全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(3): 297-305(2012)
收稿日期: 2011-08-04; 修回日期: 2012-01-19
基金项目: 重庆市自然科学基金项目(2008BB1249); 中央高校基本科研业务费专项资金(XDJK2009C177); 广东省科技计划项目
(2009B020305001)
通讯作者: 周常勇,研究员,博士生导师,主要从事分子植物病理学研究; Tel: 023-68349007, E-mail: zhoucy@swu. edu. cn
肖崇刚,教授,主要从事有益微生物的开发与利用研究; Tel: 023-68250495, E-mail: chgxiao@swu. edu. cn
第一作者: 董国菊(1974 - ),女,山西万荣人,在读博士研究生,主要从事植物病原真菌及病害防治研究; E-mail: ginadgj@163. com。
烟草疫霉拮抗菌株 P-72-10 的鉴定
及其拮抗代谢产物初步分析
董国菊1, 李文英2, 刘翠平1, 周常勇1,3*, 肖崇刚1*
( 1西南大学植物保护学院, 重庆 400715; 2广东省农业科学院土壤肥料研究所, 广州 510640;
3中国农业科学院柑橘研究所, 重庆 400712)
摘要:为探讨烟草根际生防细菌的生防机制,从重庆地区连作烟田健康烟株根际土壤中分离筛选到 1 株对烟草疫霉具有较
强拮抗作用和对黑胫病具有良好防效的细菌菌株 P-72-10。 根据培养性状、形态特征、生理生化特性、基因组 DNA 的(G +
C)mol%含量测定以及 16S rDNA基因序列分析确定该菌株的分类地位。 该菌株菌落乳白色,能产生水溶性荧光色素,革
兰氏染色反应阴性,菌体杆状、大小(8. 1 ~ 16. 2)μm × (1. 8 ~ 4. 8)μm,单端生鞭毛,不形成芽孢。 The BIOLOG GN2 结果
显示该菌株属于假单胞菌属 Pseudomonas。 该菌株基因组 DNA的(G + C)mol%含量为 60. 72 mol% 。 16S rDNA基因序列
分析显示该菌株与假单胞菌属荧光假单胞杆菌多个菌株的序列同源性达到 99% ,GenBank 上的登录号为:HQ888871。 结
合其形态特征和生理生化特性,将菌株 P-72-10 鉴定为荧光假单胞杆菌 P. fluorescens。 平板检测拮抗代谢产物结果表明:
该菌株具有分解纤维素、蛋白质和结合 Fe3 +的能力,但不能分解几丁质。
关键词:烟草疫霉; 拮抗细菌; 分类地位; 荧光假单胞杆菌; 拮抗代谢产物
Identification and characterization of antagonistic bacterial strain P-72-10 against
Phytophthora nicotianae 　 DONG Guo-ju1, LI Wen-ying2, LIU Cui-ping1, ZHOU Chang-yong1,3,
XIAO Chong-gang1 　 ( 1College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715,China; 2Soil and Fertilizer
Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences, Guangzhou 510640,China; 3Citrus Reseach Institute, Chinese
academy of agricultural science, Chongqing 400712, China)
Abstract: Tobacco black shank, caused by Phytophthora nicotianae van Breda de Haan, is one of economi-
cally important disease of tobacco production. In the previous study, a strain P-72-10 was isolated from the
healthy tobacco in the rhizosphere soil of Chongqing. It was selected based on its strong antagonistic activity a-
gainst P. nicotianae on the plate dual-culture test and its ability to suppress tobacco black shank disease effec-
tively in the greenhouse condition. In the study, the phylogeny of P-72-10 was analyzed, and its taxonomic
position was identified using morphological and chemotaxonomic characteristics, together with 16S rDNA gene
phylogenetic analysis. The colonies were cream in color on KB culture. Cells were gram-negative, rod-shaped
[(8. 1 -16. 2)μm × (1. 8 -4. 8)μm], motile owing to one or several polar flagella and did not form endo-
spores. The growth temperature for P-72-10 ranged from 4 to 40℃ with the optimum at 28 -30℃. The results
of BIOLOG GN2 showed that P-72-10 belonged to Pseudomonas. The genomic (G +C) content was 60. 72% .
