全 文 :书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
!"#&(#"(#)
&修改稿收到日期$
!"#$("#("$
基金项目$国家重点基础研究发展计划"
!"#$01#$"&"!
#&国家自然科学基金"
$#&+2#32
#&西北农林科技大学科研启动基金"
4#"2"!#%"&
#
作者简介$陈晓丽"
#22"
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物水分生理生态研究
5(67-8
$
9:;/<-7=8-!$
!
#)%*9=6
"
通信作者$邓西平!博士!教授!博士生导师!主要从事植物水分生理生态研究
5(67-8
$
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?
<
@!
6.*-.A9*79*9/
过表达
12,(
基因甘薯增强抗旱性的生理机制
陈晓丽#!!李红兵!!王林林#!!李孟洁!!李雨霖!!郭尚洙%!邓西平!"
"
#
西北农林科技大学 生命科学学院!陕西杨陵
+#!#""
&
!
中国科学院水利部水土保持研究所 黄土高原土壤侵蚀与旱地农业国
家重点实验室!陕西杨陵
+#!#""
&
%
韩国生命工学研究院!韩国大田#
摘
!
要$以超表达甘薯橙色基因"
!"#$
#的转基因甘薯"
BC
#以及非转基因甘薯"
DB
#为实验材料!通过
#$E
聚乙二
醇
)"""
"
F5G()"""
#模拟干旱条件!研究转基因与非转基因甘薯幼苗在水分胁迫不同时间的光合系统!膜脂过氧化
及抗氧化防御系统中主要指标的变化情况!探讨转基因甘薯耐旱性的生理机制结果显示$"
#
#随
F5G()"""
胁迫
时间延长!甘薯叶片的叶绿素(类胡萝卜素含量及其叶片净光合速率(气孔导度(胞间
0H
!
浓度(蒸腾速率都显著降
低!但转基因株系降低幅度小于非转基因植株"
!
#在正常供水和水分胁迫下!超表达
!"#$
基因甘薯叶片中
H
)
!
(
IJK
含量均低于非转基因甘薯!即转基因甘薯具有较低的活性氧水平且脂膜受损伤较小"
%
#
F5G()"""
胁迫
!&
:
后!甘薯叶片中
CHJ
(
FHJ
酶活性均增加!
&3:
达到最大值!且转基因甘薯中
!
种酶活性显著高于非转基因甘薯
研究表明!过表达
!"#$
基因可以有效减轻甘薯在水分胁迫条件下受损害的程度!且可能主要通过提高甘薯的抗氧
化胁迫能力来完成
关键词$转基因甘薯&水分胁迫&光合系统&抗氧化系统
中图分类号$
L+32
文献标志码$
K
$%&&(
)
&**#"+",12,(-&+&."+,&*/+01+2&!3"4&1+2&
5"615&75&**#+78&&59"515"
"
1
3
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#
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IJK
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&
7/X-=<->7X-\;.
]
.X;6
!!
正常条件下!植物细胞中产生的活性氧与其清
除系统保持平衡!而当环境胁迫长期作用于植株!产
生的活性氧超出了活性氧清除系统的能力时!就会
引起活性氧累积产生氧化伤害!从而使细胞功能失
常!机体出现各种自由基综合症植物体在长期进
化过程中也相应地形成了酶促和非酶促两大类保护
系统!酶促保护系统包括超氧化物歧化酶"
CHJ
#(过
氧化物酶"
FHJ
#(过氧化氢酶"
0KB
#和谷胱甘肽硫
转移酶等!非酶促系统主要包括一些抗氧化剂如抗
坏血酸"
a9
#(类胡萝卜素"
07W
#(花青素"
K/X:=9
]
7(
/-/.
#和谷胱甘肽"
GCM
#等!它们的协调作用赋予植
物体以清除活性氧的能力!减轻或避免活性氧对细
胞造成伤害!从而表现出对氧化胁迫的抗性
甘薯富含次生代谢产物!尤其是抗氧化化合物
包括花青素(类胡萝卜素和维生素
0
*
#
+
橙色薯肉
甘薯品种富含类胡萝卜素类胡萝卜素在高等植物
中参与光合作用!一方面阻止激发态叶绿素分子的
激发能从反应中心向外传递&另一方面!它也保护叶
绿素分子免遭光氧化损伤另外!类胡萝卜素作为
K1K
合成的前体!也是人类饮食中维生素
K
的主
要来源*!+橙色基因"
=W7/
?
;
!
#$
#的发现提供了改
良作物类胡萝卜素含量的新手段!
