全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(5): 538鄄541(2011)
收稿日期: 2010鄄12鄄02; 修回日期: 2011鄄08鄄20
通讯作者: 周宗山,副研究员,主要从事果树病害研究; Tel: 0429鄄3598268, E鄄mail: zszhou2000@hotmail. com。
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研究简报
欧李炭疽病病原菌鉴定
周宗山*, 徐成楠, 吴玉星, 迟福梅, 张红军, 丁艳杰
(中国农业科学院果树研究所, 兴城 125100)
Identification of the pathogen causing anthracnose of Chinese dwarf cherry摇 ZHOU
Zong鄄shan, XU Cheng鄄nan, WU Yu鄄xing, CHI Fu鄄mei, ZHANG Hong鄄jun, DING Yan鄄jie摇 (Research Institu鄄
te of Pomology,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Xingcheng 125100,China)
Abstract: A new fruit disease of Chinese dwarf cherry was observed in Xingcheng, Liaoning Province. This
disease spread rapidly in the field and caused serious loss of the fruits production. In the study, a fungal strain
isolated from the fruit was confirmed to be responsible for this new disease, and identified as Colletotrichum
acutatum based on the morphology, cultural characters on PDA plate, sequence analysis of ribosomal DNA鄄
ITS and PCR amplification with C. acutatum鄄specific primers CaInt2 and ITS4. This is the first report of an鄄
thracnose caused by Colletotrichum acutatum on the fruits of Chinese dwarf cherry.
Key words: Chinese dwarf cherry; anthracnose; pathogen identification; Colletotrichum acutatum
文章编号: 0412鄄0914(2011)05鄄0538鄄04
摇 摇 欧李也Cerasus humilis(Bge)Sok. 页属于蔷薇科
樱桃属矮生灌木野生果树,也是极具开发潜力的药
用植物。 欧李具有抗寒、耐旱、耐瘠薄,适应性强的
特性,以其植株低矮,果实色艳,风味独特,营养丰
富,颇受人们喜爱。 欧李果实含钙较高,其种仁为
郁李仁药材的主要来源[1]。 欧李广泛分布于我国
的黑龙江、辽宁、内蒙古、河北、山东、山西等省区。
近年来,辽宁省兴城市中国农业科学院果树研究所
生产圃部分欧李果实出现炭疽病症状,果实受害严
重,发病率达 80%以上,甚至出现整株的欧李果实
全部干枯成僵果悬挂在枝上,发病后期绝大多数果
实脱落,该病给欧李产业的发展造成极大障碍。 目
前国内外尚未见欧李病害的研究报道。 为确定该
病病原并建立有效的防治方法,通过采集欧李果实
病样,分离培养病原物,观察病原菌形态特征和培
养性状,测定致病性,并结合病原菌基因组 ITS 区
序列测定结果和炭疽病菌特异性引物的扩增研究,
对其病原菌进行鉴定,以明确此种致病菌的种类。
1摇 材料与方法
1. 1摇 植株症状观察
2010 年 9 月在辽宁省兴城市中国农业科学院
果树研究所生产圃观察到部分欧李果实炭疽病症
状,采集新鲜发病果实 30 个,并对典型发病症状进
行描述和数码照相。
1. 2摇 病原菌的分离及形态特征
采用常规的组织分离法进行病菌的分离。 切
取发病果实表皮及果肉,将病健交界处的新鲜组织
切成 0. 3 cm 伊0. 5 cm 大小的薄片,75%酒精处理
10 ~ 15 s,再用 0. 1%升汞处理 1 min 后,用无菌水
洗 3 遍,接种于 PDA培养基平板上,26益黑暗条件
下培养。 3 d 后用无菌接种针挑取菌落边缘菌丝
至 PDA平板上进行纯化,观察菌落形态及颜色,用
摇
摇 5 期 周宗山,等:欧李炭疽病病原菌鉴定
显微镜测量分生孢子大小并拍照,7 d 后将纯化的
菌落转 PDA斜面 4益保存。
1. 3摇 致病性测定
1. 3. 1摇 室内接种 摇 将分离纯化后的病原菌转至
PDA平板上,于 26益黑暗条件下培养 7 d 后,用无
菌水洗出孢子配制成浓度为 1 伊105 个 / mL的孢子
悬浮液,采用刺伤喷雾法接种于欧李健康果实,每
个处理 10 个果实,3 次重复,以无菌水作对照,在
25益,RH 90% ~ 100%的温室内培养。 接种后每
