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Pathogen identification of soapberry stem canker, a newly found disease in China

无患子枝干新病害-溃疡病病原鉴定



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  44(2): 208 ̄212(2014)
收稿日期: 2012 ̄06 ̄06ꎻ 修回日期: 2013 ̄10 ̄14
基金项目: 浙江省教育厅高校科研计划项目(Y201017492)ꎻ宁波市镇海区科技局计划项目(2069999 ̄53)
第一作者: 王志龙ꎬ男ꎬ浙江奉化人ꎬ副教授ꎬ主要从事园林植物病理学研究ꎻE ̄mail:wangzhl01@163.comꎮ
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研究简报
无患子枝干新病害-溃疡病病原鉴定
王志龙1ꎬ 王 胜2ꎬ 谭志文2ꎬ 何月秋1
( 1宁波城市职业技术学院ꎬ 宁波市园林植物开发重点实验室ꎬ宁波 315502ꎻ 2浙江万里学院生物与环境学院 宁波 315100)
Pathogen identification of soapberry stem cankerꎬa newly found disease in China 
WANG Zhi ̄long1ꎬ Wang Sheng2ꎬ TAN Zhi ̄wen2ꎬ HE Yue ̄qiu1   ( 1 Ningbo City College of Vocational Technologyꎬ
key Lab of Landscape Plant Utility of Ningbo Cityꎬ Ningbo 315502ꎬChinaꎻ2 College of Biological & Environmental Sciencesꎬ
Zhejiang Wanli UniversityꎬNingbo 315100ꎬChina)
Abstract: The stem canker disease of Sapindus mukorossi was investigated in NingboꎬZhejiang Provinceꎬ
China. A fungus was isolated from the diseased stems and tested for pathogenicity according to Koch’s postu ̄
lation. Its rDNA ITS sequence analysis and morphological characteristics showed that it was Fusarium solaniꎬ
the anamorph of Nectria haematococca.The perithecia of N. haematococca were accasionally found in some
severely infected stems. This is the first report of the stem canker disease of Sapindus mukorossi infected by
N. haematococca in China.
Key words: Sapindus mukorossiꎻ stem cankerꎻ pathogen identificationꎻ Fusarium solaniꎻ Nectria haemato ̄
cocca
文章编号: 0412 ̄0914(2014)02 ̄0208 ̄05
    无患子(Sapindus mukorossi Gaerth.)为无患子
科无患子属的一种落叶乔木ꎬ在东南亚各国、我国
淮河以南各省及台湾省均有分布[1]ꎮ 无患子种仁
富含油脂ꎬ含油率高达 40.7%ꎬ因其树种树型美观ꎬ
秋季叶色金黄ꎬ被广泛应用于城乡园林绿化中ꎮ
    2008年 5 月ꎬ作者在浙江省宁波市进行园林
植物病虫害种类普查时ꎬ在无患子枝干上发现一种
新病害ꎮ 该病发生初期ꎬ树干表皮稍肿ꎬ病部有汁
液流出ꎬ后导致树皮溃疡腐烂ꎬ形成纵向长条状的
病斑ꎬ并逐渐干燥开裂ꎬ露出木质部ꎬ严重影响树木
的正常生长和观赏性ꎬ因此得名溃疡病ꎮ 目前ꎬ在
我国缺少对无患子病害的研究ꎮ 为明确无患子溃
疡病的病原ꎬ作者对该病害的病原物进行了分离培
养、纯化、致病性测定及 rDNA ITS 序列分析ꎬ以期
为有效控制该病害提供理论依据ꎮ
1  材料与方法
1.1  病情调查与症状观察
    于 2009 ~ 2012 年无患子溃疡病发生期ꎬ调查
浙江省宁波地区城乡公共绿地和苗圃无患子溃疡
病发生情况和发病症状ꎻ同时从发病苗圃采集发病
程度轻的苗木ꎬ栽植在宁波城市职业技术学院实习
林场内ꎬ自 3月底无患子发生新叶开始ꎬ直到 12 月
上旬落叶止ꎬ对溃疡病发生过程进行定期和固定植
株观测ꎮ
1.2  病原鉴定
1.2.1  病原菌分离   选择具有典型症状的病株ꎬ
 