Phylogenetic analysis of the 16SrDNA gene sequence revealed that P-72-10 was the most closely related to P.
fluorescens, with the sequence similarity of 99% . Nucleotide number of the accession was HQ888871. Taxo-
　
植物病理学报 42 卷
nomically, strain P-72-10 was identified as P. fluorescens. On the plate culture, strain P-72-10 produced pro-
teinase, celluase, and siderophore, but not chitinase.
Key words: Phytophthora nicotianae; antagonistic bacterium; taxonomic position; Pseudomonas fluore-
scens; antifungal products
中图分类号: S432　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)03-0297-09
　 　 由烟草疫霉(Phytophthora nicotianae van Bre-
da de Haan)引起的烟草黑胫病是世界烟草生产中
危害最严重的真菌性土传病害之一,同时也是中国
烟草生产上的主要病害。 该病原寄主范围广,破坏
性极强,烟株受害后易造成整株死亡,严重影响烟
草生产[1]。 生产上防治烟草黑胫病主要依赖于化
学防治,但长期使用化学农药,容易产生(耐)抗药
性菌株,且污染环境,破坏生态系统,影响烟叶的质
量和人体的健康。 近年来,在烟草及烟草制品逐渐
向更加安全化方向发展的趋势下,生物防治逐渐成
为烟草病害防治研究的热点。
植物根际存在着大量微生物,其中以细菌的种
类最多、数量也最大。 根据根际细菌对植物不同作
用分为有益、中性和有害 3 种类型。 其中,有益根
际细菌被称为植物根际促生细菌 ( plant growth-
promotion rhizobacteria,PGPR) [2, 3]。 近几十年来,
国内外学者针对不同植物病害的生物防治开展了
大量研究工作,尝试利用多种有益微生物及其代谢
产物来防治植物病害,尤其是利用具有促生防病双
重功效的植物根际促生细菌已成为近年来相关研
究的热点和重点。 作为植物病害生物防治研究的
一个重要方面,植物根际促生细菌已被有效地用于
小麦全蚀病、马铃薯软腐病、作物青枯病、葫芦科作
物苗期猝倒病等顽固性土传病害的防治[4]。
近年来,国内外学者利用根际细菌进行烟草黑
胫病的生物防治研究取得了一定的进展。 烟草黑
胫病菌的拮抗细菌主要类群有假单胞杆菌 Pseudo-
monas spp. 、芽孢杆菌 Bacillus spp. 和农杆菌
Agrobacterium spp. ,它们主要通过产生抗菌素使
烟草黑胫病菌菌丝溶解[5]。 研究人员在田间土壤
中加入拮抗细菌进行试验,发现能显著降低烟草黑
胫病菌的侵染机会,从而减少发病率[6]。 国内也
有学者分离筛选到一些具有拮抗控病作用的根际
细菌菌株,如 P. fluorescens 菌株 RB-42 和 RB-
89[7],B. licheniformis 菌株 GP13[8, 9],Virgibacillus
sp.菌株 ZJUT-K15[10],硝酸盐细菌 B. mucilagino-
sus菌株 B925[11]等,这为黑胫病的生物防治提供
了试验材料和理论基础。
课题组从重庆地区连作烟田健康烟株根际土
壤靶向筛选对烟草赤星病菌、烟草黑胫病菌以及烟
草青枯病菌有拮抗作用的生防细菌,为优良菌株的
选育提供资源[12]。 本研究以菌株 P-72-10 为试验
材料,以烟草疫霉为指示病原菌,明确该菌株对烟
草疫霉的拮抗效果及其对黑胫病的温室控病效果。
