全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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基金项目$国家林业局公益性行业科研专项"
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#
作者简介$张
!
敏"
#1&,
#!男!在读硕士研究生!主要从事森林生态方面的研究
2(34.5
$
6740
8
3.0!"),
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#!,+9:3
"
通信作者$刘建军!博士!教授!主要从事森林生态方面的研究
2(34.5
$
5
-!
0;/<4=+>?<+90
蒙古高原黄耆属部分争议种
亲缘关系的
$%%&
分析
张
!
敏#!王
!
平#!赵晓文#!刘建军#"!徐朗然!
"
#
西北农林科技大学 林学院!陕西杨陵
*#!#""
&
!
西北农林科技大学 生命科学学院!陕西杨陵
*#!#""
#
摘
!
要$采用
@AAB
分子标记技术对蒙古高原黄耆属属下部分争议类群的亲缘关系进行了研究用
##
条
@AAB
引
物对
&
个种的
$)
份材料进行扩增!共获得条带
#&&
条!其中多态性条带
#*&
条!多态性条带百分率达
1$+*C
用
DEAFA
G
9!+#">
软件对相关数据进行
HIJKL
聚类分析!在相似性系数为
"+*%
处!
$)
份材料被划分为
*
大类群!
其中!科布尔黄耆"
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&
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#与乳白花黄耆"
!/
&
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#聚为一支!表明前者可能仅是后者的生态
型!应当处理为后者的异名&不同产区的糙叶黄耆"
!/"0%+,$$.1("
#和变异黄耆"
!/2%$.%+.."
#分别聚为一支!其各
自的形态变异得以区分!但均应属于种内变异的范畴&莲山黄耆"
!/,%-"%-.0("
#与长管萼黄耆"
!/.1
3
$.04#..
#分
别聚为一支!支持将二者处理为两个相互独立的种在相似性系数为
"+,,
处!
$)
份材料又被划分为
$
大类!类群
的划分与黄耆属属下(组)的划分接近!但又存有差别
IM:L
分析的结果与
HIJKL
聚类分析基本一致相关分
析结果表明!以组为单位划分黄耆属植物具有合理性!但部分组的设立以及部分种的归属仍需调整!准确地揭示黄
耆属植物间的系统进化关系!还需要更多的材料采用多种分子标记方法
关键词$亲缘关系&蒙古高原&黄耆属&
@AAB
中图分类号$
N*&1
&
N1$1+*)#+1
文献标志码$
L
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G
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G
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8
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!!
蒙古高原地处亚欧大陆干旱与半干旱内陆腹
地!是一个相对独立的地理单元喜马拉雅造山运
动*第四纪冰川等特殊地质年代!加上蒙古高压的长
期控制!使得该区趋于干旱!荒漠和草原得以发育!
并借此孕育了一大批可以适应极端气候的植物种
类在这些植物种类中!豆科"
T>
8
<3.0:/4>U#
黄耆属"
!"#$%
&
%("T+
#植物种类繁多!分布广泛!
多样性复杂!是该区最具代表性的植物类群之一
世界范围内黄耆属共有
!)""
余种!主要分布
于北半球的温带地区*南美洲以及中亚和西亚等
地+#,分布范围的广泛性以及类群自身的复杂性!
导致对这些植物进行系统的研究相对困难!因而分
类学问题也大量存在+!,蒙古高原约有黄耆属植物
#!"
种!在分类学研究中同样存在着诸多类似的遗
留问题其中!较为典型的有以下几个$"
#
#科布尔
黄耆"
!"#$%
&
%(")*+($,-"."
#"图版
"
!
L
*
a
#和乳白
花黄耆"
!/
&
%%0#.#,"
#"图版
"
!
M
#!这两个种在形
态上差别不大!地理分布区相互重叠!种间界限不明
显!却处理为
!
个种!有待订正&"
!
#分布于陕西礼泉
的糙叶黄耆"
!/"0%+,$$.1("
#与其他产区的材料相
比!在花梗形态上存在差异!表现为前者的花梗明显
偏长!且花萼在花期略微膨胀"图版
"
!
2
#!这两种
类群是否为同一个种!有待验证&"
%
#部分产区的变
异黄耆"
!/2%$.%+.."
#在果实特征上表现为荚果明
显皱缩!且性状相对稳定"图版
"
!
J
#!这些变异是
属于种内正常变异!或已超越种的范畴!在不同的学
者间存有争议!需要进一步考证&"
$
#莲山黄耆"
!/
,%-"%-.0("
#"图版
"
!
