全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""*$"!+
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#
"&*#!(*"&
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#",&-"-
%
.
,/001,#"""*$"!+,!"#$,"&,#!(
收稿日期$
!"#$*"%*#$
&修改稿收到日期$
!"#$*"$*!#
基金项目$教育部新世纪优秀人才支持计划"
2345*##*"-&"
#&国家自然科学基金"
%#!&!#&+
#&江苏省杰出青年基金"
67!"#%""!&
#&江苏
高校优势学科建设项目"
!"##898:
#&江苏省双创计划"
!"##;<<3
#
作者简介$谭国飞"
#(()
#!男!在读硕士研究生!主要从事蔬菜分子生物学研究
4*=>/?
$
!"#!#"$"("
!
1
.
>@,AB@,C1
"
通信作者$熊爱生!博士!教授!博士生导师!主要从事蔬菜遗传育种与分子生物学研究
4*=>/?
$
D/E1
F
>/0GA1
F!
1
.
>@,AB@,C1
鸭儿芹肉桂酸
$%
羟化酶基因的克隆
与不同温度下的表达分析
谭国飞!王
!
枫!王广龙!徐志胜!熊爱生"
"南京农业大学 作物遗传与种质创新国家重点实验室!农业部华东地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室!园艺学院!南京
!#""+
#
摘
!
要$为研究鸭儿芹木质素合成相关基因!以贵州省野生鸭儿芹为研究对象!克隆到
#
条
#-%#H
I
长的肉桂酸
$*
羟化酶"
3$J
#基因"
!
"
!$#
#!并以鸭儿芹生长过程中主要面临的
$
种不同温度"
#"K
(
#(K
(
%"K
和
%(K
#处理
"
(
",+
(
#
(
!
(
$
((
#!
和
!$G
!考察鸭儿芹木质素合成基因
!
"
!$#
的表达情况!探讨鸭儿芹木质素合成基因受温度的
调控关系!为鸭儿芹适宜生长温度的选择提供参考开放阅读框"
LMN
#分析显示!
!
"
!$#
基因的开放阅读框
"
LMN
#长度为
#+!#H
I
!可编码
+"-
个氨基酸!蛋白分子质量为
+(,#%O:
!等电点为
,%(
进化树分析表明!同科
植物之间
3$J
进化上相对保守实时定量
83M
检测鸭儿芹中
!
"
!$#
基因与温度的响应表达!结果表明
%(K
高
温处理
$G
时!
"
!$#
基因表达量远高于其他温度处理&而
#"K
和
#(K
相对低温处理!
!
"
!$#
基因表达在
!$G
时明显提高
关键词$鸭儿芹&
!
"
!$#
&木质素&荧光定量
83M
&温度处理&基因表达量
中图分类号$
P&(+
&
P&(
文献标志码$
9
&"()*#"+)+!,-
.
/0#"+1+)(
2
#"34#++)5#616#!$%7
2
!/"-
2
()080+0
9+!0/:#330/0+*;05
.
0/)*9/0#+1(
23
#&#$)/-$
4
$
3
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592Q@ERA/
!
S92QNA1
F
!
S92QQ@>1
F
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F
!
DTUG/0GA1
F
!
DVL2Q9/0GA1
F
"
"
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X
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X
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I
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I
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X
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X
Y>HEZ>WEZ
X
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I
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I
0/14>0W3G/1>
!
3E?A
F
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!
2>1
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F
9
F
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X
!
2>1
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/1
F
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!
3G/1>
#
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X
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F
1/10
X
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F
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"
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!
WGA
F
A1A
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"
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I
!
]G/CGA1CEB/1
F
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X
BZE^
X
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"
3$J
#
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F
1/10
X
1WGA0/0
!
]>0C?E1ABRZE=]/?B\>Z/AW
X
!.
"
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&
(+,-)J>00OERQ@/_GE@8ZE\/1CA,!.
"
)
&
(+,-)J>00O]>0
F
ZE]1@1BAZ
$B/RRAZA1WWA=
I
AZ>W@ZA0
"
#"K
!
#(K
!
%"K>1B%(K
#
,5GA!
"
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F
A1A0A^
I
ZA00/E1]>0BAWACWAB>W"
!
",+
!
#
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(
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I
ZE\/BAZARAZA1CAREZ!.