在此基础上,通过培养性状、形态特征、生理生化特
性、基因组 DNA 的(G + C) mol %含量测定以及
16S rDNA基因序列比对分析相结合的方法,对菌
株 P-72-10 的分类地位进行了确定,并初步通过平
板检测该菌株产生的拮抗代谢产物,有助于进一步
分析该菌株作为烟草黑胫病生防菌的可行性和应
用条件。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
1. 1. 1　 供试菌种　 拮抗菌株 P-72-10 由课题组从
重庆市连作烟田健康烟株的根际土壤中分离筛选
获得;烟草疫霉由课题组从发病烟株分离纯化获
得。
1. 1. 2　 KMB 培养基　 蛋白胨 20 g,甘油 15 mL,
K2HPO4 0. 3 g,MgSO4·7H2O 1. 5 g,琼脂 18 g,蒸
馏水 1 000 mL,pH7. 0。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 拮抗菌株 P-72-10 对烟草疫霉的拮抗作用
及其温室控病效果　 拮抗作用测定采用平板对峙
法[13]。 在 PDA平板中心接种烟草黑胫病菌,菌块
直径 =6. 0 mm,在距平板中心 2. 5 ㎝处两边对称
接种拮抗细菌菌株 P-72-10,各划一条直线,长度为
30 mm,设不接拮抗菌株为对照。 每处理 5 个重
复,5 d后测抑菌带宽,记录并统计。
相对抑制率(% ) = [(对照菌落直径 -处理菌
落直径) /对照菌落直径] ×100
892
　
　 3 期 　 　 董国菊,等: 烟草疫霉拮抗菌株 P-72-10 的鉴定及其拮抗代谢产物初步分析
温室控病效果采用灌根法[14]。 将培养 72 h
的拮抗菌株 P-72-10 带菌培养液,处理 4 ~ 5 叶期
的烟苗,以清水处理为对照,每处理 10 株,每株烟
苗灌带菌培养液 10 mL,4 d 后灌第 2 次,于第 2 d
挑战接种制备好的疫霉游动孢子悬浮液(浓度为 1
×104 个孢子 / mL),每株接种 10 mL,每处理设 3
个重复。 按常规方法管理,于处理后 10 d 统计发
病情况,并计算病情指数与相对防效。
病情指数 = [Σ(各级病株或叶数 × 该病级
值) / (调查总株或叶数 ×最高病级值)] × 100;相
对防效(% ) = [(对照病情指数 -处理病情指数) /
对照病情指数] ×100
1. 2. 2　 拮抗菌株 P-72-10 的培养性状及染色反应
将菌株 P-72-10 在 KMB 培养基上划线,于 28 ~
30℃培养,进行表型观察。 革兰氏染色、鞭毛染色
参照文献[15]进行。
1. 2. 3　 拮抗菌株 P-72-10 的电镜观察　 取菌株 P-
72-10 对数生长期的新鲜菌液,6 000 r / min 离心收
集菌体,负染直接观察法用透射电子显微镜观察菌
体细胞,并测量其大小[16]。
1. 2. 4　 拮抗菌株 P-72-10 的生理生化特性测定　
菌株 P-72-10 的淀粉水解、明胶液化、氧化酶、接触
酶、硝酸还原、糖发酵等生理生化特性测定试验参
照文献[15,17]进行;其他生化指标采用 BIOLOG
细菌自动鉴定系统进行鉴定。
1. 2. 5　 拮抗菌株 P-72-10 基因组 DNA 的提取和
(G + C) mol %含量测定 　 菌株 P-72-10 基因组
DNA的提取采用苯酚氯仿混合提取法[18]。 用高
效反液相色谱仪来测定菌株 P-72-10 基因组 DNA
的(G + C) mol %含量[19]。
1. 2. 6 　 拮抗菌株 P-72-10 拮抗代谢产物的初步
分析　 几丁质酶的检测参照文献[20],纤维素酶
的检测参照文献 [21],嗜铁素的检测参照文献
[22],蛋白酶的检测参照文献[23],各处理均设
3 个重复。
1. 2. 7　 拮抗菌株 P-72-10 的 16S rDNA 序列测定
及系统发育分析 　 菌株 P-72-10 用 Luria-Bertani
(LB)培养基培养过夜,离心收集菌体后,用 CTAB
法提取基因组总 DNA[24]。
