全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(5): 516鄄525(2011)
收稿日期: 2010鄄10鄄08; 修回日期: 2011鄄04鄄20
基金项目: 国家“973冶计划(2006CB101900); 农业部农业行业专项(201103016); 国家“863冶计划(2006AA10A211; 2008AA102414);
江苏省农业科技攻关项目(BE2006304)
通讯作者: 周明国,教授,博导,博士; 主要从事杀菌剂毒理和抗药性机制研究; E鄄mail: mgzhou@mail. njau. edu. cn
第一作者: 陈长军(1967 - ),男,江苏盐城人,副教授,硕士生导师,博士; 主要从事杀菌剂毒理和抗药性机制研究; E鄄mail:ccj100cn@
yahoo. com. cn。
利用实时荧光定量 PCR技术检测油菜菌核病菌
陈长军, 李 俊, 赵 伟, 王建新, 周明国*
(南京农业大学植物保护学院植物病理学系, 南京 210095)
摘要: 采用高通量实时荧光定量 PCR技术建立检测和监测油菜菌核病菌群体数量的方法。 利用油菜菌核病菌(Sclerotinia
sclerotiorum)的 茁鄄微管蛋白基因内含子序列的特异性,设计引物对 SclSF (5忆鄄CTCAAATCTCCGAAAGTT 鄄3忆) / SclAF (5忆鄄
TGCAGACGGGTAATATG 鄄3忆),建立和优化了 SYBR Green 玉实时荧光定量 PCR 检测体系。 结果表明,该引物对能够从 8
种所测试的十字花科植物常见病原真菌中特异性扩增出油菜菌核病菌;所建立的实时定量 PCR技术可应用于油菜病叶和
病茎中菌核病菌的早期检测及菌核病的预测预报。
关键词: 油菜菌核病菌; 实时定量 PCR; SYBR Green 玉
Detection of Sclerotinia sclerotiorum by a quantitative real鄄time PCR摇 CHEN Chang鄄jun,
LI Jun, ZHAO Wei, WANG Jian鄄xin, ZHOU Ming鄄guo 摇 (Department of Plant Diseases, College of Plant
Protection, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095)
Abstract: A quantitative real鄄time PCR was used in high鄄throughout detection of Sclerotinia sclerotiorum
populations. A pair of primers SclSF (5忆鄄CTCAAATCTCCGAAAGTT 鄄3忆) / SclAF (5忆鄄TGCAGACGGGTA鄄
ATATG 鄄3忆) was developed and synthesized according to the specificity of the nucleotide sequences of introns
of beta鄄tubulin gene from Sclerotinia sclerotiorum. A technique of quantitative realtime PCR by SYBR Green
玉was developed and optimized to detect S. sclerotiorum. The results indicated that S. sclerotiorum could be
differentiated by conventional PCR assay with the developed primer set SclSF / SclAF from other eight crucifer
pathogens tested , including Alternaria oleracea, Cercosporella albo鄄maculans, Phoma lingam, Albugo bliti,
Botrytis cinerea, Colletotrichum gloeosporioides, Peronospora parasitica and Erysiphe cruciferarum. The re鄄
al鄄time PCR technique appears suitable for early detection and the epidemiological studies of S. sclerotiorum
from diseased stems and leaves of oilseed rape.