"
)
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(+,-)J>00O0@/W>H?A
F
ZE]WGWA=
I
AZ>W@ZA0A?AC*
W/E1,5GALMN
"
L
I
A1MA>B/1
F
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X
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X
0/0BA=E10WZ>WAB
WG>WWGAA1_
X
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I
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I
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"
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F
A1A0A^
I
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B/RAZA1WWA=
I
AZ>W@ZABAWACWABH
X
ZA>?W/=A
`
@>1W/W>W/\A83M
!
WGAZA0@?W00GE]ABWG>WWGA!
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F
A1AA^
I
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F
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I
AZ>W@ZAER%(K$G]>0=@CGG/
F
GAZWG>1WG>WEREWGAZWA=
I
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!
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I
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1/R/C>1W?
X
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I
AZ>W@ZAWZA>W=A1W0,
?0
2
@"/!
$
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Y/
F
1/1
&
`
@>1W/W>W/\AZA>?*W/=A83M
&
WA=
I
AZ>W@ZA0WZA00
&
F
A1AA^
I
ZA00/E1
!!
肉桂酸
$*
羟化酶"
C/11>=>WA$*G
X
BZE^
X
?>0A
!
3$J
#在植物苯丙素类和木质素类生物合成中具有
重要的作用)#*%*!属于细胞色素
I
$+"
家族成员编
码该酶的基因
!$#
是植物中第一个被克隆出来的
细胞色素基因!也是第一个确定功能的植物细胞色
素基 因)$*+*!其 催 化 肉 桂 酸 合 成
$*
香 豆 酸 "
$*
G
X
BZE^
X
C/11>=>WA
#
$*
香豆酸在不同酶的催化下
进一步向木质素(花青素或原花青素等转化)-*&*对
于叶用型蔬菜!木质素合成的增加!通常会严重影响
蔬菜的品质植物体在受到各种生物病害及非生物
逆境时!会诱导
!$#
基因的表达!以抵抗各种逆
境!如辐射)(*(机械损伤)*(高温及低温(病虫害侵
染)#"*(萘胁迫)##*和干旱等)#!*#$*
鸭儿芹"
!$
%&
()*+,)
"
)
&
(+,-)J>00O
#为伞形
科"
9
I
/>CA>A
#植物中一种药食同源性野生蔬菜!在
中国已经有
!"""
多年的食用历史鸭儿芹可以全
株用药!广泛用于治疗尿闭(肿毒(身体虚弱和蛇咬
伤等)#+*!其嫩茎叶已成为日本重要栽培蔬菜之一!
中国一些大城市周边也开始种植)#-*野生鸭儿芹
在进行人工栽培时!尤其是在夏季栽培过程中常常
受到高温的影响!导致其食用器官木质化!严重影响
鸭儿芹产品的品质
本实验从贵州野生鸭儿芹中克隆了与木质素合
成相关的
!
"
!$#
基因!对其生长过程中主要面临
的
$
种不同温度"
#"K
(
#(K
(
%"K
和
%(K
#进行
不同时间段处理!通过实时荧光定量
83M
"
`
@>1W/*
W>W/\AZA>?*W/=AM5*83M
#检测该基因在不同温度下
的表达情况!为鸭儿芹人工栽培温度调控和遗传育
种提供一定的参考
#
!
材料和方法
A,A
!
植物材料
野生鸭儿芹材料于贵州省黔南州野生环境下采
摘种子!由南京农业大学伞形科植物遗传与种质创
新实验室保存
!"#%
年

月播种出苗后移栽到南
京农业大学园艺学院实验大棚内!待植株长出
$
片
叶时于
!"#%
年
##
月!将全株鸭儿芹叶片剪下!进
行叶片总
M29
提取及
C:29
合成!用于克隆
!
"
!$#
基因
!"#%
年
##
月!将实验大棚种植的鸭儿芹植株
移栽到南京农业大学作物遗传与种质创新国家重点
实验室人工气候室种植环境条件设置温度为
!!
K
%
!"K
"白天%晚上#!日照为
#!G
%
#!G
"白天%晚
上#!湿度为
-+a
!移栽于直径
!"C=
(高
!+C=
花盆
中!营养土与蛭石配比
%b#
待其进行
#
个月恢复
生长后!
#!
月份分别进行
#"K
(
#(K
(
%"K
和
%(
K
处理
"
(
",+
(
#
(
!
