全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(4): 381-386(2012)
收稿日期: 2011-09-02; 修回日期: 2012-02-08
基金项目: 上海市科委技术标准专项项目(10DZ0503300; 11DZ0502700)
通讯作者: 杨翠云,研究员,主要从事植物病理学研究; Tel: 021-38620580, E-mail: yangcy@shciq. gov. cn
第一作者: 崔学慧(1986 - ),女,安徽人,硕士研究生,主要从事植物病毒检测研究; E-mail: sophere200@163. com。
实时荧光 RT-PCR方法检测香石竹环斑病毒
崔学慧1 陈舜胜1, 于 翠2, 杨翠云2*
( 1上海海洋大学, 上海 201306; 2上海出入境检验检疫局, 上海 200135)
摘要:本研究以香石竹环斑病毒(Carnation ringspot virus, CRSV)的 5 个分离物为研究对象,根据 CRSV运动蛋白(MP)基
因的保守序列设计一对特异性引物和 TaqMan荧光探针,建立了检测 CRSV 的实时荧光 RT-PCR( real-time fluorescent RT-
PCR)方法。 该方法利用 TaqMan探针水解产生的荧光信号实时监测目标基因的扩增,实现 real-time fluorescent PCR 扩增
和检测同步进行。 结果表明,本研究建立的实时荧光 RT-PCR方法具有更快速、灵敏和特异的优点,与普通 RT-PCR方法相
比其灵敏度提高了 100 倍,适合于对进境种苗携带的 CRSV的快速检测。
关键词:香石竹环斑病毒; 实时荧光 RT-PCR; 检测
Detection of Carnation ringspot virus by real-time fluorescent reverse transcription
polymerase chain reaction 　 CUI Xue-hui1, CHEN Shun-sheng1, YU Cui2, YANG Cui-yun2
( 1Shanghai Ocean University, Shanghai 201306,China; 2Shanghai Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Shanghai
200135,China)
Abstract: In this study, a pair of specific primers and a TaqMan probe were designed according to the con-
served movement protein (MP) gene sequences of Carnation ringspot virus (CRSV), and a real-time fluores-
cent PCR method was applied for detection of CRSV. This method used the fluorescent signal generated from
the hydrolysis of TaqMan probe to real-time monitor amplification of the target gene. It realized synchroniza-
tion between real-time fluorescent RT-PCR amplification and detection. The results showed that the method
was better than others in efficiency and specificity, and 100 times more sensitive than common RT-PCR. This
method had potential to be applied in rapid detection of CRSV in incoming seedlings.
Key words: Carnation ringspot virus; real-time fluorescent RT-PCR; detection
中图分类号: S432. 41　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)04-0381-06
　 　 香石竹环斑病毒 (Carnation ringspot virus,
CRSV)属于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)、香
石竹环斑病毒属(Dianthovirus)。 病毒粒子呈球
形,直径 34 nm,由 180 个蛋白亚基形成一 T 形结
构。 病毒粒子在磷钨酸和醋酸铀中稳定。 核酸为
单链 RNA,分为 RNA-1 和 RNA-2 两个基因组分。
CRSV广泛分布于温带香石竹种植区,可经无性繁