Key words: Sclerotinia sclerotiorum; quantitative real鄄time PCR; SYBR Green玉
中图分类号: S436. 3摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)05鄄0516鄄10
摇 摇 由核盘菌( Sclerotinia sclerotiorum)引起的油
菜菌核病是一种世界性病害,我国所有油菜产区均
有发生,以长江流域和东南沿海地区最为严重,发
病率为 10% ~ 80% ,减产 5% ~ 30% ,严重影响油
菜产量和品质,使出油量锐减[1]。 目前,尚缺乏抗
油菜菌核病菌的品种,化学防治仍然是控制该病的
最有效措施之一。 从 20 世纪 70鄄90 年代主要采用
以多菌灵为代表的苯并咪唑类内吸性杀菌剂,为控
制该病害的发生、发展和流行发挥了巨大的作用。
但随着该类药剂长期的单一使用,在我国的东南沿
海地区抗药性问题严重,使多菌灵逐渐丧失了防治
该病害的实用价值[2 ~ 4];从 20 世纪 90 年代以来,
摇
摇 5 期 摇 陈长军,等:利用实时荧光定量 PCR技术检测油菜菌核病菌
主要推广二甲酰亚胺类杀菌剂如腐霉利、异菌脲、
菌核净等防治该病,取得良好的效果。 然而本实验
室于 2008 年在江苏省发现了田间对菌核净具有低
抗水平的菌株[5]。 因此,对该病菌的发生与发展
趋势进行预测预报,建立病害发生、发展、流行的预
警体系,对于该病害的可持续控制具有重要意义。
实时定量 PCR 是近年来发展起来的一种检测技
术,它利用荧光信号实时监测体外 DNA 分子 PCR
复制过程中每个循环的扩增产物,实现对 DNA 模
板进行定量和定性分析,具有准确、快速、灵敏等优
点。 根据荧光检测方法的不同,主要分为三种类
型:(1)SYBR Green玉为荧光染料,采用普通引物,
但要求在 PCR 反应过程中不能有非特异性扩增,
如错配和引物二级结构等;(2)Taqman 荧光探针;
(3)分子信标(Molecular beacon)技术。 后两种均
需要合成特异性的探针,价格不菲。 实时定量
PCR技术在动、植物基因工程和检疫、微生物鉴定
与分类、食品安全检测和医学等领域中得到广泛应
用。 在植物病理学中主要运用于病原菌群体[6 ~ 9]、
抗药性病原菌亚群体[10]和基因表达[11]等的检测。
目前,国内外对油菜菌核病菌的研究主要侧重于病
原生物学[12 ~ 14]、致病机理[15 ~ 18]、功能基因组
学[19,20] 和生物防治[21,22] 等方面。 仅 Freeman
等[23]利用该病原菌的基因间隔序列( ITS)特异性
建立了对该病原菌常规 PCR 检测技术,Yin 等[24]
利用微卫星引物 M13 扩增片段的特异性建立了对
该病原菌实时定量 PCR检测技术。 油菜菌核病菌
的 茁鄄微管蛋白基因 [GenBank 登录号 AY312374
(核苷酸序列),AAP579404 (所编码的蛋白质序
列)]核苷酸序列全长 1 768 bp,编码 447 个 aa,含
有 4 个内含子,通过比较分析,发现该基因内含子
序列具有较高的特异性[25]。 本文拟利用 茁鄄微管蛋
白基因内含子核苷酸序列特异性,设计 SYBR
Green玉荧光实时定量 PCR 引物,以菌核为材料,
建立油菜菌核病菌的实时定量 PCR检测技术。
1摇 材料与方法
1. 1摇 菌株
2002 年,对采自江苏省通州市金沙镇、兴仁
镇、唐洪镇和沙产镇共 18 个田块的 200 个油菜菌
核病的菌核进行了常规组织分离,即从每一菌核上
切下一小块,在 0. 1 %次氯酸钠溶液中消毒 5 min
后置滤纸上干燥,再置于 PSA 培养基上培养
(23益)。
本实验室保存的、对多菌灵高抗的 JSJ14 菌株
及对多菌灵敏感的野生菌株 HM3,分别接种在
PDA培养基上,培养约 30 d(25益),收集新菌核用
于本试验。
2009 年 4 月,在江苏省盐城市郊种植的“秦油
11 号冶油菜上采集健茎、健叶、病叶、病茎中的菌
核。