  2期 王志龙ꎬ等:无患子枝干新病害-溃疡病病原鉴定
用嫁接刀刮除溃疡部位树皮ꎬ从褐色木质部切取大
约 1 mm 厚的组织薄片ꎬ经自来水冲洗ꎬ切成 2×2
mm2大小ꎬ用 0.1%升汞表面消毒 3minꎬ无菌水冲
洗 3 遍ꎬ然后将组织块置于马铃薯葡萄糖琼脂
(PDA)培养基上ꎬ于 28℃恒温培养箱中培养 36 ~
48 hꎬ待组织块周围长出菌丝时ꎬ挑取边缘菌丝转
接培养ꎬ即获得纯分离菌株[2]ꎮ
1.2.2  致病性测定  选取树干径粗 6 ~ 7 cm 的健
康无患子植株 140株ꎬ在植株主干距地面 30 cm以
上部位选定 2个点作为接种点ꎬ每个接种点间隔不
少于 40 cmꎮ 先用无菌水冲洗树干表皮ꎬ再用沾有
70%的酒精脱脂棉球轻轻擦拭主干部位接种处ꎬ然
后用无菌水棉球搽洗 3次ꎬ最后用灭菌接种针轻轻
刺破其表皮(16针 / cm2)ꎬ备用ꎮ 选择 PDA上培养
的 B61、B63 和 B65 3 个菌株作为待测菌株ꎬ采用
菌丝块接种ꎬ用直径 5 mm 打孔器从 PDA 培养基
上 25℃培养 5 d(未见明显产孢)的菌丝边缘切取
菌苔ꎬ将菌苔正面粘贴于受伤的接种处ꎮ 每菌株接
种 40个植株ꎬ共 80个接种点ꎬ每接种点接 1 菌苔ꎮ
接种后包上无菌的湿润脱脂棉和 PE 保鲜膜保湿ꎮ
以 20个植株 40个接种点接无菌 PDA 培养基为对
照ꎮ 接种 10 d 后开始观察记录发病情况ꎬ对试验
中表现典型症状的植株按 1.2.1 再次作病原菌分
离ꎮ
1.2.3  病原菌形态学观察  将供试菌株和经致病
性测定后再分离获得的菌株接种到 PDA 培养基
上ꎬ28℃ 12 h 光照 / 12 h 黑暗恒温培养 4 d 后ꎬ观
察菌落培养性状ꎬ测量菌落大小ꎮ 待产孢后ꎬ通过
显微镜观察病原菌分生孢子形态特征ꎮ 根据病菌
生长速度、菌落形态特征和产孢特征ꎬ查阅真菌分
类资料确定病原菌种类ꎮ
1.2.4  病原菌的分子鉴定   真菌 DNA 基因组提
取参照 Li[3]改良 SDS法ꎮ 采用通用引物 ITS1(5′ ̄
TCCGTAGGTGAACCTGCGG ̄3′)和 ITS4 ( 5′ ̄TC ̄
CTCCGCTTATTGATATGC ̄3′)对真菌全长 ITS区
序列(包含 18S rDNAꎬ28S rDNA 的部分序列和中
间的 ITS1区、5.8S rDNA、ITS2 区的完整序列)进
行 PCR扩增ꎮ
    rDNA ̄ITS 扩增 50 μL PCR 反应体系中加入
通用引物对ꎬ真菌基因组模板以及 PCR 试剂盒中
的相关试剂ꎮ PCR 反应条件如下:94℃ 2 minꎻ
94℃ 30 sꎬ55℃ 30 sꎬ72℃ 50 sꎬ35 个循环ꎻ72℃
7 minꎮ 将 PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳、染色
和紫外检测ꎮ
    DNA ̄ITS 测序与分析   将扩增得到的 PCR
产物送交杭州华大基因研究院经纯化后进行测序ꎮ
将测序结果提交 NCBI(美国国家生物技术信息中
心)的 GenBank 进行 BLAST 搜索和同源性比对ꎬ
选取同源性较高的序列ꎬ使用 clustalx 和 MEGA 4
生物信息软件以 Neighbor-joining 方法构建系统
发育树ꎬ选取 Thanatephorus cucumeris(EF429316)
作为外群ꎬ经过 bootstrap法 1 000次循环检验系统
发育树的可靠性ꎮ
2.1  病害危害与症状
    作者历时 3年抽样调查了浙江省宁波市 21 条
绿化带、6个公园和 14 个苗圃内 1 284 株无患子ꎬ
溃疡病平均发病株率 27.02%ꎮ 据观察ꎬ该病在当
地 4月中旬开始表现病害症状ꎬ5 月份症状发生严
重ꎬ在 6月~7月上旬多雨天气病情扩大蔓延ꎬ7 月
中旬由于气温高ꎬ症状不再扩展ꎬ待次年继续发展ꎮ
    发病初期ꎬ树干表皮产生圆形或椭圆形的水渍
状变色斑块ꎬ稍肿大ꎬ病斑上有汁液流出ꎬ后病斑逐
渐扩大ꎬ病部表皮和皮层开始腐烂ꎬ干燥后脱落ꎬ露
出木质部ꎬ常因纵向扩展快ꎬ横向扩展慢ꎬ形成纵向
长条状病斑ꎬ严重时纵裂长度达 1 m 以上(图 1aꎬ
bꎬc)ꎻ夏季温度升高后病斑停止扩展ꎬ周缘逐步形
成明显愈伤组织ꎻ在次年春季条件适宜时病部继续
扩展ꎬ发病 2~3年后病斑环绕树干大部ꎬ导致树木
枯死ꎮ 枯死病树根部仍有活力ꎬ可以产生分蘖ꎮ 树
主干横切面大部分生长正常ꎬ病斑一侧木质部颜色
变为深褐色(图 1 d)ꎮ
    在进行野外症状观察和病情调查时ꎬ发现少数
发病严重植株病部表面长出大量红色小点颗粒ꎬ经
镜检为有性子实体-子囊壳ꎮ 子囊壳成丛表生ꎬ球
形或近球形ꎬ鲜红色ꎬ直径 230 μm~ 280 μm(图 2
a)ꎬ子囊棍棒状ꎬ55~65 μm×7~ 9 μmꎬ内含 8 个子
囊孢子(图 2 b)ꎻ子囊孢子梭形ꎬ无色ꎬ双胞ꎬ隔膜
处稍缢缩ꎬ12~17 μm×4~6.4 μm(图 2c)ꎮ 其形态
符合红球丛赤壳 Nectria haematococca Berk et Br.
的特征(图 2)ꎮ
902
 
