ５６(４): ５５５－５６０.
[２] 　 Ｌｉａｎｇ Ｈꎬ Ｐｅｎｇ Ｙ Ｌꎬ Ｚｈａｎｇ Ｇ Ｚꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒＤＮＡ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｓｐａｃｅｒ
( ｒＤＮＡ－ＩＧＳ) ｆｒｏｍ ｔｈｒｅｅ Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｓｐｅｃｉｅｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ(植物病理学报)ꎬ
２００６ꎬ ３６ (５): ４０７－４１２.
[３] 　 Ｗａｎｇ Ｑꎬ Ｈａｎ Ｃ Ｇꎬ Ｌｉ Ｄ Ｗꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｙｘａ
ｂｅｔａｅ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｍｙｃｏｓｙｓｔｅｍａ(菌物系统)ꎬ
１９９９ꎬ １８ (４) : ４３６－４３９.
[４] 　 Ｃｈｅｎ Ｆ Ｒꎬ Ｌｉｎ Ｔ Ｂꎬ Ｇａｎ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. ＳＣＡＲ ｍａｒｋｅｒ ａｎｄ
ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｕｓｔｉｌａｇｉｎｏｉｄｅａ ｖｉｒｅｎｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
[Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙｔｏｐｈｙｌａｃｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物保护学报)ꎬ
２０１３ꎬ ４０(６): ４８１－４８７.
[５] 　 Ｗａｎｇ Ｊꎬ Ｂｉ Ｙꎬ Ｚｈｕ Ｙꎬ ｅｔ ａｌ. Ｎｅｓｔｅｄ￣ＰＣＲ ｒａｐｉｄｌｙ
ｄｅｔｅｃｔｅ Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ. ｃｉｔｒｕｌｌｉ ｆｒｏｍ
ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｓｅｅｄｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ｓｃｉｅｎｔｉａ Ａｇｒｉｃｕｌ￣
ｔｕｒａ Ｓｉｎｉｃａ(中国农业科学)ꎬ ２０１４ꎬ ４７(２): ２８４－２９１.
责任编辑:曾晓葳
２４４