殖材料以及植株根、茎和叶的接触传播,但不能种
传[1 ~ 3]。 自然条件下,CRSV 主要侵染香石竹的
茎、叶、花和顶端分生组织,造成植株的生长势减
弱、发育迟缓和病部形成环斑等症状,严重影响了
花卉的观赏性。 此外,CRSV 还能侵染梨、葡萄、
李、苹果和樱桃等植物,造成比较严重的损失。 在
机械接种条件下,CRSV 可以侵染多达 25 科 130
多种的双子叶植物。 随着我国香石竹种植面积的
不断扩大,国外香石竹优质种苗的引入需求量也越
来越大,香石竹环斑病毒随进境种苗传入我国的风
险很高。 因此,需要加强口岸对 CRSV 高灵敏度
　
植物病理学报 42 卷
检测技术的研究,提高病毒的检出率,防止该检疫
性病毒随进境香石竹种苗传入而使我国的花卉业
遭受严重的损失。
香石竹环斑病毒可通过生物学、血清学等传统
方法检测。 如 Tao等[4]应用斑点免疫法检测了进
口香石竹幼苗中的香石竹环斑病毒,并通过碱性磷
酸酶标记抗体进行的 DAS-ELISA 试验[5],检测了
香石竹环斑病毒的灵敏度。 但目前国内有关香石
竹环斑病毒检测方法的研究较少,并且传统的血清
学检测方法耗时长、准确度低。 随着分子生物学方
法的研究日趋成熟,其在植物检疫领域发挥着越来
越大的作用。 实时荧光 PCR ( real-time PCR)于
1996 年由美国 Applied Biosystems 公司推出,是在
PCR体系中加入荧光基团,利用荧光信号的积累
实时监测整个 PCR 进程,最后通过标准曲线对模
板进行定量分析。 该技术不仅能对病毒定性,而且
重复性好,能够高效、准确、快速、灵敏地定量病毒
模板。 目前,国内实时荧光 PCR 方法在植物病害
检测方面的应用研究已有不少成果。 如 Zheng
等[6]采用 PCR管吸附病毒,然后通过病毒核酸分
子杂交方法和高灵敏度实时荧光 PCR技术相结合
来检测烟草环斑病毒;Yang 等[7]首次应用免疫捕
捉反转录实时荧光 PCR 技术 ( IC-RT-Realtime
PCR)成功检测烟草环斑病毒,提供了一套快速、简
便有效的植物病毒检测方法;Zhu等[8]建立了实时
荧光 RT-PCR一步法检测番茄环斑病毒的方法;Li
等[9]应用 TaqMan探针实时荧光定量 PCR 技术早
期检测稻瘟病。
本研究以香石竹环斑病毒的 5 个分离物为试
验材料,根据 CRSV MP基因的保守序列设计特异
性引物和探针,建立快速检测香石竹环斑病毒的实
时荧光 RT-PCR方法,为进境种苗携带香石竹环斑
病毒的快速检测提供了技术支持。
1　 材料与方法
1. 1　 材料
用于本研究的 CRSV 有 5 个分离物,其中
CRSV(USA-N. occi-37B)、CRSV( IPO-DLO) -37B
和 CRSV(GERMANY) -37B为上海出入境检验检
疫局植检实验室早期保存的毒株;CRSV(PV-21-
FD)购自美国 ATCC,CRSV-Agdia购自美国 Agdia
公司。 CRSV的 5 个分离物分别在隔离温室中摩
擦接种苋色藜(Chenopodium amaranticolor)幼叶;
取发病后的叶片用于实时荧光 RT-PCR方法研究,
以健康苋色藜叶片作为阴性对照。
1. 2　 方法
1. 2. 1 　 DAS-ELISA 方法初筛 　 将冷冻保存的
CRSV 5 个分离物分别置于研钵中,加入适量病毒
接种缓冲液,充分研磨后,加入少许硅藻土。 用手
指蘸取研磨液,均匀涂抹于苋色藜叶片表面,重复
摩擦 2 ~ 3 次,并用清水冲洗。 接种后的植株放于
22 ~ 25℃隔离温室中进行培养,定期观察发病症
状。 分别取发病叶片加病毒提取缓冲液充分研磨,
将研磨所得汁液 3 000 rpm 离心 5 min 以去除残
渣,取病汁液上清进行双抗体夹心酶联免疫吸附法
(DAS-ELISA)检测。
1. 2. 2 　 引物及探针设计 　 因为 GenBank 基因库
中 CRSV的序列很少,为了加强所设计引物和探
针的准确性和防止病毒的漏检,对经 DAS-ELISA
检测 CRSV为阳性的材料,利用设计的一对引物
CRSV-F / -R-406(表 1),采用 RT-PCR 方法结合序
列分析得到了 CRSV 5 个分离物的部分序列。 根
据该 5 个分离物序列和 GenBank 基因库中公布的
2 个 CRSV MP基因(登录号为 M88589. 2 和 NC_
003531)的保守序列,设计了用于实时荧光 RT-
PCR检测的特异性引物和探针,详细信息见表 1。
Table 1　 Sequences of primers and probe used for PCR detection of Carnation ringspot virus
Primer and probe Sequence(5′~ 3′) Amplicon / bp
CRSV-F-406 CCGATGTGCCCAAGTATGT
CRSV-R-406 GGCTATGACGCCGTGAAT 406
CRSV-F-163 TTACCTGGCGCGCACTATT