#$
基因是在菜头
呈橘黄色的花椰菜中发现的天然半显性突变!能使
原本不积累类胡萝卜素的组织如菜头(茎髓(叶子基
部等大量积累类胡萝卜素*%(&+
#$
基因编码一个定
位于质体富含半胱氨酸的
J/7b
类似蛋白正如花
椰菜的
HW
蛋白质,热休克蛋白"
MCF
#!作为分子
伴侣可调控质粒例如!番茄
MCF!#
可保护光合体
系
"
免受氧化胁迫!促进叶绿体转换成有色体!进而
导致类胡萝卜素积累*$+从橙肉甘薯分离的橙色基
因"
!"#$
#通过提高类胡萝卜素生物合成基因的表
达水平来增加类胡萝卜素的积累*)+转
#$
基因的
土豆块茎和拟南芥花序都表现出类胡萝卜素含量升
高的现象!说明
#$
基因在改良作物的类胡萝卜素
含量方面具有广泛的应用前景*++
甘薯是中国主要的农作物之一!已有许多文献
指出水分胁迫下甘薯的旱害与氧化胁迫有关*3(#"+
干旱胁迫能诱导过量活性氧的产生*##+!导致植物体
内活性氧积累!从而对植物的细胞结构和生理代谢
产生严重的危害!进而使植物遭受生理损害本实
验通过室内水培实验检验
F5G()"""
模拟的干旱胁
迫下!过表达
!"#$
基因甘薯是否通过提高自己的抗
氧化能力来增强其对干旱胁迫的抗性
#
!
材料和方法
@*@
!
实验材料
供试材料紫肉甘薯
C4I
及过表达
!"#$
基因的
!
个转基因株系"
HW!"+
!
HW!#"
#由韩国生命工学研
究院提供!其中转基因株系由包含花椰菜花叶病毒
%$C
启动子的
@
GR1##
植物表达载体构建得到
@
G(
R1##(PQHW
!进而转化
C4I
获得从盆栽植株中剪
取五叶一心苗移入
#
%
!M=7
?
87/>
溶液中!散射光照
强度为
!""
#
6=8
)
6
!
)
.
#
!室温为
!"
$
%"c
!室
内水培
#$
$
!">
@*A
!
水分胁迫处理
参照张明生等*2+的实验结果!将水培
#$
$
!">
的培养苗转入含
#$E
聚乙二醇"
F5G()"""
#的
#
%
!
M=7
?
87/>
培养液中进行轻度水分胁迫处理!溶液水
势"
%
RA
#约为
"*&&IF7
!分别于胁迫
%
(
)
(
!&
(
&3
和
+!:
后取样测定各项指标对照材料用不含
F5G()"""
的
#
%
!M=7
?
87/>
溶液培养
@*B
!
测定指标及方法
@*B*@
!
叶绿素含量
!
叶绿素含量的测定采用丙酮
提取方法称取甘薯叶片鲜样约
"*!
?
!置于研钵中
用液氮迅速研磨成粉状!用
$6O3"E
丙酮分
%
次
"
!
(
!
和
#6O
#冲洗研钵使粉末充分浸泡于丙酮中!
避光
&c
放置
!:
!每
"*$:
振荡
#
次
!:
后将丙
酮提取液于
&"""d
?
离心
!"6-/
!取上清液!稀释
&
倍后分别测定
&+"
(
))%
(
)&)/6%
个波长下的吸
光值
HJ
&+"
(
HJ
))%
和
HJ
)&)
!据此计算叶绿素
7
"
7
#(
叶绿素
Q
"
Q
#(叶绿素"
(
#和类胡萝卜素"
<*9
#的
含量!公式如下$
7e#!*!#HJ
))%
!*3#HJ
)&)
Qe!"*#%HJ
)&)
$*"%HJ
))%
(e7fQe#+*%!HJ
)&)
+*#3HJ
))%
<*9e
"
#"""HJ
&+"
%*!+7#"&Q
#%
!!2
@*B*A
!
光合指标
!
净光合速率(蒸腾速率(气孔导
度和胞间
0H
!
浓度的测定使用美国
O-(0H^
公司
#&$
%
期
!!!!!!!!!!!!
陈晓丽!等$过表达
!"#$
基因甘薯增强抗旱性的生理机制
生产的
O-()&""
气体交换光合测定系统!采用开放
式气路!测定条件为"
!3g!
#
c
!空气
0H
!
浓度
"
$""g#"
#
#
6=8
)
6
!
)
.
