全 文 ：书西北植物学报!
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&修改稿收到日期$!"#$*"1*"&
基金项目$国家自然科学基金" %#!,"%1( #&国家科技支撑计划" !"#"234"#2"! & !"##234#%2"& #&江苏省科技支撑计划" 25!"#!%!, #&江苏 省农业科技自主创新计划" 67 " #" # "%" & 67 " ## # "!( # 作者简介$翟丽娜"
#&&")
#!女!在读硕士研究生!主要从事油菜基因功能研究
5*89.:
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!
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"
通信作者$管荣展!博士!教授!博士生导师!主要从事油菜遗传育种的研究 5*89.:$
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0
-
9@+BC@+=0
甘蓝型油菜
%/12!
基因的克隆及表达分析
翟丽娜!楚
!
璞!管荣展"
"南京农业大学 作物遗传与种质创新国家重点实验室!南京
!#""&
#
摘
!
要$利用同源克隆法从甘蓝型油菜中获得了 # 个类成束阿拉伯半乳聚糖蛋白基因" !"# #!命名为$%!"#

$%!"# 基因开放阅读框长为 #!""D E !编码 %&& 个氨基酸!分子量为$!11+&49
!等电点为
(+%,
预测的
20FG3
蛋白包含
H*
端信号肽(
!
个
3IJ*:.KB
结构域(
!
个
L9/=.=:.0*:.KB
结构域和
6*
端
IJM*90=<>A
序列系统进化分析表
明
20FG3
氨基酸序列与
2AFG3#,
和
3NFG3!
进化关系较近!一致性分别为
&1O
和
1,O

P
QR*J6Q
分析表明!
$%!"# 基因在油菜各组织均有表达!并以下胚轴中表达量最高!其次为子叶!茎秆中表达最少&$%!"#
基因的表
达受到
I3
%
(
2Q
(
M33
(
323
和
H96:
的诱导!但受
(*23
(蔗糖(低温和
J5I
抑制研究认为!油菜中
$%!"# 基因 可能参与激素信号转导途径和非生物胁迫应答 关键词$油菜&类成束阿拉伯半乳聚糖蛋白基因&克隆&基因表达
中图分类号$S,1 & S,1( 文献标志码$
3
$%"&#& (&!)* + ,-..#"&/&(% 0 .#."1%/12!2-&-1,"3%($33-"$/$
4
53
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H90
-
.0
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9:9=N90
E
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!!
阿拉伯半乳聚糖蛋白"
9A9D.0>
?
9:9=N90
E
A>*
NB.0/
!
3IJ/
#是一类重要的植物大分子结构蛋白!
主要由
3IJ
蛋白骨架和糖基磷脂酰肌醇"
?
:
Y
=>*
/
Y
:
E
<>/
E
<9N.C
Y
:.0>/.N>:
!
IJM
#支架以及
"
型阿拉伯
半乳聚糖"
N
YE
B
"
9A9D.0>
?
9:9=N90
!
N
YE
B
"
3I
#侧链
组成!其中蛋白部分含量不到整个分子的
#"O
!属
于富含羟脯氨酸的糖蛋白"
U
YE
*A.=<
?
:
Y
=>
E
A>NB.0/
!
UQIJ/
#家族)#*!*此类蛋白通常存在于细胞壁(细
胞膜(细胞膜%壁间隙和胞间质等部位!其细胞定位
由
H*
端信号肽和
6*
端疏水
IJM
序列决定)!*%*
类成束阿拉伯半乳聚糖蛋白"
L9/=.=:.0*:.KB9A9*
D.0>
?
9:9=N90
E
A>NB.0/
!
FG3/
#是
3IJ/
中的一类!
其蛋白质结构通常含有
H*
端信号肽!
6*
端
IJM*90*
=<>A
序列!
3IJ*:.KB
区域和
#
#
$个 L9/=.=:.0*:.KB 的结构域含有 L9/=.=:.0*:.KB 结构域的蛋白在果蝇 " .&/(/ + 0)1231%/ 4 (53& #中首次被鉴定!其广泛 存在于高等植物)$*(动物)*(*(酵母),*(藻类)1*和地
衣)&*等生物体中目前!在多种植物中已经鉴定出
!"#(
基因!包括拟南芥"
#&6)7/
+
()(501)%
#
)
$* (水 稻" 8& 9 :(5); # ) #" * (小麦" <&)5)*,23(5);,2 # ) ## * (棉 花" =/(( 9+ ),20)&(,5,2 # ) #! * (白菜"$&(()*&
+

#
)
#%
*
(
杨树"
>/
+
,1,(5&32,1^>-16
#
)
#$* (番茄" 9 */ + 3&()? */%3(*,13%5,2 # ) # * (火炬松" >)%,(537 # ) #( *和百日菊 " @)%%)313 4 %( # ) #, *等 !"#( 是一个大的基因家 族!在拟南芥(水稻(小麦(棉花(番茄和白菜中分别 鉴定出 !# ( !, ( %$
(
#&
(
!!