P
#与长管萼黄耆"
!/.15
3
$.04#..
#的分类学关系一直存在疑问+%,!两者是否
为同一个种有待进一步研究针对上述问题!本实
验拟在形态学研究的基础上!通过
@AAB
分子标记
技术对相关类群进行集中研究!以揭示其亲缘关系!
并为后续相关研究提供更多的依据
#
!
材料和方法
?+?
!
供试材料
供试材料为黄耆属植物的幼嫩叶片于
!"#!
年
%
#
)
月采自相关种的模式产区或主产区以种
群为单位!分单株收集植物材料!单株间距不少于
)"3
!共收集植物材料
$)
份!涉及黄耆属属下
$
个
组!
&
个种"表
#
#采集后!将材料置于塑封袋中!加
入适量的变色硅胶干燥剂!于
!$7
之内迅速干燥!
之后将材料与干燥剂分离!于
*"b
超低温冰箱内
保存!备用为探讨不同分类群花萼膨胀等形态特
征的关联性!同时揭示黄耆属属下相关分类单元划
分的合理性!实验中选取胀萼黄耆"
!/,.
3
"*.6,("
#
以及兰州黄耆"
!/%-74*(,-"."
#等材料一并进行
研究
?+@
!
实验方法
?A@A?
!
基因组
BC:
的提取与检测
!
_DL
的提取
采用改进的
MELa
法+$,
?A@A@
!
$%%&
引物的筛选
!
@AAB
引物参照加拿大
哥伦比亚大学"
HaM
#于
!"",
年公布的序列!由北
京三博远志生物技术有限公司合成用优化的反应
体系!从
#""
条通用引物中筛选出
##
条扩增条带清
晰*多态性高*重复性好的引物对
$)
份材料进行分
析引物及扩增结果见表
!

?A@AD
!
6E&
反应体系的构建
!
IMB
反应体系为
!"
$
T
反应体系!包括
!cIMB
缓冲液*
)"0
8
基因
组
_DL
*
"+#,33:5
%
T?DEI
*
#+!33:5
%
TK
8
!d
*
"+!
$
3:5
%
T
引物和
"+&H8%
9
_DL
聚合酶反应
在
K
Y
M
Y
95>VE7>V345M
Y
95>V
%
#*"(1*"#2_H
型
IMB
仪"美国
a.:(BL_
公司#上进行反应程序
为$
1$b
预变性
)3.0
&
1$b
变性
#3.0
!
$,
#
),b
退火
#3.0
!
*!b
延伸
#3.0
!
%)
个循环&
*!b
延伸
#"3.0
!
$b
保存备用
?+@+F
!
扩增产物的检测
!
用
!C
的琼脂糖凝胶!
#
cEa2
电泳缓冲液!以
#""]
G
_DLT4??>V
"康为
世纪#作为对照对
IMB
扩增产物进行检测在
_FF(,M
型电泳仪"北京六一公司#上!稳压"
)e
-
93
#
#!电泳
!+)7
电泳结束后!于
#
$
8
-
3T
#
2a
中染色
#"3.0
!之后在
K:5>9<54V@34
8
>V
&
J>5
_:9
EK
SB
型紫外凝胶成像系统"美国
a.:(BL_
公
司#下检测!拍照
?+@+G
!
数据的获取与分析
!
用
N<40X.X
Y
R0>
软件
对获取的凝胶电泳图进行泳道校正!并手工统计相
1#$!
#!
期
!!!!!!!!!!!
张
!
敏!等$蒙古高原黄耆属部分争议种亲缘关系的
@AAB
分析
关数据清晰可见的条带全部用于统计!相同迁移 位置条带的有无分别以(
#
)和(
"
)计!构建(
"
!
#
)二元
表
?
!
FG
份供试材料的基本信息
E4]5>#
!
E7>$)499>//.:0/.0X7./V>/>4V97
组
A>9X.:0
编号
D:+
种
A
G
>9.>/
采集地
M:5>9X.:0/.X>
纬度%经度
T4X.X
%
5:0
8
.X
"
D
%
2
#
海拔
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%
3
糙叶组
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内蒙古乌拉特中旗
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科布尔黄耆
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宁夏中卫孟家湾
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科布尔黄耆
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宁夏大罗山
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D.0
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科布尔黄耆
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内蒙古朝阳
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:5.4 $"f)!g)%+##h
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科布尔黄耆
!/)*+($,-"."