#
!光照强度"
$""g#
#
#
6=8
)
6
!
)
.
#
@*B*B
!
活性氧含量
!
超氧阴离子"
H
)
!
#含量的测定
参照王爱国等*#!+的方法!所不同的是样品提取液为
@
M+*3
的磷酸缓冲液!其中含有
!"66=8
%
O5J(
BK(D7
和
!66=8
%
O
盐酸羟胺*#%+
@*B*C
!
丙二醛含量
!
丙二醛"
IJK
#含量测定按照
赵世杰等*#&+的方法
@*B*D
!
抗氧化酶活性
!
CHJ
和
FHJ
活性的测定
参照高俊风*#$+编写的实验指导书
以上各生化指标均用倒
%
(倒
&
叶混合样进行
测定!每个处理重复
%
次!光合作用参数每个处理测
定
%
个不同的叶片实验结果取
%
次测定的平均
值!表示为平均值
g
标准差
@*C
!
数据统计分析
差异显著性分析采用
CFCC#)*"
软件完成
!
!
结果与分析
A*@
!
水分胁迫对甘薯幼苗光合色素含量的影响
在受到干旱胁迫时!植物叶绿体受损!叶绿素含
量降低!从而影响到光合作用效率如图
#
所示!转
基因甘薯"
HW!"+
和
HW!#"
#和非转基因甘薯"
C4I
#
幼苗叶片叶绿素
7
含量在
#$EF5G()"""
处理下均
开始下降!并在胁迫
!&:
后二者无显著差异&随胁
迫时间增加!非转基因甘薯和转基因甘薯株系
HW!#"
叶绿素
7
含量持续降低!而另一株系
HW!"+
反而略有增加!但仍始终低于胁迫前"
0U
#水平&在
干旱胁迫
&3
和
+!:
后!转基因甘薯叶绿素
7
含量
显著高于非转基因甘薯!
HW!"+
株系又显著高于
HW!#"
株系"图
#
!
K
#同时!在水分胁迫条件下!转
基因和非转基因甘薯幼苗叶片叶绿素
Q
含量随胁迫
时间的变化趋势与叶绿素
7
的表现大致相同"图
#
!
1
#另外!在正常供水条件下! 个转基因甘薯株系
类胡萝卜素含量显著高于非转基因甘薯水分胁迫
!&:
后!转基因株系类胡萝卜素含量下降!非转基
因甘薯类胡萝卜素含量略有上升!二者含量几乎相
等&随胁迫时间增加!转基因和非转基因甘薯类胡萝
卜素含量都有所下降!然而转基因株系的类胡萝卜
素含量仍显著高于非转基因甘薯!
HW!"+
株系又显
著高于
HW!#"
株系"图
#
!
0
#以上结果说明在水分
胁迫条件下!转基因甘薯幼苗光合色素含量显著高
于非转基因甘薯!从而提高其光合作用效率
A*A
!
水分胁迫对甘薯幼苗叶片净光合速率及有关
参数的影响
图
!
显示!各类甘薯幼苗叶片净光合速率"
%
/
#
在水分胁迫
!&:
后均明显下降!但进一步延长胁迫
时间!转基因甘薯
%
/
小幅降低!非转基因甘薯
%
/
反而稍有增加!但仍低于转基因甘薯
%
/
"图
!
!
K
#&
各类甘薯幼苗叶片气孔导度"
&
.
#在水分胁迫后同样
大幅下降!然后趋于稳定!在胁迫
!&
和
&3:
后!转
基因甘薯
&
.
仍高于非转基因甘薯"图
!
!
1
#&同时!
转基因甘薯叶片蒸腾速率"
(
W
#在无水分胁迫时显
著高于非转基因甘薯!在水分胁迫条件下!各类甘薯
(
W
均明显大幅度降低!但转基因株系蒸腾速率仍显
著高于非转基因植株"图
!
!
J
#另外!与以上指标
变化类似!各类甘薯株系幼苗胞间
0H
!
浓度"
-
#在
受到水分胁迫后也均明显降低!但转基因株系
-
显
著低于非转基因甘薯"图
!
!
0
#以上结果说明在水
分胁迫条件下!各类甘薯幼苗的光合作用均受到抑
制!但转基因甘薯的抑制程度低于非转基因甘薯
A;B
!
水分胁迫对甘薯叶片
$
E
!
A
和
FG<
含量的影响
H
!
接受一个电子后形成
H
)
!
!
H
)
!
是活性氧自
图
#
!