植物病理学报 44卷
Fig. 1  Symptoms of soapberry stem canker in field
a:Early symptomꎻb:Metaphase symptomꎻc:Late symptomꎻd:Cross sectionꎻe:Longitudinal sectionꎻ       
f:Symptom after months of inoculation.
Fig. 2  Teleomorph stage of soapberry stem canker pathogen
a: Ascocarpsꎻbꎬc:Asci and ascospores.
2.2  致病性测定
    作者经 4次分离培养ꎬ从 26株病树的 48 个病
组织样品中分离纯化获得 41个具有一致典型镰孢
菌菌落特征的菌株ꎬ均属同一种真菌ꎬ未见细菌和
其他霉菌菌落ꎮ
    用菌株 B61、B63 和 B65 分别接种 40 个植株
80个接种点ꎬ共成功接种 120 个植株 239 个接种
点ꎬ对照接种 20个植株 40个接种点ꎮ
    致病性测定试验结果表明ꎬ菌株 B61、B63 和
B65均能引起无患子溃疡病症状(表 1)ꎮ 接种 30
d后ꎬ发病率分别为 92.50%、65.82%和 76.25%ꎮ 3
个菌株间致病力存在差异ꎬB61 菌株致病力最强ꎬ
接种 38个植株 74个接种点表现树皮腐烂和开裂ꎬ
占 92.5%ꎬ其中 29个植株 58个接种点表现树皮龟
裂ꎬ皮内木质部变褐色ꎬ占 72.5%(图 1 eꎬ f)ꎮ 经
再次病菌分离培养ꎬ均能从变褐木质部分离到同一
种真菌ꎬ由此证明 B61、B63 和 B65 为无患子溃疡
病的致病菌ꎮ
012
 
  2期 王志龙ꎬ等:无患子枝干新病害-溃疡病病原鉴定
Table 1  Inoculation test of soapberry stem canker pathogen on Sapindus mukorossi
Isolate
Number of
inoculated plant
Number of
inoculated site
Number of diseased site Incidence (%)
10 d 30 d 10 d 30 d
B61 40 80 50 74 65.79 92.50
B63 40 79 34 52 43.03 65.82
B65 40 80 42 61 52.5 76.25
CK 20 40 0 0 0 0
 