内蒙古武川
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Y
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科布尔黄耆
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内蒙古察哈尔右翼中旗
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Y
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科布尔黄耆
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乳白花黄耆
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乳白花黄耆
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陕西礼泉赵镇
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乳白花黄耆
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陕西礼泉
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兔尾组
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胀萼黄耆
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内蒙古乌达
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糙叶组
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Y
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陕西乾县
N.40M:<0X
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宁夏大罗山
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糙叶黄耆
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内蒙古卓资山
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!
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糙叶黄耆
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宁夏隆德
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内蒙古乌拉特中旗
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山西雪花山
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宁夏隆德
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J%%
糙叶黄耆
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陕西礼泉
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Y
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糙叶黄耆
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陕西礼泉
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#"&f!,g)&+%&h ,)"
驴豆组
R0:]V
Y
97.?>/
J%)
长管萼黄耆
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3
$.04#..
山西雪花山
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J%,
长管萼黄耆
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山西雪花山
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莲山黄耆
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宁夏隆德
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莲山黄耆
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宁夏隆德
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莲山黄耆
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宁夏隆德
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%
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旱生组
MV499.04
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变异黄耆
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内蒙古乌力吉
Q<5.
-
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8
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J$#
变异黄耆
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内蒙古阿拉善右旗
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Y
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J$!
变异黄耆
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甘肃苏武山
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J$%
变异黄耆
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宁夏汝淇沟
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驴豆组
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兰州黄耆
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宁夏红卫车站
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莲山黄耆
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北
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植
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物
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学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
数据矩阵之后采用
DEAFA(
G
9!+#">
软件+),!根据
D>.(T.
遗传相似性系数+,,!用非加权平均数法
HI(
JKL
"
H0;>.
8
7X>?
G
4.V(
8
V:<
G
3>X7:?4045
Y
/./
#法
对获取的矩阵数据进行聚类分析最后用
DEAFA(
G
9!+#">
软件对相关数据进行主坐标
IM:L
"
IV.09.(
G
459::V?.04X>4045
Y
/./
#分析
!
!
结果与分析
@A?
!
$%%&
引物扩增结果
用
##
条
@AAB
引物对
$)
份材料进行扩增!共
获得条带
#&&
条!其中多态性条带
#*&
条!多态性条
带百分率达
1$+*C
平均每条
@AAB
引物分别获得
#*+#
条条带和
#,+!
条多态性条带"表
!
#扩增片
段大小在
!""
#
#)""]
G
之间!部分引物扩增结果
见图
#

@A@
!
H65:
聚类结果
采用非加权平均数法
HIJKL
对相关数据进
行聚类分析!聚类结果与相似性矩阵相匹配!反映出
类群间较为明显的遗传距离在相似性系数为
"+*%
处!
$)
份材料被划分为
*
大类"图
!
#之前依据形
态特征被认定为不同种的科布尔黄耆与乳白花黄耆
共同构成一支&不同产区的胀萼黄耆*糙叶黄耆*变
异黄耆以及兰州黄耆作为独立的种分别聚为一类&
长管萼黄耆与莲山黄耆得以区分!划归明显的两个
类群各类群之下包含多个小的分支!呈现出同一
物种在不同产区较高水平的种内变异其中!不同
产地的
#$
份糙叶黄耆材料聚为一类!长花梗类群
"
J%!
*
J%%
*
J%$
#与短花梗类群"
J!#
#
J%#
#在一定
程度上得到了区分&变异黄耆果实皱缩"
J$#
*
J$!
#
与否"
J$"
*
J$%
#这一特征在聚类图中得以体现!形
成两个小的分支在相似性系数为
"+,,
处!
$)
份
材料又被划分为四大类群"图
!
#变异黄耆与兰州
黄耆最先聚为一支构成一大类群!莲山黄耆与长管
萼黄耆则形成另一大的分支&之后!乳白花黄耆与科
布尔黄耆共同构成一类!胀萼黄耆与糙叶黄耆构成
另一大类群
表
@
!
??
条
$%%&
引物及其扩增多态性
E4]5>!
!
##@AAB
G
V.3>V/40?X7>.V
G
:5
Y
3:V
G
7./3/:=43
G
5.=.>?]40?/
引物
IV.3>V
序列
A>
^
<>09>
"
)g(%g
#
退火温度
L00>45.0
8
X>3
G
>V4X
%
b
总条带数
D:+:=
]40?/
多态条带数
I:5
Y
3:V
G
7.9
]40?/
多态条带百分率
I>V9>0X4
8
>:=
G
:5
Y
3:V
G
7.9]40?/
%
C
HaM&"* LJLJLJLJLJLJLJLJE ), !# !# #""+"
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合计
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平均
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8
> #*+# #,+! 1$+*
图
#
!