采用假单胞菌属细菌 16S rDNA 特异引物[25]
扩增 P-72-10 菌株 16S rDNA的序列。 引物由宝生
物工程(大连)有限公司合成,序列如下,Ps-for:
5′-GGTCTGAGAGGATGATCAGT-3′; Ps-rev: 5′-
TTAGATCCACCTCGCGCG-3′。 PCR 扩增反应体
系(25 μL):模板 DNA(约 100 ng·μL -1 ) 2. 0
μL,10 × PCR buffer 2. 5 μL,d NTP(2. 5 mmol·
L -1) 2. 0 μL,MgCl2 (20 mmol·L -1)1. 5 μL,引
物 Ps-for (500 pmol·L -1) 1. 0 μL,引物 Ps- rev
(500 pmol·L -1 ) 1. 0 μL,Taq 酶(5 U·μL -1 )
0． 5 μL,加 ddH2O 补足至 25 μL。 PCR 扩增反应
条件为:94℃预变性 5 min后进行 30 个循环(94℃
变性 1 min,55℃退火 1 min,72℃延伸 1 min),然
后 72℃充分延伸 5 min,最后 4℃保存。 PCR 产物
用琼脂糖凝胶电泳检测,并由宝生物工程有限公司
测序。
序列登录 GenBank 获得登录号并且采用
BLAST软件对序列进行比对分析(在 NCBI 上进
行同源性比较),应用 MEGA4. 0 软件以邻位法构
建系统发育树,进行系统进化分析。
2　 结果与分析
2. 1　 拮抗菌株 P-72-10 对烟草疫霉的拮抗作用及
其温室控病效果
平板对峙试验结果表明:菌株 P-72-10 对烟草
疫霉表现出较强拮抗作用,对照平板上烟草疫霉扩
展直径为 70 mm (图 1-A),对峙平板中烟草疫霉
扩展直径为 22 mm (图 1-B),抑菌带半径达 13
mm;相对抑制率为 68. 57% 。
温室控病试验结果表明:该菌株带菌培养液对
烟草黑胫病表现出良好的控病作用,与对照相比,
菌株带菌培养液灌根处理烟草幼苗后,能明显地减
轻发病率,降低病情指数,相对控病效果达到
61． 14% (表 1)。
2. 2　 拮抗菌株 P-72-10 的培养性状及形态特征
在 KMB培养基上,28 ~ 30℃条件下培养 48 h
形成单菌落,菌落直径 2 mm 左右,圆形,乳白色,
表面湿润、光滑、微隆起,边缘整齐,半透明且可产
生水溶性荧光色素(图 2-A)。 菌株 P-72-10 革兰
氏染色反应为阴性,菌体呈杆状,单端生鞭毛,1 ~ 5
根鞭毛,多数为 3 根鞭毛,不形成芽孢。 菌体直接
负染后在透射电镜下测量其大小为(8. 1 ~ 16. 2)
μm × (1. 8 ~ 4. 8)μm (图 2-B)。
992
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 1　 Result of antifungal experiment CK(A) and P-72-10(B)
Fig. 2　 P-72-10 strain on KB (A) and under transmission electronic microscope (B)
Table 1　 Biocontrol efficiency of strain P-72-10 on tobacco blank shank in greenhouse
Treatment Number of total plants Incidence / % Disease index Biocontrol efficiency / %
P-72-10 30 38. 88* 24. 72* 61. 14
CK 30 83. 89 63. 61
Note: CK indicates roots treated with sterile water. Data followed by * in the same column means significant difference
at 0. 05 level (Duncan’s new multiple range tests) .