2.3  病原菌形态特征
    从野外自然发病植株和经致病性测定后发病
植株分离所获得的菌株形态特征一致ꎮ 代表菌株
B61在 PDA 上的菌落呈圆形ꎬ灰白色ꎬ背面土黄
色ꎬ气生菌丝较少ꎬ薄绒状ꎬ白色至浅灰色(图 3 aꎬ
b)ꎻ在 PDA 上 28℃培养 4 d 可产生小型分分生孢
子ꎬ培养 7 ~ 8 d 可产生大型分生孢子ꎮ 小型分生
孢子数量多ꎬ自单瓶梗生出ꎬ假头状着生ꎬ近卵圆
形ꎬ0~1 隔ꎬ单胞小孢子 2.5 ~ 12.5 μm×2.0 ~ 5.0
μm(平均 5.7 μm×3.0 μm)ꎻ双胞小孢子 14. 5 ~
30.0 μm×3.3~5.3 μm(平均 18.0 μm×4.5 μm)(图
3 c)ꎮ 大型分生孢子镰刀形ꎬ两端较钝ꎬ顶胞稍弯ꎬ
3~6个细胞ꎬ多数 4 ~ 5 个细胞ꎻ3 个细胞的大孢子
17.8~ 35.0 μm×5.5 ~ 4.3 μm(平均 24.1 μm×4.9
μm)ꎻ4个细胞的大孢子 42.5 ~ 22.5 μm×3.5 ~ 7.5
μm(平均 30.7 μm×4.9 μm)ꎬ5 个细胞的大孢子
35.0~ 51.3 μm×7.0 ~ 4.5 μm(平均 43.6 μm×5.3
μm)ꎬ6个细胞的大孢子 40.0 ~ 52.5 μm×5.0 ~ 7.0
μm(平均 50.0 μm×5.5 μm) (图 3 d)ꎮ 根据镰孢
菌分类资料[4]ꎬ将该菌鉴定为茄镰孢 Fusarium
solani (Mart.) Sacc.ꎮ
2.4  病原菌的分子鉴定
    通过对菌株 B61、B63 和 B65 基因组 rDNA
ITS ̄PCR扩增ꎬ均获得 600 bp 左右的单一条带ꎮ
经测序其全长为 484 bp (GenBank 登录号 B61ꎬ
KC708583ꎻB63ꎬKC708584ꎻ   B65ꎬKC 708584)ꎮ
通过 GenBank BLAST 搜索和比对获得大量序列
高度同源的菌株ꎮ 经采用 clustalx 和 MEGA 4 软
件分析ꎬ以 Neighbor ̄Joining方法构建系统发育树ꎮ
结果表明ꎬ 菌株 B61、 B63 和 B65 与茄镰孢
F. solani (ATCC MYA ̄4552ꎬ FJ914886) 聚为一
簇ꎬ序列同源性达 100%ꎬ表明为同一种真菌ꎻ而
且ꎬ 该 簇 又 与 有 性 型 Nectria haematococca
(AF178395)聚在一起ꎬ序列同源性达 100%ꎬ表明
该病菌的无性型和有性型属于同一种真菌ꎮ
3  结论与讨论
    茄镰孢 F. solani在真菌分类系统中隶属于无
性型真菌(Anamorphic fungi)、丝孢纲(Hyphomy ̄
cetes)、瘤座孢目(Tuberculariales)、瘤座孢科(Tu ̄
berculariaceae)、 镰刀菌属 ( Fusarium )ꎬ 马特组
(Section Martiella )ꎮ 有性阶段属于肉座菌科
(Hypocreaceae)、丛赤壳属(Nectria) [4]ꎮ 该菌分布
非常广泛ꎬ普遍存在于土壤ꎬ能侵染多种木本植物
发生溃疡病或茎腐病ꎮ 近年来ꎬ国外报道了由
F. solani引起的胡桃木溃疡病、悬铃木溃疡病、复
叶槭溃疡病和番木瓜茎腐病ꎮ 在我国ꎬ部分地区也
Fig. 3  Colony and characteristics of soapberry stem canker pathogen growing on PDA
a:Colony (11d) ꎻb:Reverse colony (11d)ꎻc:Conidiogenous cells and microconidiaꎻd:Macroconidia.
112
 
植物病理学报 44卷
发现了由 F. solani 引起的花椒溃疡病、银鹊树溃
疡病和杨树溃疡病ꎮ 无患子溃疡病是浙江省宁波
市新发生的树干病害ꎬ通过对病原菌的分离培养、
形态学观察、生物学特性及致病性测定ꎬ证明引起
无患子溃疡病的病原菌为茄镰孢 F. solani(有性型
为红球丛赤壳 Nectria haematococca)ꎬ并得到了
rDNA-ITS序列分析结果的支持ꎮ 在自然条件下ꎬ
在少数重症发病植株的溃疡部位可发生有性态的
子实体ꎬ这是 Nectria haematococca 引起无患子溃
疡病的新报道ꎮ
参考文献
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CMIꎬ1971ꎬ14-15ꎬ27-31ꎬ44-58ꎬ122-154.
责任编辑:张宗英
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