(
$
((
#!
和
!$G
!取植株第
-
片健
康成熟叶片!提取叶片总
M29
进行反转录成
C:*
29
!用于实时定量
83M

ABC
!
DE1
的提取及
6:E1
的合成
采用
M290/=
I
?A5EW>?M297/W
"
5/>1
F
A1
公
司#试剂盒!提取实验材料的总
M29
!再用
#,!a
的
琼脂糖凝胶电泳检测总
M29
的完整性!浓度测定
采用
2>1EBZE
I
2:#"""
分光光度计 "
2>1EBZE
I
5ACG1E?E
F
/A0V1C
!
:A?>]>ZA
!
T<9
#进 行!利 用
8Z/=AI
WM5ZA>
F
A1W7/W
"
5>7>M>
公司#将提取
的总
M29
反转录成
C:29

C:29
合成体系的总
体积为
!"
"
Y
!反应条件及过程为总
M29
和
+"
"
=E?
+
Y
)#
L?/
F
E
"
B5
#混合均匀后!于
&"K
水浴
#"
=/1
&然后加入
[*[Yc
反转录酶"
!""T
#(
B258
"
#"==E?
+
Y
)#
#(
M2>0A
抑制剂"
$"T
!
5>7>M>
公
司#及灭菌的双蒸水!置于
$!K
水浴
-"=/1
!最后
于
&"K
水浴变性
#+=/1

ABF
!
鸭儿芹
1
4
1$5
基因克隆
以阿米芹
!$#
基因"登录号
9d!##(,#
#
)
#&
*
和香芹
!$#
基因"登录号
Y%(((,#
#
)
#(
*为参考序
列!将
!
条参考序列进行比对根据比对结果!用
8ZA=/AZ+,"
软件在
!
条参考基因序列较一致区域!
可阅读框外设计上游引物
3
.
3$JN
"
+e*9535939*
393335535535595353*%e
#和下游引物
3
.
3$JM
"
+e*5Q59Q39999595535399Q533Q3*%e
#
反应条件为
$K
预变性
$=/1
!然后按照
$K
变
性
%"0
!
+$K
退火
-"0
!
&!K
延伸
#,+=/1
进行
%+
个循环!最后
&!K
延伸
#"=/1
用
#,!a
的琼脂糖
凝胶电泳分离
M5*83M
产物回收后的
83M
产物
连接到
I
[:#(*5
载体上!并转化到大 肠杆菌
:J+
#
随后进行质粒的酶切与鉴定!委托南京金
斯瑞生物科技有限公司进行
:29
测序
!#
&
期
!!!!!!!!!
谭国飞!等$鸭儿芹肉桂酸
$*
羟化酶基因的克隆与不同温度下的表达分析
A,$
!
序列分析
采用
:29[92
软件对序列进行多重比较!同
时进行氨基酸疏水%亲水性区域预测(酸碱氨基酸统
计等相关分析!然后用
[4Q9+
构建进化树和编辑
并生成报告图形)#*
ABG
!
实时定量
H4D
反应和基因表达分析
实时定量
83M
采用
2
试
剂盒"
5>7>M>
公司#!按照操作说明进行相对定
量使用参照基因的
$
!
5
法!表达差异等于
!
)
$
!
5
!
$
!
5
f!
5
目标基因)!
5)-,+
相对定量是基于处理和对
照之间!目标基因对参考基因表达量的比较采用
/P
5[
+0ERW]>ZA
和
/P
5[
+MA>?*W/=A83M<
X
0WA=
完
成荧光定量
83M
根据克隆到的鸭儿芹
!
"
!$#
基
因序 列!设 计 表 达 差 异 检 测 引 物!上 游 引 物
3
.
3$J6:N
"
+e*Q5QQ399Q999353999353*
33*%e
#和下游引物
3
.
3$J6:M
"
+e*353953553*
3533995Q35393*%e
#用鸭儿芹
)-,+
基因作
为内参基因!其引物为
>CW/1N
"
+e*35Q3999Q9Q*
39Q3535535Q5QQ9*%e
#和
>CW/1M
"
+e*5Q59*
9Q55Q5353Q5QQ955335Q3*%e
#!目标 基 因
与
)-,+
基因一起扩增基因表达情况及分析采用
[/CZE0ERW4^CA?!""&
和
V6[<89<进行
!