2. 3　 拮抗菌株 P-72-10 的生理生化特性
参照细菌鉴定的常用方法,菌株 P-72-10 的生
理生化特性测定结果表明:该菌株在 4℃可以生
长,41℃不生长,最适生长温度为 28 ~ 30℃,不耐
盐,当 NaCl浓度大于 2%时,生长被抑制。 精氨酸
双水解酶反应阳性,接触酶反应阳性,氧化酶反应
阳性;水解明胶,但不水解淀粉;能利用柠檬酸盐,
可以产生果聚糖;能进行反硝化反应(表 2)。 该结
果与《常见细菌系统鉴定手册》 [15]和 《Bergey’ s
Manual of Systematic Bacteriology》第 9 版 [17] 中有
关荧光假单胞杆菌 P. fluorescens所描述的生理生
化鉴别特征完全相同。 因此,初步认为菌株 P-72-
10 为 P. fluorescens。
The BIOLOG GN2 细菌自动鉴定系统进行鉴
定的结果显示菌株 P-72-10 属于假单胞菌属,与数
据库中的 P. corrugata 最相近,相似性 Similarity
(SIM) 为 0. 410,位距 Distance (DIS) 为 6. 49。
003
　
　 3 期 　 　 董国菊,等: 烟草疫霉拮抗菌株 P-72-10 的鉴定及其拮抗代谢产物初步分析
Table 2　 Physiological and biochemical characteristics of strain
P-72-10 and Pseudomonas fluorescens
Characteristics P-72-10 Pseudomonas fluorescens[17]
Fluorescent pigment on KB + +
Growth at 4℃ + +
Growth at 41℃ ﹣ ﹣
Growth at 2% NaCl + +
Growth at 5% NaC1 ﹣ ﹣
V-P reaction ﹣ ﹣
M-R test ﹣ ﹣
Anaerobic growth + +
Oxidase reaction + +
Catalase reaction + +
Gelatin hydrolysis + +
Starch hydrolysis ﹣ ﹣
Phenylalanine deaminase ﹣ ﹣
Arginine dihydrolase + +
Lipoidase ﹣ ﹣
Citrate utilization + +
Propionate utilization + +
Nitrate reduction ﹣ ﹣
Acid production from glucose + +
Acid production from maltose ﹣ ﹣
Acid production from xylose + +
Acid production from mannitol + +
Gas production from glucose ﹣ ﹣
Tyrosine hydrolysis ﹣ ﹣
+ : Can produce the substance or can grow in the situation; - : Neither produce the substance nor grow in the situation.
2. 4　 拮抗菌株 P-72-10 基因组 DNA 的(G + C)
mol%含量
采用高效反相液相色谱来测定菌株 P-72-10
基因组 DNA 的(G + C)mol%含量。 由碱基的毫
摩尔数可以得到菌株 P-72-10 基因组 DNA 的(G
+ C) mol% 含量,测得菌株 P-72-10 的 (G + C)
mol%含量为 60. 72 mol% (图 3),完全在荧光假单
胞菌基因组 DNA 的(G + C)mol% (59. 4 ~ 61. 3)
之内。
2. 5　 拮抗菌株 P-72-10 的拮抗产物产生初步分析
平板检测拮抗代谢产物结果显示:该菌株具有
分解纤维素、蛋白质和结合 Fe3 +的能力,但不能分
解几丁质。 初步表明该菌株能产生纤维素酶、蛋白
酶和嗜铁素,不产生几丁质酶。
2. 6　 拮抗菌株 P-72-10 的 16S rDNA-PCR 产物
的序列分析
利用 PCR方法扩增得到菌株 P-72-10 的 16S
rDNA约 1. 5 kb 的扩增片断。 对 PCR 产物测序
结果得菌株 P-72-10 16S rDNA的全序列由 1 450
个碱基构成,该序列在 GenBank 上的登录号为:
HQ888871。 通过 BLAST(NCBI)比对分析发现
菌株 P-72-10 的 16S rDNA 序列与假单胞菌属荧
光假单胞杆菌多个菌株的同源性达到99% ,如:
103
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 3　 Separate map of bases from P-72-10 strain
P. fluorescens strain 2P24(AY447045)、P. fluore-