本实验室保存的其他 5 种十字花科作物常见
病原真菌,即黑斑病菌(Alternaria oleracea)NJ鄄1、
白斑病菌(Cercosporella albo鄄maculans) NJ鄄5、黑
胫病菌(Phoma lingam) YC鄄1、灰霉病菌(Botrytis
cinerea)NJ鄄12、炭疽病菌(Colletotrichum gloeospo鄄
rioides) YC鄄18,分别在 PDA 上培养后,小心刮取
培养基表面约 20 mg菌丝体。
还有 3 种十字花科作物病原真菌,即白锈菌
(Albugo bliti)NJ鄄3、霜霉病菌(Peronospora parasit鄄
ica)和白粉菌(Erysiphe cruciferarum)都是直接来
自活体病样,用无菌水将病样表面的病原菌洗下并
离心收集,用于 DNA提取。
1. 2摇 基因组 DNA的提取
1. 2. 1摇 油菜菌核基因组 DNA的提取[25] 摇 称取新
菌核 30 ~ 50 mg,0. 1% NaClO3消毒 5 min后,加入
1. 5 mL基因组 DNA提取缓冲液和少量石英砂,充
分研磨,60益温育 20 min,10 000 rpm 离心 4 min
后,上清液用等体积苯酚:氯仿:异戊醇(25 颐 24 颐 1)
抽提 1 ~ 2 次,上清液加等体积异丙醇沉淀干燥后
溶于 200 滋L TE(含 20 mg·L -1 RNAase),37益水
浴 10 min。 取 2 滋L电泳检测。 紫外分光光度计检
测其含量及纯度后用于实时定量 PCR 扩增。 油菜
茎和叶的 DNA提取同上。
1. 2. 2摇 其他供试真菌基因组 DNA 的提取摇 将所
收集的 8 种供试真菌的菌丝体冷冻干燥后,分别用
少量石英砂充分研磨,加 500 滋L 提取缓冲液(100
mmol·L -1 LiCl; 10 mmol·L -1 EDTA;10 mmol
·L -1 Tris鄄HCl, pH 8. 0;10 g·L -1 SDS),充分震
荡,60益温育 30 min,10 000 rpm离心后用苯酚:氯
仿:异戊醇(25:24:1)抽提 2 次至无中间层,上清
液加 1 倍体积异戊醇沉淀,离心,干燥后溶于
50 滋L TE(含 20 mg·L -1 RNAase)。
715
摇
植物病理学报 41 卷
1. 3摇 实时定量 PCR引物的设计及特异性验证
S. sclerotiorum 与其他常见植物病原丝状真
菌的 茁鄄微管蛋白基因在氨基酸水平上同源性高达
95. 78% ~ 97. 66% ,但所含内含子数目及大小不
同。 利用油菜菌核病菌 茁鄄微管蛋白基因(基因登
录号 AY312374)第 4 个内含子(1291鄄1239)核苷
酸序列良好的特异性,设计了引物对 SclSF (5忆鄄
CTCAAATCTCCGAAAGTT鄄3忆) / SclAF ( 5忆鄄TG鄄
CAGACGGGTAATATG 鄄3忆),由上海生工生物技
术公司合成。 该引物对中下游引物 SclAF 与 茁鄄微
管蛋白基因反义 DNA链 1265鄄1249 位的核苷酸结
合,该区域正好位于第 4 个内含子(1291鄄1239)中。
50 滋L常规 PCR反应体系含 dH2O(灭菌蒸馏
水)34. 9 滋L;10 伊 buffer(不含 Mg2 + ) 5 滋L;MgCl2
(25 mmol· L -1 ) 5滋L; dNTP (10 mmol· L -1 )
1滋L;引物 SclSF、SclAF(2. 5 滋mol·L -1 )各 0. 8
滋L; DNA模板(50 滋g·mL -1)2 滋L;Taq DNA 聚
合酶(5 U·滋L -1)0. 5 滋L。 扩增条件:95益预变性
10 min;94益变性 35 s,55. 8益退火40 s,72益延伸
40 s,共 35 个循环;72益延伸 5 min。 扩增后的
PCR产物在 2 %琼脂糖凝胶上进行分析。
以油菜菌核病菌 HM3、JSJ14 菌株、油菜病茎、
油菜病叶以及上述其他 8 种十字花科作物常见病
原真菌的基因组 DNA 为模板,油菜健茎和健叶的