水分胁迫下甘薯幼苗叶片光合色素含量的变化
HW!"+
和
HW!#"
为转
!"#$
基因株系!
C4I
为非转基因株系&下同
Z-
?
*#
!
B:;
@
:=X=.
]
/X:;X-9
@
-
?
6;/X9=/X;/X.-/
8;7\;.=V.A;;X
@
=X7X=.;;>8-/
?
T/>;WA7X;W>;V-9-X
HW!"+7/>HW!#"7W;XW7/.
?
;/-98-/;.
!
A:-8;
C4I/=/(XW7/.
?
;/-898-/;
&
B:;.76;7.Q;8=A
!&$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
由基的一种!是所有氧自由基的前身!其大量积累会
对细胞产生氧化伤害!使生物体生物膜的结构及功
能受到损伤!引起核酸和蛋白质变性等!从而对细胞
及组织产生多种生物学效应由图
%
!
K
可见!转基
因和非转基因甘薯幼苗叶片
H
)
!
含量均随水分胁迫
时间的增加而不断提高!但胁迫后不同时间转基因
甘薯
H
)
!
含量均低于非转基因甘薯!尤其是胁迫
!&
:
后!转基因甘薯
H
)
!
含量显著低于非转基因甘薯!
表明转基因株系积累了较少的活性氧自由基前身
同时!丙二醛"
IJK
#是脂质过氧化的最终产
物!其含量反映植物细胞受环境胁迫等伤害的程度
由图
%
!
1
可知!各类甘薯幼苗叶片中
IJK
含量在
水分胁迫后均随胁迫时间的延长而不断增加!表明
植株受伤害的程度不断加深&然而!相比于非转基因
植株!转基因植株在正常供水和水分胁迫后均保持
了较低的
IJK
含量!如胁迫
&3:
后!非转基因甘
薯株系
IJK
含量约为转基因甘薯株系的
#*$
倍
这说明转基因甘薯对水分胁迫的适应性较强!受活
性氧攻击的损伤较轻
A;C
!
水分胁迫对甘薯幼苗叶片
7$G
和
9$G
活性
的影响
抗氧化酶系统极易受到环境胁迫的影响!同时
也是反映植物对环境胁迫耐受程度的重要指标其
中!超氧化物歧化酶"
CHJ
#是抵御活性氧伤害的第
一道防线!它可以将
H
)
!
歧化为
M
!
H
!
而过氧化物
酶"
FHJ
#可在逆境或衰老初期表达!清除
M
!
H
!
FHJ
广泛存在于植物体内不同组织中!它作为活性
较高的适应性酶!能够反映植物生长发育的特点(体
内代谢状况以及对外界环境的适应性图
&
!
K
表
明!在正常水分条件下!转基因甘薯幼苗叶片
CHJ
活性稍高于非转基因甘薯!但差异不明显&
F5G
模
拟干旱胁迫
!&:
后!转基因和非转基因甘薯幼苗叶
图
!
!
水分胁迫下甘薯幼苗叶片光合参数的变化
Z-
?
*!
!
B:;
@
:=X=.
]
/X:;X-9
@
7W76;X;W.-/8;7\;.=V.A;;X
@
=X7X=.;;>8-/
?
T/>;WA7X;W>;V-9-X9=/>-X-=/
图
%
!
水分胁迫下甘薯幼苗叶片
H
)
!
和
IJK
含量的变化
Z-
?
*%
!
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期
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陈晓丽!等$过表达
!"#$
基因甘薯增强抗旱性的生理机制
图
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水分胁迫下甘薯幼苗叶片
CHJ
和
FHJ
活性的变化
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片
CHJ
活性均升高!胁迫
&3:
后!甘薯幼苗叶片
CHJ
活性达到最高!但转基因甘薯株系
CHJ
活性
显著高于非转基因甘薯&随着胁迫时间的延长!
CHJ
活性均有所降低!但转基因甘薯株系幼苗
CHJ
活性
降低幅度较小!仍显著高于非转基因甘薯同时!在
正常水分条件下!转基因甘薯与非转基因甘薯幼苗
叶片
FHJ
活性无显著差别!但在水分胁迫
!&:
后!
转基因甘薯幼苗
FHJ
活性显著高于非转基因甘薯!
特别是转基因甘薯株系
HW!"+
在胁迫后
FHJ
活性
约为胁迫前的
!*$
倍&与
CHJ
活性变化趋势相似!
胁迫
&3:
后!甘薯幼苗
FHJ
活性达到最大&胁迫
+!
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后!
FHJ
活性均有所降低!但仍高于胁迫前水平
"图
&
!