引物
&$"
扩增结果图
K+_DL34V`>V
&箭头所示分别为各类群的特异性条带&
J#
#
J$)
同表
#
&下图同
W.
8
+#
!
@AAB
G
V:=.5>/:=!"#$%
&
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G
5.=.>?]
Y
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G
V.3>V
K+_DL34V`>V
&
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G
>9.=.9]40?/:=>497499>//.:0
&
J#J$)/43>4/E4]5>#40?4/]>5>;
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#!
期
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张
!
敏!等$蒙古高原黄耆属部分争议种亲缘关系的
@AAB
分析
@AD
!
6E":
结果
用
DEAFA(
G
9!+#">
软件对
@AAB
所得数据进
行主坐标
IM:L
分析图
%
显示!
$)
份材料的总体
分布模式与
HIJKL
聚类分析的结果"图
!
#一致!
但又呈现出一定的规律"图
%
#其中!长管萼黄耆*
莲山黄耆与兰州黄耆在经典形态学分类中均属驴豆
组划归同一类群!变异黄耆作为旱生组材料单独聚
图
!
!
$)
份材料
HIJKL
聚类结果图
W.
8
+!
!
HIJKL?>0?V:
8
V43]4/>?:0_.9>
8
>0>X.9
/.3.54V.X.>/9459<54X>?=V:3@AAB?4X4:0
$)!"#$%
&
%("499>//.:0/
图
%
!
$)
份材料主坐标分析图
W.
8
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!
IV.09.
G
459::V?.04X>4045
Y
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"
IM:L
#
]4/>?:0
8
>0>X.9V>54X.:0/7.
G
:=$)!"#$%
&
%("499>//.:0/
成一类&糙叶黄耆与科布尔黄耆及乳白花黄耆同属
糙叶组!但糙叶黄耆与后两者间的组内差异较为明
显&胀萼黄耆本应自成一类!却与糙叶黄耆表现出较
近的系统发育关系
%
!
讨
!
论
@AAB
分子标记技术作为一种新兴的标记技术!
因能在一定程度上更多地揭示物种基因的多样
性+*,!且相对稳定!被广泛地用于物种亲缘关系和居
群遗传结构的研究中本实验通过对黄耆属
$)
份
材料的
@AAB
分析发现!黄耆属植物种内和种间均
存在有明显的遗传变异
本研究通过
HIJKL
聚类分析和主坐标
IM:L
分析!相关种的种间界限在一定程度上得到了确立
在
HIJKL
聚类图中!胀萼黄耆*糙叶黄耆*变异黄
耆以及兰州黄耆作为独立的种得到很好的区分!种
内变异亦得以很好的揭示长管萼黄耆与莲山黄耆
同样得到了鉴定
@AAB
标记显示!长管萼黄耆与莲
山黄耆有着较为明显的区别!以引物
&$"
的扩增图
谱为例!在
,""
#
&""]
G
间!前者存在
%
条明显的特
异条带!而后者在
$""
#
)""]
G
处亦存在一条特异
性带谱与之相对应!刘小林等+%,在对二者的微形
态研究中发现!二者在叶表皮毛*丁字毛臂长比以及
气孔器分布等方面存有差异综合这些信息可以确
定二者仍是两个相互独立的种但是二者在萼筒*
荚果等形态特征上又表现出较高的相似性+%,!
HI(
JKL
显示!二者的相似性系数达
"+,&
!表明其亲缘
关系较近
糙叶黄耆虽存在花梗长度以及花萼形态的变
异!但在扩增带谱中并没有特别明显的反映!说明这
些变异仍属于种内正常变异的范畴!可能是特殊生
境作用下所呈现的多态型
不同产区的变异黄耆在果实形态特征上有较为
明显的区别!表现为果实的皱缩与否!反映在引物
&$"
的扩增带谱中!前者在
)""
#
,""]
G
间存在一
条特征带谱!但聚类分析结果显示二者的相似性接
近
1)C
说明单一依据这一特征不足以将二者区
分为不同的类群!两者同样属于一个物种的范畴
在
HIJKL
聚类图中!科布尔黄耆与乳白花黄
耆聚为一类事实上!这二者的种间关系一直存有
争议乳白花黄耆发表于
#&""
年!主要分布于亚洲
内陆与东亚过渡的干旱草原区+&,&科布尔黄耆发表
于
#&,&
#
#&,1
年!模式产地为蒙古南部科布尔附
近!即现在中国内蒙古的察哈尔右翼中旗"蒙语称科
!!$!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
布尔#+1(#",张敏等在对科布尔黄耆进行分类学订
正的过程中!依据形态特征将宁夏黄耆"
!/-.-
&
:.5
%,-"."