和
%%
个
!"#(
成员
已有的研究表明
!"#(
广泛参与植物发育过
程!主要涉及细胞分裂(伸长(膨胀及分化!以及次生
壁成熟(细胞粘连(形态建成等
!"#%*QH3.
拟南
芥转基因植株的研究表明花粉特有的
!"#%
基因
参与小孢子发育!且可能影响花粉内壁形成)#1*&拟
南芥
#5!"###
基因
8QH3
在花序茎和荚果的厚
壁组织中特异表达!表达强度随着果实的成熟不断
增强!推测
#5!"###
可能促进次生细胞壁的木质
化!对次生细胞壁的成熟有重要作用)#&*&拟南芥
A
1##
%
A
1#!
双突变体研究表明
#5!"###
和
#5!?
"##!
基因可能控制植物茎秆强度和弹性系数)!"*&
百日菊
@3!"###
主要在茎的木质部导管和邻近的
薄壁组织中表达!推测该基因可能在网状导管的后
生木质部分化时对次生壁的沉积加厚有作用)#,*
此外!研究表明
!"#(
可能参与植物激素和外
界胁迫的信号传递过程
_><0/>0
等)$*通过微阵列 研究发现与野生型拟南芥相比 !"## ( !"#! 和 !"#1 的转录积累在 323 不敏感突变体 6)#*# 中 更高!推测 323 抑制 !"## ( !"#! 和 !"#1 的表 达 U@90 ? 等)#!*研究发现 =0!"## %$
%
#
的表达
都受
I3
%
的上调!而
=0!"###
%
#$的表达受 323 促进!受 I3 % ( M33 和 H96: 的抑制!这些结果暗示 一些 =0!"#( 基因在棉花纤维发育中!可能与植物 激素和非生物胁迫的信号转导途径相关 油菜"$&(()*%
+
,(G+
#是世界最重要的油料
作物之一!也是中国食用油的主要来源目前油菜
中还没有关于
!"#(
基因的相关研究报道!但已有
一些研究逐渐阐述油菜
3IJ/
的功能)!#*!$*!主要涉 及花和根发育(小孢子胚胎发生等过程本研究首 次从甘蓝型油菜中克隆了 # 个 !"# 基因!并对其进 行了生物信息学和基因表达模式分析!为进一步研 究油菜中 !"#( 基因的功能奠定基础 # ! 材料和方法 9+9 ! 材 ! 料 材料为南京农业大学农学院油菜课题组的甘蓝 型油菜 H_,&1! !种植于南京农业大学江浦试验田 表达分析时分别在油菜幼苗期"播种后于 # % !` W 固 体培养基上生长 ,C #和开花期取样激素和非生物 胁迫处理所用材料种植于 # % !` W 固体培养基上!" !$
a"+
#
b
(
#!"
$8>: + 8 )! + / )# " #(< 光照% 1< 黑 暗#下培养 ,C !然后分别将幼苗置 #"$
8>:
+
G
)#
I3
%
(
#""08>:
+
G
)#
2Q
(
#"
$8>: + G )# M33 ( #"$
8>:
+
G
)#
(*23
(
#"
$8>: + G )# 323 ( O 蔗糖" ? + 8G )# #( 低温"$b
#(
#O J5I
"
?
+
8G
)#
#(
!""88>:
+
G
)#
H96:
中"尽量避免损伤幼苗#!以清水为对照"
6X
#
处理
#<
后取样所有样品均取
%
个重复!于液氮
中迅速冷冻后置
)1"b
冰箱保存备用
9:;
!
总
<=/
的提取及
6>=/
第一链的合成
按照
RA.;>:
试剂"
M0Z.NA>
?
B0
#说明书提取油菜
各组织总
QH3
!
=4H3
第一链合成按照反转录酶
"
JA.8B/=A.
E
N
%
QBZBA/BRA90/=A.
E
N9/B
!
R9X9Q9
#操
作说明完成
QH3
提取后经
4H9/B
&
处理去除
4H3
污染!电泳检测完整性!反转录后用内参基因
#*5)%
检测
=4H3
质量!合成的
=4H3
可直接作为
J6Q
反应的模板使用!或者
)!"b
保存
9+?