1
#这说明水分胁迫可以诱导甘薯幼苗叶片
CHJ
和
FHJ
活性提高!相比于非转基因植株!转基
因株系幼苗酶活性的增强更明显!从而使得转基因
甘薯幼苗具有更强的抗氧化能力
%
!
讨
!
论
作物叶绿素含量的高低是反映其光合能力的重
要指标之一!叶绿素的含量往往直接影响着光合作
用的速率和光合产物的形成!最终影响作物产量和
品质的提高*#)(#++通常情况下!水分胁迫会对植物
的叶绿体造成一定的损伤!降低叶片中叶绿素的含
量!从而降低植物的光合速率!导致光合功能迅速衰
退本实验结果显示$转基因甘薯叶片中叶绿素和
类胡萝卜素含量在水分胁迫后明显下降!但转基因
株系的含量显著高于非转基因甘薯!表明水分胁迫
对转基因株系光合能力的损伤要小于非转基因甘
薯可见!过表达
!"#$
基因增强了甘薯对水分胁迫
的耐受能力!其可能通过保持较高的叶绿素和类胡
萝卜素水平!延缓叶片光合功能来实现同时!在水
分胁迫条件下!甘薯叶片
%
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(
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(
-
和
(
W
也都明显
下降!但转基因株系的
%
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(
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.
和
(
W
都高于非转基
因甘薯!表明在水分胁迫条件下转基因甘薯由于具
有较高的叶绿素和类胡萝卜素含量及气孔导度!因
而保持了高于非转基因甘薯的光合和蒸腾能力!反
映了在干旱条件下由于转基因甘薯具有生理代谢上
的优势!因此对干旱表现出了较强的耐性在水分
胁迫后!非转基因甘薯保持了较高的胞间
0H
!
浓度
"
-
#!这可能由于非转基因甘薯叶绿素和类胡萝卜
素含量显著降低!光合能力严重受损!胞间
0H
!
无
法及时消耗!因而累积造成
水分胁 迫 能 导 致 超 氧 阴 离 子 "
H
)
!
#(羟 基
")
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!
H
!
#和单线氧"#
H
!
#等活性氧
的积累*#3+!为适应干旱胁迫!一些植物已演化出一
套适应机制和策略!如通过调节气孔开度(调节细胞
渗透压以及启动抗氧化防御系统等来使植物免受干
旱的伤害植物中活性氧的清除主要由抗氧化酶系
和抗氧化物质承担*#3+!迄今已有通过导入活性氧清
除酶基因!来人为提高水分胁迫下植物体内自由基
清除酶的活性*#2+!从而提高植物对水分胁迫的耐受
能力的报告本实验中过表达
!"#$
基因甘薯类胡
萝卜素积累能力得到增强!从而提高了其自由基清
除能力类胡萝卜素含量较高能通过清除活性氧
"
H^C
#或与其他抗氧化剂如维生素
5
(
0
协同作用
来增加对非生物胁迫的抵抗*!"+本研究结果表明!
水分胁迫
!&:
后!转基因甘薯植株
H
)
!
含量显著低
于非转基因甘薯!与其同期
CHJ
和
FHJ
活性显著
高于非转基因甘薯相互对应!表明转基因甘薯在水
分胁迫后能保持较低的
H
)
!
水平!是由于其具有更
高的
CHJ
和
FHJ
活性以及更高水平的类胡萝卜素
含量及时清除了过量产生的活性氧
在水分胁迫条件下!植物细胞内活性氧大量积
累!诱发膜脂过氧化反应!产生
IJK
!细胞膜的结
构和功能遭到破坏!对细胞造成不可逆的伤害!甚至
引起细胞死亡*!#+本实验发现!非转基因甘薯叶片
&&$
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
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卷
中
IJK
含量在胁迫后各时间点都显著高于转基因
植株!说明其受到的伤害大!而转基因植株受到的氧
化伤害相对较小这是由于转基因植株具有较低水
平的
H
)
!
含量!加之转基因株系由于具有较高的
CHJ
和
FHJ
活性!保持了较低水平的活性氧!从而
受到的氧化伤害要小一些另外!类胡萝卜素派生
物
K1K
可以作为植物非生物胁迫信号!通过类胡
萝卜素抗氧化活性和
K1K
增加的协调作用!参与
多种胁迫反应!提高转基因甘薯的抗氧化能力*!"+
因此!转基因甘薯增强了对水分胁迫的耐受能力主
要是通过抗氧化能力的提高来实现的
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