!
结果与分析
CBA
!
鸭儿芹
1
4
1$5
基因的克隆
以鸭儿芹
C:29
为模板!用引物
3
.
3$JN
和
3
.
3$JM
进行克隆!得到一条约
#-""H
I
的扩增产
物"图
#
#!将克隆得到的第
!
和第
%
道的产物进行
回收!回收产物分别进行连接(转化到大肠杆菌
:J+>
!鉴定后送去公司进行测序!
!
个泳道获得的
!
"
!$#
基因序列结果一样!长度为
#-%#H
I
长通
过开放阅读框"
E
I
A1ZA>B/1
F
RZ>=A
!
LMN
#预测!其
图
#
!
鸭儿芹
!
"
!$#
基因的克隆
[,:Y!"""
&
#
%
%,83M
扩增产物
N/
F
,#
!
83M>=
I
?/R/C>W/E1ER!
"
!$#
F
A1A
RZE=!.
"
)
&
(+,-)J>00O,
[,:Y!"""
&
#
%
%,8ZEB@CWER83M>=
I
?/R/C>W/E1
开放阅读框为
#+!#H
I
长!可编码
+"-
个氨基酸
"图
!
#!其中酸性氨基酸为
#"&
个!碱性氨基酸为
("
个!中性氨基酸为
%#
个!蛋白分子质量为
+(,#%
O:
!等电点为
,%(
通过对其蛋白亲水%疏水性预
测!该蛋白亲水性区域多于疏水性区域!该蛋白可能
属于亲水性氨基酸
图
!
!
鸭儿芹
!
"
!$#
基因序列及编码氨基酸序列
"
,
表示终止密码子!方框标记的核苷酸片段为引物序列!
下划线标记的核苷酸片段为荧光检测引物序列
N/
F
,!
!
2@C?AEW/BA>C/B>1BBAB@CAB>=/1E>C/B
0A
`
@A1CA0ER!
"
!$#RZE=!.
"
)
&
(+,-)J>00O,
"
,MA
I
ZA0A1W0WGA0WE
I
CEBE1
!
WGA
I
Z/=AZ0A
`
@A1CA
]>0=>ZOABH
X
HE^
&
WGA
`
@>1W/W>W/\AZA>?*W/=A83M
I
Z/=AZ0A
`
@A1CA]>0=>ZOABH
X
@1BAZ?/1A
""%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
CBC
!
鸭儿芹
1
4
1$5
基因及氨基酸序列与阿米芹(
香芹比较
将获得的鸭儿芹
!
"
!$#
基因序列及翻译的氨
基酸序列与阿米芹和香芹进行比较!比对结果显示
该基因序列与氨基酸序列在
%
种伞形科植物中高度
保守"图
%
%
$
#三者
!$#
基因阅读框长度一样!
编码氨基酸长度一样!三者基因相 似 度 高 达
-,"-a
!氨基酸序列相似度高达
-,&&a
两两比
较显示!鸭儿芹
!
"
!$#
基因与阿米芹和香芹相似
度分别为
",(-a
和
",a
!而阿米芹与香芹
!$#
基因相似度为
-,"-a
!它们三者的氨基酸相
似度分别为
#,+"a
(
#,%"a
和
(,$!a
!表明阿米
芹与香芹该基因进化上接近!与鸭儿芹相对较远
CBF
!
鸭儿芹
4
I
4$<
的进化分析
为了进一步研究
3$J
进化的关系!将
%
种伞形
科植物的
3$J
氨基酸序列与其它
$"
个物种
3$J
氨基酸序列构建
2;
进化树"图
+
#进化树上阿米
芹与香芹进化接近!而与鸭儿芹进化有一定的距离
同时由进化树上看!
3$J
氨基酸序列在不同科植物
中!不是很保守!如豆科的大豆和苜蓿与黄芪(黄芩
和银合欢不在一个分支上!伞形科的当归与
%
种伞
形科植物进化上不在一个大分支上!禾本科的水稻
图
%
!
%
种伞形科植物
!$#
基因的比对
N/
F
,%
!
9?/
F
1=A1WER
F
A1A0A
`
@A1CA0ER!$#RZE=WGZAA9
I
/>CA>A
I
?>1W0
#"%#
&
期
!!!!!!!!!