scens strain HNR23 ( EU373392 )、 P. fluorescens
strain XG32(DQ431467)等;以 16S rDNA 同源性
为基础,选取 GenBank 中报道的假单胞属和黄单
胞菌属共 19 个菌株的 16S rDNA,并应用 Clustalx
及 MEGA4. 0 软件以邻位法构建得到菌株 P-72-10
的系统发育树(图 4)。 该系统树以黄单胞杆菌属
作为单独的外群种,其中菌株 P-72-10 与荧光假单
胞菌聚成一类,这反映出该菌株的遗传距离与荧光
假单胞杆菌最近。
3　 结论与讨论
荧光假单胞杆菌 P. fluorescens是假单胞菌属
的一个典型种,该细菌营养需求简单,繁殖快、竞争
定殖能力强,在自然界中广泛存在,是目前微生物
肥料和生防制剂生产应用中最常见、最重要的植物
根际促生细菌菌种之一[26 ~ 28]。 荧光假单胞菌中的
许多菌株已经作为植物病害的生防菌,在世界范围
内得到广泛的研究和应用[29 ~ 31]。 国内也已报道了
很多抗植物病害的荧光假单胞菌,如抗禾谷丝核菌
Fig. 4　 Phylogenetic tree including type strains of P-72-10 based on 16S rDNA sequence
203
　
　 3 期 　 　 董国菊,等: 烟草疫霉拮抗菌株 P-72-10 的鉴定及其拮抗代谢产物初步分析
的菌株 A6[22],抗小麦全蚀病菌的菌株 2P24[23]、抗
甜瓜蔓枯病菌的菌株 M18[32]等。 本试验所研究的
拮抗菌株 P-72-10 分离自连作烟田健康烟株根际
土壤,平板对峙试验表明该菌株对烟草疫霉具有很
强的拮抗作用,温室盆栽条件下对黑胫病表现出良
好的控病效果。 这说明连作烟田中健康烟株根际
土壤中存在的有益微生物可能是抑制烟草黑胫病
的一个重要因素。 此外,荧光假单胞杆菌作为生防
菌有其自身的优势, 它与植物根系的适应性好,
定殖量大, 所产生的次生代谢产物种类较多[24]。
本试验检测到菌株 P-72-10 在平板上能产生纤维
素酶、蛋白酶和嗜铁素,前人也曾有类似的研究报
道[22,23]。 纤维素酶和蛋白酶能够降解卵菌的细胞
壁,嗜铁素在低铁环境中有利于荧光假单胞杆菌结
合 Fe3 +为自身所利用,限制植物根际病原真菌孢
子的萌发和菌丝的生长。 烟草疫霉隶属于卵菌纲
(Oomycetes)、疫霉属(Phytophthora),其细胞壁的
主要成分是纤维素和半纤维素,在平板对峙试验中
菌株 P-72-10 对病原菌所产生的强拮抗作用可能
与这些拮抗活性代谢产物有一定程度的关联,但其
对病原菌的内在作用机制尚需进一步深入研究。
16S rDNA作为原核生物分类的分子标记已
得到广泛应用,已有研究表明依据 16S rDNA序列
同源性分析可以准确地将菌株鉴定到属,但由于假
单胞菌属下种间遗传距离非常近,故此方法不足以
将菌株的分类地位确定到种的水平。 还有一些新
的微生物快速鉴定方法,如 BIOLOG 微生物自动
鉴定系统方法在国内外已开始用于各种微生物的
鉴定,但随着新方法的不断应用,结果发现该鉴定
系统只是测定了微生物的一部分性状,即生化代谢
特征,单靠这些性状的结果有时易产生误判[33]。
本试验利用 BIOLOG 微生物自动鉴定系统连续 2
次测定,结果显示菌株 P-72-10 与数据库中的 P.
corrugata最相近。 因此,在采用 BIOLOG 鉴定系
统和 16S rDNA进行微生物种类鉴定时,结合一些
传统的鉴定手段必不可少。 本试验对菌株 P-72-10
进行形态特征和培养性状观察、生理生化特性和
DNA 的(G + C)mol%含量测定,同时结合菌株的
16S rDNA 序列比对分析结果,将菌株 P-72-10 鉴
定为荧光假单胞杆菌 P. fluorescens。
作为理想生防菌不仅要求拮抗能力强,而且要
求生活力强,并能在寄主植物根部和土壤中定殖,
这些已成为评价土传病害生防菌的重要指标[34]。
已报道的不同菌株其控病方式往往各不相同,有些
菌株以 1 种作用方式,如拮抗或定殖竞争作用达到
较好的防病效果;而有些菌株则通过各种途径的协
同作用来减轻病害的发生。 本试验菌株 P-72-10
对烟草疫霉具有很强的拮抗作用,在温室盆栽条件
下对烟草黑胫病表现出良好的控病效果,至于该菌
株是否还涉及其他抑病机理以及相互协作关系,今
后课题组有必要对其进行深入研究。 此外,菌株
P-72-10 在烟田环境中的定殖、存活和控病效果还
需进一步探索,以便更好地应用于烟草黑胫病的生
物防治。
参考文献
[1] 　 Ma G S,Gao Z M,Chen J. Recent advances in Phyto-
phthora parasitica var. nicotianae ( in Chinese) [ J] .
Tobacco Science & Technology (烟草科技), 2001,
9: 44 -48.