CRSV-R-163 GCTCTTGAGTATGAGAGCAAG 163
Probe FAM-5CAGCAACCAGAACCG 3-TAQMAN-MGB
283
　
　 4 期 　 　 崔学慧,等:实时荧光 RT-PCR方法检测香石竹环斑病毒
　 　 其中实时荧光 RT-PCR 引物 CRSV-F / -R163
及探针 Probe(5′端标记报告荧光染料 6-Carboyflu-
orescein,FAM;3′端标记淬灭荧光染料 TAQMAN-
MGB)均由上海基康公司合成。
1. 2. 3　 RNA的提取　 分别称取摩擦接种 CRSV 5
个分离物的苋色藜叶片各 100 mg,利用 RNA提取
试剂盒(TIANGEN)提取各自的总 RNA,用于检测
CRSV的普通 RT-PCR 和实时荧光 RT-PCR 方法
研究。
1. 2. 4 　 cDNAs 第一链的合成 　 反转录试剂均购
于宝生物工程(大连)有限公司(TaKaRa),反转录
体系为 20 μL:模板 RNA 2. 0 μL、5 × AMV缓冲液
4. 0 μL、 dNTP 2. 0 μL ( 2. 5 mM)、下游引物
(CRSV-R-163)1. 0 μL(20 μM)、AMV 反转录酶
1. 0 μL(5 U·μL -1)、Inhibitor 0. 25 μL、RNasefree
H2O 补足 20 μL,室温静置 10 min,42℃恒温水浴
1 h,冰浴 2 min。
1. 2. 5　 普通 PCR 检测　 PCR 试剂均购于宝生物
工程(大连)有限公司(TaKaRa),PCR体系 25 μL:
cDNA 2. 0 μL、10 × buffer 3. 0 μL、dNTP 0. 5 μL
(10 mM)、rTaq 0. 3 μL(5 U·μL -1 )、Mg2 + 2. 0
μL(25 mM)、上下游引物(CRSV-F-163 和 CRSV-
R-163) 各 0. 2 μL ( 25 μM ), 无菌水补足至
25 μL。 　 　
PCR反应条件:94℃预变性 3 min;94℃变性
30 s, 52℃复性 30 s, 72℃延伸 30 s,30 个循环;
72℃延伸 10 min 后 25℃保存。 扩增结束后,取
10 μL PCR产物进行 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳,并
用 Bio-rad凝胶成像系统记录结果。
1. 2. 6 　 Real-time RT-PCR 检测 　 实时荧光 RT-
PCR反应在 ABI 7500 Fast 实时荧光 PCR 仪上完
成,体系为 25 μL,其中 cDNA 1 μL,2 ×反应缓冲
液 12. 5 μL,上游引物 CRSV-F-163 为 0. 5 μL(20
μM),下游引物 CRSV-R-163 为 0. 5 μL(20 μM),
探针 0. 3 μL(20 μM),加灭菌水补足 25 μL。
反应条件:预变性 95℃ 10 min, 95℃ 30 s,
60℃ 30 s,共 40 个循环。
1. 2. 7　 灵敏度对比　 称取 100 mg的带毒材料,提
取总 RNA,10 倍梯度稀释后,按照 1. 2. 4 得到不同
浓度的 cDNA 第一链,用于普通 RT-PCR 和 real-
time RT-PCR相对灵敏度的检测,其反应条件和程
序如 1. 2. 5 和 1. 2. 6。
2　 结果和分析
2. 1　 RT-PCR检测
分别从摩擦接种 CRSV 5 个分离物的带毒苋
色藜叶片中提取总 RNA,进行反转录后,以设计的
引物对 CRSV-F / R-163 进行普通 RT-PCR反应,结
果显示 CRSV 5 个分离物均能够扩增到预期大小
的 DNA条带,条带大小为 163 bp;而对感染烟草
环斑病毒(TRSV)和烟草脆裂病毒(TRV)的烟草
叶片、阴性对照均未扩增到这一特异条带(图 1),
表明针对香石竹环斑病毒设计的引物 CRSV-F / R-
163 特异性强。
2. 2　 Real-time RT-PCR
分别从摩擦接种 CRSV 5 个分离物的苋色藜
叶片中提取总 RNA,以反转录的 cDNA 为模板进
行实时荧光 RT-PCR 反应(图 2)。 由图 2 可见,
ΔRn增长的曲线分别是 CRSV 的 5 个分离物,其
Ct值分别是 15. 158 5,17. 269 7,18. 203 2,20. 494 8
和 21. 580 9,而 TRSV、TRV、健康叶片和空白对照
均无曲线扩增。 说明设计的探针和引物对该病毒
具有很强的特异性。
Fig. 1　 Specificity of RT-PCR for detection of Carnation ringspot virus
M: DL 2 000 Marker; 1: CRSV-Agdia; 2: CRSV(USA-N. occi-37B); 3: CRSV( IPO-DLO) -37B;
4: CRSV(GERMANY) -37B ; 5: CRSV(PV-21-FD); 6: TRSV; 7:TRV; 8: Healthy leaves.