!
基因序列的扩增及测序
通过对白菜
!"#(
基因序列分析!设计引物
!"#
F
"
c*3RII6RR3R6R66II6I3*%c
#和
!"# Q
"
c*R6363RI3I66333636633336*%c
#!以
油菜叶片
=4H3
为模板进行
J6Q
扩增
J6Q
体系
参照
X\4*
E
:@/
"
R\d\2#说明书
J6Q
反应程
序$&$b
预变性
!8.0
后进行循环扩增&
$b 变性 #/ ! 1b 退火 %"/ ! (1b 延伸 #8.0%"/ !共$"
个
循环!最后
$b 保存 J6Q 产物经 #O 琼脂糖凝胶 电泳检测!采用琼脂糖凝胶胶回收试剂盒"离心柱 型! 3] Y? B0 #进行回收!回收产物连入 E `4#&*R 载 体" R9X9Q9 #!转化 4U* 感受态细胞" R9X9Q9 # 蓝白斑筛选阳性克隆!经菌液 J6Q 检测后!将阳性 重组子送到华大基因公司测序 9+@ ! 基因序列分析 采用 5]J3W Y 网站 JA>NJ9A98 程序分析编码 ,&# #" 期 !!!!!!!!!!!! 翟丽娜!等$甘蓝型油菜
$%!"# 基因的克隆及表达分析 表 9 ! 实时荧光定量 A$<
分析用引物
R9D:B#
!
JA.8BA/>LAB9:*N.8BJ6Q
引物名称
JA.8BA
098B
序列
WB
P
@B0=B
"
c
#
%c
#
片段长度
WB
?
8B0N
/.;B
%
D
E
#*5)%*QR*F 3RR63I6666RRIRRRIRI #$,
#*5)%*QR*Q IR33I6IR6RRRRRI36663R
!"#*QR*F 66633IRR6333I666R6 #%(
!"#*QR*Q RIRRIRRI66RR63IR6I
氨基酸的组成(分子量(理论等电点等理化性质&在
线软件
E
$%% E L98+]L98+>A ? %进行 L9/=.=:.0*:.KB 结构域分析& H* 端信号肽序列和 6* 端 IJM 序列分别 利用 W. ? 09:J$+#
和
D.
?
*JMJ:90NJABC.=N>A
程序预
测&
\*
链和
H*
链的糖基化位点分别利用
HBN\I:
Y
=
$+"
程序和
HBNHI:
Y
=#+"
预测蛋白质的二级结
构通过
I\Q
方法)!*在线分析获得
JW\QR
预测
蛋白的亚细胞定位
L9/=.=:.0*:.KB
结构域序列的多
重比对采用
6:@/N9:]
和
I5H4\6
等软件完成用
5`I3+"
软件进行同源性分析!并用邻接法
"
HB.
?
A*_>.0.0
?
!
H_
#重复
#""""
次构建系统进
化树!所用蛋白序列来自
H62M
或
2Q34
"
E
$%% DA9//.=9CD+>A ? % DA9C %#数据库 9+B ! 基因表达分析 以油菜 #*5)% " 3F###1#! #基因为内参!使用 JA.8BA 设计特异性引物"表 # #实时荧光定量 J6Q 体系共 !"$
G
!按试剂盒"
Wd2Q
%
IABB0QB9:*
N.8BJ6Q 9`/NBA .`]
!
R\d\2#说明书进行反
应在
2.>*Q9C.S
仪器上完成!采用两步法扩增
反应程序为
&b
预变性
%"/
&
b
变性
#"/
!
1b
退火
!"/
!
$" 个循环目的基因的相对表达量采用 该 J6Q 仪自带的 2.>*Q9C.S!+" 软件中的 CC6N 算法进行计算 ! ! 结果与分析 ;:9 ! %/12! 基因的克隆及编码氨基酸特性分析 根据白菜 !"#( 基因设计的引物 !"# F 和 !"#Q 进行同源克隆!以油菜 H_,&1! 叶片 =4H3 为模板进行 QR*J6Q 扩增"图 # #测序结果表明该 序列包含完整开放阅读框!长 #!""D E !共编码 %&& 个氨基酸残基和 # 个终止密码子 RI3 该基因编 码氨基酸大小$!11+&49
!预测等电点为
(+%,

20FG3
的氨基酸组成分析显示其具有
3IJ/
蛋白
典型的氨基酸组成特征!富含脯氨酸
JA>
"
%+O
#(
丙氨酸
3:9
"
#"+1O
#(丝氨酸
WBA
"
&+%O
#和苏氨酸
R"
,+O
#
图
#
!