#处理为科布尔黄耆的异名!并将科布尔黄耆
的分布范围拓展到了内蒙古中西部广大的草原和荒
漠植物区!其间提及乳白花黄耆!但并未就科布尔黄
耆与乳白花黄耆的具体关系进行深入分析+##,事
实上乳白花黄耆与科布尔黄耆不仅分布区域相互重
叠!在形态特征上亦极为相似二者也仅是在叶片
表面特征上存在细微差别!前者(叶片上面无毛!下
面被白色伏贴毛)+1,!后者(叶表面有较为稳定的疏
毛或至少在靠近叶片边缘有稳定的疏毛)+#!,仅依
据这一特征将二者划分为不同的种是不科学的!科
布尔黄耆在很大程度上应该属于乳白花黄耆种内的
变异本研究
@AAB
聚类分析的结果显示二者的相
似性在
1"C
以上!综合形态特征等!建议将科布尔
黄耆处理为乳白花黄耆的异名
在种以上分类层次上!
HIJKL
聚类分析的结
果与经典形态分类中黄耆属(组)这一等级的划分接
近!但又存在差别依据(
W5:V4:=M7.04
"
e#"
#)的
结论!供试材料涵盖
$
个组!其中乳白花黄耆*科布
尔黄耆以及糙叶黄耆同属糙叶组&胀萼黄耆属兔尾
组&莲山黄耆*长管萼黄耆与兰州黄耆同属驴豆组&
而变异黄耆属于旱生组+#%,本研究在聚类图中!相
似性系数为
"+,,
处!
$)
份材料亦被划分为四大类
群!但类群的组成结构与形态学的结论存在不一致
胀萼黄耆本应自成一支!却和糙叶黄耆共同构成一
大类群!兰州黄耆本属于驴豆组却和变异黄耆构成
一类究其原因!可能是因为胀萼黄耆与糙叶组的
糙叶黄耆等类群!同属于黄耆属中的(无茎类群)!且
部分产区的糙叶黄耆同样表现出花期花萼膨胀的特
点!二者在系统发生关系上联系较近!存在相互过
渡&而兰州黄耆与变异黄耆作为(有茎类群)!也可能
存在上述系统进化上的相互关系当然!相关结论
仍需要更多的证据
本研究中
IM:L
分析的结论基本与
HIJKL
聚类分析一致!但又呈现出一定的分布规律
IM:L
图显示!兰州黄耆*莲山黄耆以及长管萼黄耆聚为一
类!表现出较近的亲缘关系结合形态分析!三者无
论是茎的分化还是花和果实的形态均符合驴豆组的
特征!因此支持将三者划归一组此外!图中糙叶组
较为明显的组内差异及其与兔尾组相关类群所呈现
出的位置关系!表明这些类群间存有较为复杂的系
统进化关系!相关种的归属及组的划分方面仍存在
争议!有待进一步的研究证明事实上!有关黄耆属
属下(组)的划分也正逐步成为相关研究的一个重
点
!""%
年!
i46>3
G
:通过核糖体
_DL
的
@EA
序列以及
9
G
_DL
的
-64W
序列分析对旧世
界黄耆属植物进行了研究!发现现有黄耆属属下的
几个亚属均不是单系的!所研究的组中也仅有
,
个是
单系的+#$,&
!"##
年!
B.47.
采用
0V_DL
的
@EA
片段和
9
G
_DL
的
#$-F
%
E
*
#$-A
%
J
*
3
"+L(#$-P
等
%
个片段对
黄耆属
M4
G
V.0.
组及其近缘组进行了种系发生学研
究!认为
L/XV4
8
45组*
L5:
G
>9.
组*
T4\.=5:V.
组
以及
M4
G
V.0.
组
$
个组起源于共同的祖先+#),&
!"#!
年!
U4[4034V?.
采用
@EA
序列和
9
G
_DL
的
1%#i
*
#$-E(#$-F
以及
#$-P(
3
"+L
序列对
L5:
G
>9.
组及其近缘组的种系关系进行了重建+#,,由此可
见!以组划分黄耆属植物具有一定的合理性!但部分
组的设立以及部分种的归属仍需调整!准确地揭示
黄耆属植物的系统进化关系还需要更多的材料采用
多种分子标记方法来进一步证明讨论
参考文献!
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