[2] 　 Glick B R. The enhancement of plant growth by free-
living bacterial[J] . Canadian Journal of Microbiology,
1995, 41: 109 -117.
[3] 　 Weller D M. Biological control of soil-borne plant
pathogens in the rhizosphere with bacteria[ J] . Annual
Review of Phytopathology, 1988, 26: 379 -407.
[4] 　 Kloepper J W. Plant growth-promotion rhizobacteria as
biological control agents of soilborne disease [ A ] .
Bay-Peterson J. The Biological Control of Plant Disease
[C] . Taiwan:Food and Fertilizer Technology Center,
1991.
[5] 　 Broadbent P. Bacteria and actinomyctes antagonistic to
fungal root pathogens in Australian soil[ J] . Australian
Journal Biological Science, 1971, 24: 925 -944.
[6] 　 English J T,Mitchell D J. Influence of an introduced
composite of microorganism on infection of tobacco
by Phytophthora parasitica var. nicotianae [ J ] .
303
　
植物病理学报 42 卷
Phytopathology, 1988, 78: 1484 -1490.
[7] 　 Gu J G,Fang D H,Li T F,et al. Isolation of tobacco
rhizobacteria and their antagonism to Phytophthora
parasitica var. nicotianae ( in Chinese ) [ J ] . Acta
Tabacaria Sinica (中国烟草学报), 2001, 7(3): 19
-22.
[8] 　 Fang D H,Gu J G,Li T F,et al. Screen for antagonistic
rhizobacteria of Phytophthora nicotianae on tobacco
( in Chinese ) [ J ] . Journal of Yunnan Agricultural
University(云南农业大学学报), 2001, 16(2): 93 -
95.
[9] 　 Fang D H,Li T F,Mu Y X,et al. Field application of
antagonistic bacteria GP13 to control tobacco black
shank ( in Chinese) [ J] . Journal of Yunnan Agricultu-
ral University(云南农业大学学报), 2003, 18(1):
48 -51.
[10] Wang K,Cui Z F,Qiu J P,et al. Isolation, identifica-
tion and antagonistic research of Virgibacillus sp.
ZJUT-K15 ( in Chinese)[J] . Journal of Zhejiang Uni-
versity of Technology(浙江工业大学学报), 2009, 37
(5): 525 -529.
[11] Zhao X X,Chen H M,Wu Y H. Inhibition of silicate
bacteria B925 on Phytophthora parasitica var. nicoti-
anae and its 16S rDNA sequence analysis ( in Chinese)
[J] . Tobacco Science & Technology (烟草科技),
2007, 3: 56 -60.
[12] Wang L Z,Xiao C G. Screening of antagonistic bacteria
in soil against main tobacco diseases in Chongqing ( in
Chinese)[J] . Tobacco Science &Technology (烟草科
技), 2008, 4: 60 -64.
[13] Shi J R,Wang Y Z,Chen H G,et al. Screening of bac-
teria antagonistic to Rhizoctonia cerealis ( in Chinese)
[J] . Chinese Journal of Biological Control (中国生物
防治), 1996, 12(4): 161 -164.
[14] Shen P,Yan W Z,Chen S L,et al. Growth promotion
and control for blight of endophytic bacterium with
ACC deaminase in capsicum ( in Chinese) [ J] . Acta
Phytophylacica Sinica (植物保护学保), 2008, 35
(1): 28 -32.
[15] Dong X Z,Cai M Y. Manual of systematic and deter-
minative bacteriology ( in Chinese)[M] . Beijing:Chi-
nese Science Press (北京:中国科学出版社),2001.
[16] Dai D L,Zhang Q M. Methods of preparation for bio-
chemistry electron microscopy ( in Chinese ) [M ] .
Tianjin:Tianjin University Press (天津:天津大学出版
社), 1993: 102 -103.
[17] Buchanan R E,Gibbons N E. Bergey’s manual of sys-
tematic bacteriology 9th ed[M] . Baltimore:Williams &
Wilkins Company, 1994.
[18] Lin W M. Classification and identification methods for
bacterial molecular genetics ( in Chinese)[M] . Shang-
hai:Shanghai Science Technology Press (上海:上海科
学技术出版社), 1990: 58 -104.