天保湿并观察发病症状,发病后,挑取果实表面分
生孢子制作切片镜检,并从病斑再次分离病原菌加
以确认。
1. 3. 2 摇 田间接种 摇 用无菌水配制浓度为 1 伊 105
个 / mL的孢子悬浮液,于 10 月初果实进入成熟期
时,选择发病较轻的植株,随机选取健康欧李果实
进行孢子悬浮液刺伤喷雾接种,每个处理 10 个果
实,3 次重复,以无菌水作对照。 用塑料袋包裹后
喷雾保湿 72 h,然后每天观察发病症状,并对接种
后发病的果实进行病菌再分离。
1. 4摇 病原菌的分子鉴定
1. 4. 1摇 基因组 DNA 的提取摇 从培养皿中直接刮
取菌丝放入 1. 5 mL灭菌离心管中,用研磨棒研磨
菌丝至粉末, 加入 600 滋L 65益预热 CTAB提取液
(CTAB 20 g / L、NaCl 1. 4 mol / L、EDTA 20 mmol /
L、Tris鄄HCl 100 mmol / L),置于 65 益水浴 30 min,
每隔 10 min振荡 1 次, 使其充分抽提;加入等体积
的氯仿 颐异戊醇(24 颐 1),轻轻颠倒混匀 10 min(至
有机相和水相混匀后重新分开),于台式冷冻离心
机上 12 000 r / min离心 10 min,取上清液转入另一
1. 5 mL eppendorf管中,再加入等体积的氯仿 颐异
戊醇(24 颐 1)重复抽提,直至中间的蛋白质层看不
见为止,将上清液逐滴转入另一装有 2 倍体积的预
冷无水乙醇(或 2 / 3 体积的异丙醇)离心管中,使
DNA 沉淀成絮状, - 20益 放置 30 min, 10 000
r / min离心 10 min,收集沉淀,并用 70% 乙醇洗
2 次,倒掉乙醇,室温晾干沉淀,于 - 20益 保存
备用。 摇 摇
1. 4. 2摇 rDNA鄄ITS 区扩增与分析摇 采用真菌通用
引物 ITS1和 ITS4进行 PCR扩增。 25 滋L PCR反应
体系:10 伊 PCR buffer 2. 5 滋L、MgCl2(25 mmol / L)
2. 5 滋L、dNTP(10 mmol / L)0. 5 滋L、模板 DNA 溶
液 1 滋L、5 U / 滋L Taq酶 0. 2 滋L、10 pmol / 滋L ITS1
和 ITS4 引物 (由上海生工合成)各 0. 5 滋L、超
纯水 17. 3 滋L。 反应程序: 94益 预变性 5 min;
94益变性40 s,52益退火 40 s,72益延伸 1 min,
35 个循环; 最后 72益延伸 10 min。 PCR产物送上
海生工生物工程技术服务有限公司测序。
对测得的供试菌株核糖体 DNA鄄ITS区段的序
列,运用 GenBank核酸数据库中的 BLAST 工具软
件,在 DNA序列数据库中搜索同源 DNA 序列并
进行比较分析,根据 BLAST 搜索和比较的结果,
判断所获菌株的种类或其近缘的物种。
1. 4. 3 摇 尖孢炭疽病菌特异性引物扩增 摇 选用
Sreenivasaprasad 等[2]针对尖孢炭疽病菌 ITS 区设
计 的 特 异 引 物 CaInt2 ( 5忆鄄GGGGAAGC鄄
CTCTCGCGG鄄3忆)和 ITS4 (5忆鄄 TCCTCCGCTTAT鄄
TGATATGC鄄3忆)对待测菌株 500 bp 特异性片段进
行 PCR扩增。 PCR 反应体系总体积 50 滋L,反应
液为:10 伊 PCR buffer 5 滋L、MgCl2 (25 mmol / L)
5 滋L、dNTP(10 mmol / L)2 滋L、Taq 酶(5 U / 滋L)
0郾 4 滋L(以上试剂均由上海生工提供),模板 DNA
2 滋L、 引物 (由上海生工合成 ) 各 0. 5 滋L
(20 滋mol / L)、超纯水 34. 6 滋L。 反应条件:94益
预变性 3 min; 94益变性 30 s,64益退火 1 min,
72益延伸 1 min, 35 个循环; 最后 72益 延伸
10 min, 4益保存。 扩增产物用 1%琼脂糖凝胶进
行电泳,检测特异性条带。
2摇 结果与分析
2. 1摇 欧李炭疽病症状
观察发现病原菌只侵染危害果实,初期果实
表面出现近圆形或不规则的褐色水渍状小斑点,
小点周围有黄色的晕圈,病斑稍有凹陷 (图 1鄄
A)。 果实生长中后期尤其是接近成熟期发病的
果实,病斑显著凹陷并伴有同心环状皱缩,且病
斑相互愈合呈不规则的大斑。 发病后期,湿度大
时病斑上长出橙红色小粒点,即病原菌分生孢子
堆,果实软腐脱落或干缩成僵果挂在树枝上,偶
尔伴有流胶(图 1鄄B)。
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摇
植物病理学报 41 卷
Fig. 1摇 Anthracnose symptoms of Chinese dwarf cherry and morphological
characteristics of the pathogen
A,B: Symptom in field; C: Symptom of inoculated fruit with strain T1 in field; D: Symptom of inoculated fruit with
strain T1 in lab; E: Colony on PDA; F: Reverse colony on PDA; G: Conidia(400 伊 ) .