DNA模板为阴性对照,检验引物对 SclSF / SclAF
对不同真菌和不同表型核盘菌的特异性。 扩增体
系、温度参数和凝胶分析方法同上。
1. 4摇 实时定量 PCR反应体系的优化
为了保证实时定量 PCR检测的稳定性和可靠
性,选用了宝生物工程(大连)有限公司的 SYBR襅
remix Ex TaqTM (Perfect Real Time) DRR041S 试
剂盒。 该试剂盒中的酶、Mg2 + 、dNTP 等已经通过
优化,只需加入模板和引物,因此,本试验只对退火
温度和引物浓度进行优化。 以无菌蒸馏水为空白
对照,纯化后的核盘菌 HM3 菌株基因组为阳性对
照;纯化后的 YC鄄18 菌株(炭疽病菌)DNA 模板作
为阴性对照。
1. 4. 1摇 退火温度摇 试验中以引物 SclSF、SclAF 的
退火温度 57益为基础,以 0. 3益的幅度微调,共设
57. 3、57. 6、57. 9、58. 2、58. 5 和 58. 8益 6 个处理,
分别进行实时定量 PCR 扩增,筛选最佳的退火
温度。
1. 4. 2摇 引物浓度摇 引物浓度共设 7 个浓度,分别
为 0、0. 1、1. 2、1. 4、1. 6、1. 8 和 2. 0 滋mol·L -1;进
行实时定量 PCR扩增后,筛选最佳的引物浓度。
1. 4. 3摇 实时定量 PCR灵敏度摇 实时定量 PCR 模
板标准品是从核盘菌 HM3 菌株中提取的基因组
DNA,然后经过 0. 7%琼脂糖电泳,割胶,纯化后获
得。 将标准品模板梯度稀释成 11 个梯度,分别为
140、14、1. 4、1. 4 伊 10 -1、1. 4 伊 10 -2、1. 4 伊 10 -3、
1郾 4 伊 10 -4、1. 4 伊 10 -5、1. 4 伊 10 -6、1. 4 伊 10 -7和
0 ng·滋L -1,分别用引物定量扩增; PCR 产物用
2%琼脂糖凝胶电泳进行分析。
1. 4. 4摇 油菜菌核病菌总量标准曲线的建立摇 建立
标准曲线的模板浓度设置:将 JSJ6 菌株基因组
DNA的标准品用 dH2O(灭菌蒸馏水)稀释成 6 个
浓度梯度,分别为 140、14、1郾 4、1. 4 伊 10 -1、1. 4 伊
10 -2和 1. 4 伊10 -3 ng·滋L -1,置于 -20益待用。
实时定量 PCR 25 滋L 反应体系:dH2O(灭菌
蒸馏水)9. 5 滋L; SYBR襅 Premix Ex TaqTM(2 伊 )
12郾 5 滋L;SclSF(2. 5 滋mol·L -1)0. 25 滋L;SclAF
(2. 5 滋mol·L -1 ) 0. 25 滋L;ROX Reference Dye
(50 伊 )0. 5 滋L;核盘菌 JSJ6 菌株的 DNA 标准品
模板 2. 0 滋L。 炭疽病菌 YC鄄18 菌株的 DNA 模板
作为阴性对照,以水替代 DNA为空白对照。
扩增条件(两步法):摇 95益预变性 10 s;95益
变性 5 s,55. 8益退火 31 s,共 40 个循环;72益延伸
5 min。
1. 5摇 实时定量 PCR检测样本
从采集的 200 个菌核中逐个精确称取 15. 00
mg,混匀后提取基因组 DNA,用紫外分光光度计
检查浓度,并将其稀释至 140 ~ 1. 4 伊 10 -3 ng·
滋L -1之间。 以抗性菌株 JSJ 14 和敏感菌株 HM3
提取的基因组作为阳性对照,炭疽病菌 YC鄄18 菌
株的 DNA模板作为阴性对照,以水替代模板为空
白对照。 扩增条件同 1. 4. 4。
2摇 结果
2. 1摇 实时定量 PCR引物特异性
利用十字花科作物上常见的 8 种病原真菌的
核基因组为模板进行常规 PCR 扩增,检验了所设
计引物对 SclSF / SclAF 的特异性。 经 PCR 扩增和
815
摇
摇 5 期 摇 陈长军,等:利用实时荧光定量 PCR技术检测油菜菌核病菌
凝胶电泳分析,结果表明,引物对 SclSF / SclAF 能
够将对多菌灵产生高抗水平菌株 JSJ14、野生敏感
菌株 HM3 从供试的其他 8 种病原菌中特异性地