[19] Deng A H,Wang N,Yi X,et al. Determination of the
DNA(G + C)mol% in Bacillus claussi strains by re-
versed-phase high performance liquid chromatography
( in Chinese)[ J] . Biotechnology (生物技术), 2006,
16(4): 42 -45.
[20] John D R,David M O. Chitinase-overproducing mutant
of Serratia marcescens[J] . Applied and Environmental
Microbiology, 1981, 41(3): 664 -669.
[21] Ghose T K. Measurement of cellulase activities [ J] .
Pure &Application Chemistry, 1987, 59: 257 -268.
[22] Chen L H,Zhang A X,Zhu T,et al. Identification and
characterization of bacteria antagonistic to Rhizoctonia
cerealis ( in Chinese)[J] . Acta Phytopathologica Sini-
ca (植物病理学报), 2008, 38(1): 88 -95.
[23] Wei H L,Wang Y,Zhang L Q,et al. Identification and
characterization of biocontrol bacteria strain 2P24 and
CPF-10 ( in Chinese)[ J] . Acta Phytopathologica Sini-
ca(植物病理学报), 2004, 34(1): 80 -85.
[24] Zhu X F. The experimental guide for gene engineering
( in Chinese) [M] . Beijing: Higher Education Press
(北京:高等教育出版社), 2006: 24 -25.
403
　
　 3 期 　 　 董国菊,等: 烟草疫霉拮抗菌株 P-72-10 的鉴定及其拮抗代谢产物初步分析
[25] Franco W,Ramon J,Sedler, et al. A highly selective
PCR protocol for detecting 16S rDNA genes of the ge-
nus Pseudomonas ( sensu stricto ) in environmental
samples[J] . Application Environmental Microbiology,
1998, 64(7): 2545 -2553.
[26] Hass D, Défago G. Biological control of soil-borne
pathogens by fluorescent Pseudomonas[ J] . Nature Re-
view Microbiology, 2005, 3(4): 309 -319.
[27] Kumatani T,Yoshimi Y,Nakayashiki H,et al. Phyloge-
netic analyses of plant-growth-promoting rhizobacteria
isolated from tomato, lettuce, and Japanese pepper
plants in Hyogo Prefecture, Japan [ J ] . Journal of
General Plant Pathology, 2009, 75: 316 -321.
[28] Zhang W R,Bai Y,Xiao M. Diversity of the Pseudo-
monas fluorescens from rhizosphere of different plants
in Shanghai( in Chinese)[J] . Journal of Shanghai Nor-
mal University (上海师范大学学报), 2008, 37(2):
182 -188.
[29] Iavicoli A,Boutet E,Buchala A,et al. Induced systemic
resistance in Arabidopsis thaliana in response to root
inoculation with Pseudomonas fluorescens CHA0[ J] .
Molecular Plant-Microbe Interactions, 2003, 16(10):
851 -858.
[30] Yan Z N,Reddy M S,Ryu C M,et al. Induced syste-
mic protection against tomato late blight elicited by
plant growth-promoting rhizobacteria [ J] . Phytopatho-
logy, 2002, 92(12): 1329 -1333.
[31] Hase S,Van Pelt J A,Van Loon L C,et al. Coloniza-
tion of Arabidopsis roots by Pseudomonas fluorescens
primes the plant to produce higher levels of ethylene
upon pathogen infection[J] . Physiological and Molecu-
lar Plant Pathology, 2003, 62: 219 -226.
[32] Zhu X D,Feng Z T,Xu Y Q,et al. Biocontroling of
melon gummy stem blight (Mycosphaeralla melonis)
using Pseudomonas fluorescens M18 ( in Chinese )
[J] . Journal of Shanghai Jiaotong University(上海交
通大学学报), 2001, 35(7): 1062 -1065.
[33] Marten R,Smalla K,Berg G. Genotypic and phenotypic
differentiation of an antifungal biocontrol strain belon-
ging to Bacillus subtilis[J] . Journal of Applied Micro-
biology, 2000, 89: 463 -471.
[34] Lugetenberg B J,Dekkers L,Bloemberg G V. Molecu-
lar determinants of rhizosphere colonization by Pseudo-
monas[ J] . Annual Review of Phytopathology, 2001,
39: 461 -490.
责任编辑:曾晓葳
503