$%!"# 基因 =4H3 序列扩增 `+4G""" & #+$%!"#
基因
J6Q
产物
F.
?
+#
!
38
E
:.L.=9N.>0>L=4H3/B
P
@B0=B>L$%!"# ? B0B `+4G""" & #+J6Q E A>C@=N/>L$%!"#
图
!
!
20FG3
蛋白预测的一级结构图
3+
预测的一级结构示意图&
2+
预测的结构域其中绿色
代表
H*
端信号肽!紫色代表
6*
端
IJM
序列!黄色代表
L9/=.=:.0
结构域!红色代表
3IJ*:.KB
结构域!红色斜体代表
H*
糖基化位点!
蓝色斜体代表
3/0*799*WBA
%
R序列!绿色斜体代表
\*
糖基化位点
F.
?
+!
!
W=E
AB/B0N9N.>0>L
E
@N9N.ZB
20FG3
E
A.89A
Y
/NA@=N@AB
3+J@N9N.ZB/KBN=<89
E
>L20FG3
E
A.89A
Y
/NA@=N@AB
&
2+J@N9N.ZB
C>89.0/>L20FG3+6>:>ABC/B
P
@B0=B/9NN.0C.=9NBNE
ABC.=NBC/.
?
09:
E
B
E
N.CB
"
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ABB0
#
90CIJM*90=<>A
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P
@B0=B
"
E
@A
E
:B
#!
AB/
E
B=N.ZB:
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+R89.0/90C
3IJ*:.KBAB
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Y
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AB/
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B=N.ZB:
Y
+RABC.N9:.=/9AB
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?
:
Y
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Y
:9N.>0/.NB/
!
90CN3/0*799*WBA
%
RP
@.0/9AB<.
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[<.:B
\*:.0KBC
?
:
Y
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Y
:9N.>0/.NB/9AB.0C.=9NBCD
Y
N?
ABB0.N9:.=/
;:;
!
C&DE/
蛋白预测的结构域分析
生物信息学分析表明!预测的
20FG3
蛋白具
有
!
个
L9/=.=:.0*:.KB
结构域"
%
#
#,$! #&1 # %!( #! 属于 L9/=.=:.0 超家族 W. ? 09:J$+#
分析显示其
H*
端有
#
个信号肽
WJ
!且
6WJ
"
6:B9Z9
?
B/.NB
E
>/.*
N.>0
#位点在第
!$和 ! 个氨基酸的位置使用 D. ? * JMJ:90NJABC.=N>A 预测 6* 端 IJM*9CC.N.>0 信号!发 现可能的 IJM 修饰位点即第 %,! 个氨基酸的位置 HBNHI: Y =#+" 预测表明该蛋白中具有$
个
H*
糖基
化位点"
3/0!(
(
#!1
(
#(!
(
!$( #! HBN\I: Y =$+"
预测
显示它具有
##
个
\*
糖基化位点"
WBA#",
(
#"&
(
##(
(
#,$( #1% ( !(, ( %$!
(
%$%
(
%(
&
R(
#1#
#"图
!
#
JW\QR
对
20FG3
的亚细胞定位预测表明该蛋白
很可能定位于细胞质膜
1&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
采用
I\Q
方法)!*对
20FG3
蛋白的二级结构
进行预测!结果显示该蛋白中

*
螺旋"
9:
E
<9#
占
%$+%$O
!延伸主链"
B]NB0CBC/NA90C
#占
#,+,&O
!
无规卷曲"
A90C>8=>.:
#占
$,+1,O * 螺旋和无规 卷曲是组成 20FG3 蛋白二级结构的主要成分 图 % 表明! 20FG3 的 ! 个 L9/=.=:.0*:.KB 结构域 长度分别为 #$"D
E
和
#!&D
E
!与其他物种的序列间
同源性较低!却也具有
%
个长约
#"
个氨基酸的保守
序列
U#
(
U!
和)
dF
*
U
其中
U!
区域富含亮氨
酸(异亮氨酸和缬氨酸等疏水氨基酸!这些疏水残基
可能对维持
L9/=.=:.0*:.KB
结构域的功能如细胞粘连
不可缺少)!(*且
U#
和)
dF
*
U
中分别含有保守的
苏氨酸和组氨酸残基"图
%
#
;+?
!