检测出来,显示了良好的特异性(图 1)。
利用所筛选的引物对 SclSF / SclAF 的常规
PCR检测了 2009 年采集了油菜的病叶和病茎中
油菜菌核病菌,其中健茎和健叶为阴性对照。 结果
表明,引物对 SclSF / SclAF 具有很好的特异性
(图 2)。
2. 2摇 SYBR GREEN玉荧光染料定量 PCR 体系
优化
2. 2. 1摇 退火温度摇 Tm 值是反应扩增特异性的重
要参数。 如果退火温度过低,就会产生非特异性扩
增,所以选择较高的退火温度能够大幅减少引物与
模板之间的非特异性结合,提高 PCR 反应的特异
性,但太高的退火温度又会降低扩增效率,为此进
行了优化。 引物对 SclSF / SclAF 的退火温度以
57益为基础,采用 0. 3益的幅度微调,结果表明,引
物对 SclSF / SclAF 在退火温度为 55. 8益时检测结
果较好;而在其他测试温度下,扩增曲线呈锯齿状,
扩增特异性差。
2. 2. 2摇 引物浓度摇 当引物浓度太低,则定量 PCR
扩增产物降低,易出现假阴性;引物浓度过高,则促
进引物的错误引导,导致非特异性产物合成,增加
引物二聚体形成机率,造成假阳性。 利用 SYBR襅
Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) DRR041S 试
剂盒说明书推荐的反应体系进行扩增时,由于引物
浓度(0. 2 滋mol·L -1)太高,即使未加模板的阴性
水对照(NTC)在反应进入 35 个循环后也会产生
非特异性扩增信号(图 3鄄A),因此在 0. 1 ~ 0. 2
滋mol·L -1范围内调整引物浓度,最终确定引物最
佳浓度为 0. 1 滋mol·L -1。 此时扩增效率较高,且
基线平整,阴性对照(NTC)无信号检出(图 3鄄B)。
2. 3 摇 SYBR GREEN玉荧光染料定量 PCR 的
灵敏度
将菌株 JSJ6 基因组 DNA 的标准品梯度稀释
成 10 个梯度(140 ~ 1. 4 伊10 -7 ng·滋L -1),进行引
物对 SclSF / SclAF定量扩增。 扩增结果表明,当模
板浓度小于 1. 4 伊 10 -3 ng / 滋L,其扩增曲线的荧光
值低于阈值(图 4鄄A);扩增产物经 1. 5 %琼脂糖凝
胶电泳检测,当模板浓度小于 1. 4 伊 10 -2 ng·
滋L -1时无电泳条带(图 4鄄B), 即普通 PCR 方法检
出样本的最低浓度为 1. 4 伊 10 -1 ng · 滋L -1。
SYBR GREEN玉荧光染料定量 PCR可检测到的样
本浓度最低值为 1. 4 伊 10 -3 ng·滋L -1,因此,该检
测方法的灵敏度是普通 PCR 检测方法的 10 ~
100 倍。
Fig. 1摇 Specificity of the primers SclSF / SclAF in conventional PCR amplification using
genomic DNA extracted from eight other crucifer pathogens
Lane 1鄄10:gel electrophoretic analysis of conventional PCR amplification products obtained with the templates from Alternaria
oleracea NJ鄄1, Cercosporella albo鄄maculans NJ鄄5, Phoma lingam YC鄄1,Peronospora parasitica, Albugo bliti NJ鄄3, Erysiphe
cruciferarum, Botrytis cinerea NJ鄄12, Colletotrichum gloeosporioides YC鄄18, Sclerotinia sclerotiorum HM3 and JSJ14, respec鄄
tively; M: DNA ladder, TaKaRa DL2000.