383
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 2　 Specificity of real-time fluorescent RT-PCR for detection of Carnation ringspot virus
1: CRSV-Agdia; 2:CRSV(USA-N. occi-37B); 3:CRSV( IPO-DLO) -37B; 4:CRSV(GERMANY) -37B ;
5:CRSV(PV-21-FD); 6:TRSV;7:TRV; 8:Healthy leaves; 9:Water control.
2. 3　 灵敏度对比
以香石竹环斑病毒的其中一个分离物:CRSV
( IPO-DLO) -37B为例,研究了 RT-PCR和 real-time
RT-PCR检测 CRSV的灵敏度。
由 RT-PCR 扩增结果可见,当 RNA 稀释 104
倍时,还可观察到电泳条带。 但当 RNA 稀释 105
倍时,则观察不到电泳条带(图 3)。 而使用 real-
time RT-PCR方法,当 RNA 稀释 106 倍时,仍有扩
增曲线,且曲线呈平滑 S 型,直至稀释 107 时不再
有扩增曲线(图 4)。
利用 Eppendorf BioPhotometer,对 CRSV( IPO-
DLO) -37B的 RNA浓度进行了测定,其浓度为 3. 2
μg·μL -1,经计算,普通 RT-PCR能够检测到 RNA
的最低含量为 0. 64 ng,而 real-time RT-PCR 可达
到 6. 4 pg。
3　 讨论
香石竹环斑病毒为我国进境植物检疫法规中
明确规定禁止入境的检疫性有害生物,对该病毒的
准确检测和鉴定有利于防止病毒传入我国,避免对
我国花卉业和农业生产造成较大的损失。 目前口
岸对植物病毒的检测一般采用 DAS-ELISA方法初
Fig. 3　 Sensitivity of RT-PCR for detection of Carnation ringspot virus
M: DL 2 000 Marker; 1-7: RNA of CRSV at dilutions of 100、101、102、103、104、105 and 106; 8: Water control.
483
　
　 4 期 　 　 崔学慧,等:实时荧光 RT-PCR方法检测香石竹环斑病毒
Fig. 4　 Sensitivity of real-time fluorescent RT-PCR for detection of Carnation ringspot virus
1-7: RNA of CRSV at dilutions of 100、101、102、103、104、105 and 106; 8: Healthy leavers; 9: Water control.
筛,然后用 RT-PCR 或者免疫电镜等方法进行验
证。 由于植物病毒在种苗中的分布不均匀,造成口
岸送检样品中病毒的含量非常低,很容易在实际检
测过程中发生病毒的漏检现象,很有可能造成外来
重大有害生物对我国的入侵。 因此,高灵敏度和高
特异性的实时荧光 RT-PCR 检测方法已经成为口
岸研究的热点[10 ~ 14]。
实时荧光 RT-PCR 不仅比普通 RT-PCR 更加
灵敏、快速和特异,而且能够对模板进行准确定量,
同时也避免了普通 PCR技术中存在的假阳性污染
和 EB染料对实验人员和环境的危害。 目前实时
荧光定量 PCR技术在动物医学病理和分子生物学
研究领域应用十分广泛[10 ~ 12],但在植物病害检测
方面的研究仍然较少,尚未见利用实时荧光 RT-
PCR方法检测香石竹环斑病毒的报道。
本研究根据测定的 CRSV 5 个分离物的核苷
酸序列和基因库中已登录的 CRSV MP 基因保守
序列设计引物和探针,建立了快速检测香石竹环斑
病毒的实时荧光 RT-PCR方法。 由试验结果可知,
采用实时荧光 RT-PCR 方法检测 CRSV 的 5 个分
离物的 Cp 点均在 15 ~ 23 个循环内,且 PCR 过程
中有明显△Rn 的增长且扩增曲线均呈较好的 S
型,而 TRSV、TRV、健康叶片和空白对照均未出现
扩增,本研究设计的 TaqMan 探针具有一条特异性
的荧光双标记探针,可将非特异性产物区分开,表
明建立的检测方法具有较强的特异性。 灵敏度试
验结果表明,普通 RT-PCR可以检测 CRSV的最低
RNA量为 0. 64 ng,而实时荧光 RT-PCR 最低检测
CRSV的 RNA量为 6. 4 pg,是普通 RT-PCR的 100
倍。 因此,在口岸进境种苗携带病毒的实际检测过
程中,对于携带更低含量香石竹环斑病毒的植物材
料来说,采用实时荧光 RT-PCR方法可以会得到更
好的效果,大大提高病毒的检出率,对口岸准确检
测鉴定香石竹环斑病毒具有更为实用的价值。
参考文献
[1] 　 J. A. Dodds, J. H. Tremaine, W. P. Ronald. Some
properties of Carnation ringspot virus single- and doub-
le-stranded ribonucleic acid [ J] . Virology, 1977, 83
(2): 322 -328.