2. 2摇 病原菌形态与培养性状
经室内分离,所有菌株在 PDA 上菌落形态基
本一致。 菌落圆形、边缘整齐、平铺;气生菌丝绒
状、较发达,初期菌落为白色,后期由菌落中央开始
逐渐变为灰绿色,最终呈深橄榄绿色至灰绿色(图
1鄄E),培养皿背面呈橘红色(图 1鄄F),即为病菌分
生孢子团。 分生孢子无色,单胞,纺锤形或梭形,
内含 2 个油球(12. 0 ~ 16. 5)滋m 伊 (4. 5 ~ 5郾 0)滋m
(图 1鄄G)。 在自然条件和人工培养基上均未发现
有性型。
2. 3摇 致病性测定
在实验室和田间分别将炭疽病菌孢子悬浮液
喷雾接种于欧李健康果实上,接种后均 4 d 开始发
病,7 d后出现的典型症状均与田间自然发病症状
一致(图 1鄄C、D)。 在湿度大的条件下病斑表面形
成橙色的小点,即病原菌的分生孢子堆。 接种后 7
d发病率达 100% ,对照果实均未发病。 试验结果
表明,室内接菌比田间接菌更易产生分生孢子堆,
证明湿度大有利于该病发生。
对实验室和田间接种发病的果实进行再分离
培养,所获菌株与接种病原菌形态一致,证明炭疽
病菌是导致欧李果实发病的致病菌。
2. 4摇 rDNA ITS序列分析
选取炭疽病菌代表菌株 T1,通过真菌 ITS 通
用引物扩增病菌 rDNA鄄ITS 基因,获得了长度为
560 bp 的 DNA 片段(图 2)。 用 BLAST 与 Gen鄄
Bank(NCBI)中核酸数据库进行同源性比较,发现
在与其同源性最高的 100 个序列中,有 95 个是
Colletotrichum acutatum 或其有性型 Glomerella
acutata,且同源性均为 98% ~ 99% 。 向 GenBank
提交了该序列,得到序列登录号 HQ688676。 据
此,确认该致病菌为尖孢炭疽菌,该菌无性态为半
知菌亚门(Deuteromycotina),腔孢纲(Coelomyce鄄
tes),黑盘孢目(Melanconiales),炭疽菌属(Colleto鄄
trichum spp. )。 有性态为子囊菌亚门(Ascomyco鄄
ta),核菌纲 ( Pyrenomycetes),球壳目 ( Sphaeria鄄
les),小丛壳属(Glomerella)。
2. 5摇 特异性引物的扩增结果
经特异性引物 CaInt2 和 ITS4 扩增,获得了病
原菌 500 bp的 DNA特异性片段(图 2),进一步证
明了 T1 菌株为尖孢炭疽病菌(Colletotrichum acu鄄
tatum)。
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摇
摇 5 期 周宗山,等:欧李炭疽病病原菌鉴定
Fig. 2摇 PCR amplification pattern of isolate T1
with specific primer of Colletotrichum
acutatum
3摇 讨论
炭疽病菌(Colletotrichum)是许多重要作物叶
部、茎部和果实上炭疽病的致病菌,该病原菌的准
确鉴定对于炭疽病的流行与防控尤为重要。 基于
形态学的炭疽病菌的鉴定通常是不够准确的,可信
赖的一些病原菌形态学特性常常受到不同实验方
法和条件的影响,而目前迅速发展的分子生物学方
法用于炭疽病菌的鉴定稳定、可靠。 值得注意的
是,许多在 GenBank 登录的炭疽病菌 ITS 序列的
命名是不够准确的。 炭疽病菌的分类鉴定应基于
多基因系统发育体系与模式种作比较分析,并将病
原形态学、生理学、致病性、培养特性、病菌次生代
谢物综合研究[3]。 本研究得到的结果与尖孢炭疽
病菌的形态学描述一致。 作者田间调查发现,病菌
主要以菌丝体、分生孢子盘在欧李枝条上的病果、
僵果越冬,是生长季节初侵染的重要来源。
随着分子生物学技术的不断发展与成熟,各种
分子诊断技术已广泛应用到真菌病原菌的鉴定,其
中 rDNA的 ITS区域的测序鉴定方法因简便易行
而被广泛应用[4]。 有许多学者利用炭疽菌属种间
ITS区域的差异设计引物,对不同炭疽病菌进行鉴
定。 本文选用 Sreenivasaprasad 等根据炭疽病菌
ITS区设计的特异引物对所分离菌株扩增,得到了
与 Zhang等[5]一致的结果。
欧李炭疽病在辽宁省兴城地区发生严重,甚至
给种植者造成毁园的严重损失,目前国内外尚未见
该病害的相关研究报道,该病的流行、侵染及综合
防治需要深入研究。
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责任编辑:于金枝
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