915
摇
植物病理学报 41 卷
Fig. 2 摇 Specificity of the primer pair SclSF /
SclAF in conventional PCR amplifica鄄
tion using Sclerotinia sclerotiorum
genomic DNA template from dis鄄
eased and healthy stems and leaves
Genomic DNA template was extracted from the samples of
diseased leaves (Lane 1) and stems(Lane 3), healthy leaves
(Lane 2) and stems(Lane 4), respectively. (M: DNA lad鄄
der, TaKaRa DL2000. )
2. 4摇 核盘菌总量标准曲线
根据灵敏度试验中确定的检测限,将菌株 JSJ6
基因组 DNA的标准品梯度稀释成 6 个梯度:140 ~
1. 4 伊 10 -3 ng·滋L -1,用引物 SclSF、SclAF 扩增,
得到的扩增图谱中,荧光值增加时对应的循环数与
用于定量的标准品的浓度梯度呈负相关性(图 5、
图 6),得到的标准曲线线性方程为:Y = -3. 41X +
27. 30,相关系数为 R2 = 0. 999 (Y: Ct,X: 模板质
量对数)。
2. 5摇 定量 PCR产物的熔解曲线
从熔解曲线分析定量 PCR体系反应产生的扩
增产物可知,引物对 SclSF / SclAF扩增得到的产物
熔解温度(Tm)为 83. 8益 (图 7)波峰高低与模板
浓度成正相关性;基线平稳,只有1个熔解峰,证
Fig. 3摇 Amplification comparison with the primers at the un鄄optimized(A) and optimized(B)
concentrations in the quantitative real鄄time PCR
The cycle number is plotted versus the Delta Rn. Delta Rn represents the Rn minus the baseline signal established in the early
PCR cycles. The bold line represents threshold value(Figure B), the six curves above the threshold line represent the six gradient
concentrations of genomic DNA of Sclerotinia sclerotiorum JSJ2 (The six curves: the more the left side, the higher the concen鄄
tration) . NTC represents three baselines: two for blank control ( template = water), one for nagetive control ( template = genomic
DNA from the Colletotrichum gloeosporioides strain YC鄄18) .
025
摇
摇 5 期 摇 陈长军,等:利用实时荧光定量 PCR技术检测油菜菌核病菌
Fig. 4摇 Quantitative amplification curve from different concentrations of template
DNA(A) and PCR product analysis by agarose gel electrophoresis(B)
B: Agarose gel analysis of PCR amplification products obtained with the different concentrations of template DNA. The template
DNA concentrations: Lane 1 to 6 represents 1. 4 伊 10 -3,1. 4 伊 10 -2, 1. 4 伊 10 -1, 1. 4, 14 and 140 ng / 滋L, respectively. M:
DNA ladder, TaKaRa DL2000.