[2] 　 J. Kalmakoff, J. H. Tremaine. Some physical and
chemical properties of Carnation ringspot virus [ J] .
Virology, 1967, 33(1): 10 -16.
583
　
植物病理学报 42 卷
[3] 　 Chen D H, Yu S. The molecular detection of Carna-
tion ringspot virus ( in Chinese) [J] . Plant Quarantine
(植物检疫), 1997, 11(5): 257 -260.
[4] 　 Tao T D, Zhang J R, Xiong Y L. Detection of Carna-
tion ringspot virus by dot immunobinding. ( in Chi-
nese)[ J] . Plant Quarantine (植物检疫), 1992, 6
(6): 422 -424.
[5] 　 Tao T D,Yi J P, Shen Y F. Detection of Carnation
ringspot virus by DAS - ELISA. ( in Chinese) [ J] .
Plant Quarantine (植物检疫), 2001, 4(15): 216 -
217.
[6] 　 Zheng Y, Yang W D,Chen Z N, et al . A study on
detection of Tobacco ringspot virus by DB-RT-Real-
time PCR ( in Chinese) [J] . Acta Phytophylacica Sin-
ica (植物保护学报), 2007, 33(1): 117 -119.
[7] 　 Yang W D, Zheng Y, Zhang G M, et al . Method for
detecting Tobacco ringspot virus by IC-RT-Realtime
PCR( in Chinese) [ J] . Virologica Sinica (中国病毒
学), 2006, 21(3): 277 -280.
[8] 　 Zhu J Y,Zhu S F,Liao X L,et al. Detection of Toma-
to ring spot virus by real-time fluorescent RT-PCR one
step assay ( in Chinese) [ J] . Acta Phytopathologica
Sinica(植物病理学报) , 2003, 33(4): 338 -341.
[9] 　 Li Q,Kong B H,Fan J H, et al . Early detection of
rice blast by TaqMan real-time flourescence quantita-
tive polymerase chain reaction ( in Chinese) [J] . Acta
Phytopathologica Sinica (植物病理学报 ), 2011,
41(2): 118 -123.
[10] Kas sanis B. Some properties of four viruses isolated
from carnation plants[J] . Annals of Applied Biology ,
1955, 43(1): 103 -113.
[11] Heid C A,Stevens J,Livak K J,et al. Real- time quan-
titative PCR [ J] . Genome Research, 1996, 6: 986 -
994.
[12] Mikaell, Josema,Martinb, et al. The real-time poly-
merase chain reaction. Molecular Aspects of Medicine,
2006, 27: 95 - l25.
[13] Qian G L,Hu B S,Lu L,et al. Detection of Erwinia
amylovora by real-time fluorescent PCR ( in Chinese)
[J] . Acta Phytopathologica Sinica (植物病理学报) ,
2006, 36 (2): 123 -128.
[14] Chen X,Qi F K,Kang L G,et al. Advance and appli-
cation of real-time fluorescent quantitative PCR ( in
Chinese) [ J ] . Journal of Northeast Agricultural
University(东北农业大学学报), 2010, 41(8): 148
-155.
责任编辑:李晖
683