系统进化树分析
利用
5`I3+"
软件!将预测的
20FG3
氨基
酸序列与不同植物中已知的
3IJ/
和
FG3/
蛋白构
建系统进化树结果"图
$#表明! 20FG3 蛋白与同 属十字花科的白菜 FG3#, 和拟南芥 FG3! 的进化 关系较近!与 3NFG3# 和 3NFG3% 次之!与它们的 氨基酸序列一致性分别为 &1O ( 1,O ( ,O 和$"O
!
与
3N3IJ%#
及
I<3IJ%#
的亲缘关系较远因此
将其命名为
$%!"# ;:@ ! %/12! 基因的表达分析 图 显示!$%!"#
基因在油菜各组织均有表
达!不具有组织特异性!苗期下胚轴中表达量最高!
其次为苗期子叶(开花期叶片和苗期根!角果中表达
图
$! 不同植物 3IJ/ 和 FG3/ 的系统进化树分析 分支上的数值表示 2>>N/NA9 E 验证中基于 #"""" 次重复该节点的 可信度&标尺表示遗传距离& ID+ 海岛棉& I<+ 棉花& 3N+ 拟南芥& TB+ 百日菊& 20+ 油菜& 2A+ 白菜& J E + 小立碗藓& GB+ 番茄& 6/+ 黄瓜&括号内为 IB0290K 或 2Q34 登录号 F. ? +$
!
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因与油菜生长发育密切相关
由图
(
可知!
$%!"# 基因表达受到 I3 % ( 2Q ( M33 ( 323 和 H96: 的诱导!而受到 (*23 (蔗糖(低 温和 J5I 抑制其中! I3 % 和 M33 都极显著地上 调其表达!且 I3 % 上调作用更为明显! H96: 也使得 其表达量显著升高!然而低温处理却极显著降低其 表达这些结果暗示了$%!"#
基因在油菜生长发
育中可能与激素和非生物胁迫应答有关
%
!
讨
!
论
类成束阿拉伯半乳聚糖蛋白基因"
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物发育过程中起到重要作用!显著影响植物形态!对
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蓝型油菜中克隆了
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示其编码氨基酸中具有
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端
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因
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具有
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FG3/
与
3IJ/
聚成两大类!这与
3IJ/
按结构域的分类也
一致以上分析结果表明本研究克隆的基因编码的
蛋白属于
FG3/
蛋白家族
基因的表达模式与其在植物中的功能有重要的
联系!研究
!"#(
的表达可为阐释该基因的功能提
供线索
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的结果表明
$%!"# 的表达广 泛分布于各个组织器官中!推测该基因可能参与了 油菜各个组织的生长发育过程 G. 等)#%*通过查找 IB0290K 中的白菜 #"""" 条 5WR/ 序列!对根( 叶(花(花蕾(角果和种子中的$&!"#(
表达进行分
析发现
$&!"##, 基因在根和种子中的表达量较其 他$
个器官中更高!在花中不表达
$%!"# 在油菜 花器官中有少量表达!表明$%!"#
与其同源基因
$&!"##, 的表达有差异 植物 !"#( 基因可能涉及多种激素和非生物胁 迫信号转导过程拟南芥 !"## E eIVW 转基因植 株的 6M` " =9:@/.0C@=.0 ? 8BC.@8 #和 WM` " /<>>N .0C@=.0 ? 8BC.@8 #处理结果显示 !"## 基因对生长 素依赖!而细胞分裂素对其有抑制效应)!,* 9` 等)#"*研究表明 8(!"#, ( 8(!"### 和 #5!"#!# 的 表达都受到赤霉素 I3/ 的诱导!暗示 I3/ 在调控 !"#( 基因功能上具有重要作用激素变化与形态 发育密不可分!影响植物形态建成其中赤霉素涉 及植物生长发育的各个方面!包括种子发芽(茎秆伸 长(叶片伸展(花粉成熟和花的诱导等激素处理后$%!"#
基因表达量的变化显示其对
I3
%
最为敏
感!推测该基因可能通过参与
I3/
的信号网络调节
油菜的生长发育外界环境也极大地影响植物生长
情况!耐寒耐高温!耐盐碱以及耐旱等品种的选育一
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北
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植
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物
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学
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表达量降低!
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和
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$%!"# 的表达 受 H96: 上调和低温( J5I 下调表明它也可能参与 不同的逆境胁迫调控过程但是!油菜$%!"#
基
因在激素应答和逆境胁迫响应中的作用及其分子机
制还有待进一步研究目前已构建该基因的过表达
载体和
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载体!将通过转化油菜植株对该基因
功能进行研究!为阐释其具体的发育调控机制和生
物学功能奠定基础
参考文献!
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基因的克隆及表达分析