Fig. 5摇 Quantification amplification curve of the primer pair SclSF / SclAF
125
摇
植物病理学报 41 卷
Fig. 6摇 Standard Curve for the sum of Sclerotinia sclerotiorum
Fig. 7摇 Dissociation Curve of realtime鄄PCR products obtained
with the primer pair SclSF / SclAF
225
摇
摇 5 期 摇 陈长军,等:利用实时荧光定量 PCR技术检测油菜菌核病菌
明无引物二聚体产生和非特异性扩增,产物特异
性好。
2. 6摇 检测
由于所建立的标准曲线反映循环数与实时定
量 PCR 模板核 DNA 标准品起始量之间的线性关
系。 因此,就可将待测样品在实时定量 PCR 过程
中的循环数代入标准曲线,从而求出与该循环数相
对应的、作为模板核 DNA 的起始量。 测定结果表
明,引物对 SclSF / SclAF能够定性定量地检出油菜
菌核病菌,包括对多菌灵的野生敏感菌株和抗药性
菌株,其中 JSJ14、HM3 和待测样品中 DNA群体数
量分别为(25. 11 依0. 18) ng、(26. 05 依 0. 32)ng 和
(23. 93 依0. 10)ng。
3摇 讨论
本文利用油菜菌核病菌 茁鄄微管蛋白基因建立
了该病原菌实时定量 PCR检测方法。 在油菜菌核
病菌中,茁鄄微管蛋白基因是一个结构基因,编码区
序列与其他植物病原真菌具有高度同源性。 经过
比较和分析,发现该基因的内含子具有一定的特异
性,为本研究的引物设计奠定基础;通过扩增条件
的优化,建立了油菜菌核病菌群体的实时定量
PCR体系和扩增条件,标准曲线为 Y = - 3. 41X +
27. 30,R2 =0. 999 (Y: Ct,X: 模板质量对数)。 该
方法可用于对病叶和病茎中靶标病原菌的高通量
实时定量检测,对该病的发生、发展和流行的预测
具有科学意义。
在本研究中,使用了对多菌灵产生高抗水平的
油菜菌核病菌,旨在利用该试验为进行抗药性油菜
菌核病菌实时定量 PCR 检测积累经验,为抗药性
病原菌的高通量实时定量 PCR 检测奠定基础。 结
果表明,所设计的引物不仅能够特异性检测多菌灵
的野生敏感菌株,而且也能够对供试的多菌灵高抗
菌株进行检测。 目前,作者所在实验室正在研究对
多菌灵抗药性菌株的实时定量 PCR 检测技术,最
终目标是实现对当季油菜菌核病菌群体结构及其
对多菌灵抗药性亚群体发生、发展、流行进行动态
预警,进而从根本上改变当年的检测结果只能用于
预测预报来年病害发生严重度的被动局面。
本文所建立的油菜菌核病菌实时定量 PCR 检
测技术具有一定的创新性。 Freeman 等[23]使用的
是油菜菌核病菌中 16S rDNA 和 23S rDNA 基因
间隔序列( ITS),根据该序列的特异性,建立了普
通的 PCR检测方法;Yin 等[24]则利用该病原菌的
微卫星引物 M13 扩增片段的特异性建立了实时定
量 PCR 检测方法。 本文选择的是 茁鄄微管蛋白基
因,巧妙地利用该基因开放阅读框(ORF)中第 4
个内含子核苷酸序列的特异性,将下游引物成功地
设计在该内含子区域,打破了物种分子检测选择基
因间隔序列( ITS)和微卫星序列等保守核苷酸序
列的常规方法,丰富了建立物种分子检测方法过程
中特异性核苷酸序列的选择范围。
该病原菌以菌核在土壤、病残体和种子中越夏、
越冬。 翌年春天在适温下形成子囊盘,再产生子囊
孢子弹射后直接侵染或者形成菌丝后侵入寄主;在
田间子囊孢子通常侵染花瓣,带菌花瓣脱落至叶或
者茎,导致叶、茎发病。 病害的发生和流行主要取决
于越冬菌核数量、2 ~ 4 月的气候条件、油菜盛花期
和子囊盘盛发期的吻合程度、栽培条件和品种的抗、
耐病性等因素[1]。 因此建立油菜菌核病菌群体高通
量检测技术对把握该病害的发生、发展和流行态势
提供技术支撑,为科学控制该病具有指导意义。 本
研究如果利用所建立的检测技术检测腐花和空气中
油菜菌核病菌子囊孢子群体,则使所研发的检测方
法更具实用价值。 因为,在病原菌侵染初期,空气中
子囊孢子是最重要的接种体之一。 如果能检测空气
中的靶标病原菌,对该病害流行态势的及时预警,以
及对油菜的生产具有十分重要的指导意义。
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曾晓葳
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