谭国飞!等$鸭儿芹肉桂酸
$*
羟化酶基因的克隆与不同温度下的表达分析
与高粱和绿竹不在一个分支上!百合科的大蒜与洋
葱不在一个分支上!唇形科的丹参与罗勒和圣罗勒
不在一个分支上
CB$
!
鸭儿芹
1
4
1$5
基因在不同温度处理下表达情
况分析
为了研究鸭儿芹
!
"
!$#
基因对不同温度处理
的响应!对鸭儿芹幼苗进行
#"K
(
#(K
(
%"K
与
%(
K
分别处理
"
(
",+
(
#
(
!
(
$
((
#!
和
!$G
!通过荧光定
量
83M
检测
!
"
!$#
基因的相对表达量"以
"G
为
对照!表达量为
#
#检测结果表明"图
-
#!在
",+G
时!
%"K
和
%(K
处理表现出高表达!其中
%(K
处
理表达量高于
%"K
处理!而在
#"K
和
#(K
处理表
图
$
!
%
种伞形科植物
3$J
氨基酸序列比对
N/
F
,$
!
9?/
F
1=A1WER>=/1E>C/B0A
`
@A1CA0ER3$JRZE=WGZAA9
I
/>CA>A
I
?>1W0
图
+
!
不同植物
3$J
进化树
括号内的编号为氨基酸登录号
N/
F
,+
!
8G
X
?E
F
A1AW/CWZAAER>=/1E>C/B0A
`
@A1CA0ERWGA3$JRZE=B/RRAZA1W
I
?>1W0
I
AC/A0
5GA>CCA00/E12E,]>0
F
/\A1/1HZ>COAW0
!"%#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
-
!
不同温度处理下鸭儿芹
!
"
!$#
基因的相对表达
N/
F
,-
!
MA?>W/\AA^
I
ZA00/E1>1>?
X
0/0ER!
"
!$#
F
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时!
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时!
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和
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处理下
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表达量高于
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处理下表达量很低&
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和
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处理下
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基因
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时!
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和
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基因表达在
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讨
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论
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体
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基因转入到拟南芥中!明显地抑制拟南芥
木质素的合成)!%*转基因杨树中
!$#
基因表达量
下降显著降低了转基因杨树植株木质素的合成)!$*
!$#
基因在植物中的表达具有特异性!毛竹中的研
究表明!
$#
基因在毛竹的不同发育时期和不同组
织中表达不同!在冬笋中表达量最高!在春笋基部表
达量最低)!+*
!!
栽培鸭儿芹的目的在于获得鸭儿芹叶及叶柄作
为食材!抑制鸭儿芹叶及叶柄中木质素的合成对提
高鸭儿芹品质具有重要作用本研究以贵州地区野
生鸭儿芹为研究对象!克隆了鸭儿芹
!
"
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基因
不同温度"
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K
和
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基因表达在处理
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时变化不
大!而在处理
#!
和
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时表达量较大幅度增加!且
温度越低表达峰值出现得越晚说明高温"
%(K
#
处理导致鸭儿芹木质素合成相关基因响应更快更
强&低温"
#"K
和
#(K
#处理则导致鸭儿芹木质素
合成相关基因表达相对迟缓上述鸭儿芹木质素合
成相关基因
!
"
!$#
的温度调控!可能与生产上高
温下鸭儿芹易出现干硬!而低温下则相应脆嫩相
吻合
!$#
基因在不同物种中!如苦荞)+*(黄瓜)#"*(
膜荚黄芪)!-*(拟南芥)!&*(花生)!(*等其它物种的研究
上!该基因阅读框长度在
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%
#+!$H
I
左右!基
因长度在不同物种中相对保守但构建进化树表明
在同科属植物!
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进化上不是很保守在
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#!这在芹菜(水芹和胡萝卜该基因预测上也
存在该特点!可能是伞形科植物该基因进化上的
特点
实际栽培蔬菜过程中!特别是叶用型蔬菜!温度
严重影响它们的品质与生长速度人工栽培鸭儿芹
过程中!温度低!虽然能延迟木质部的合成!但低温
下鸭儿芹的生长发育不良!产量低&高温下!虽然能
促进鸭儿芹的生长发育!但易导致鸭儿芹老化!木质
化程度提前出现!同时温度过高!也会阻碍鸭儿芹生
长发育从实验研究结果来看!鸭儿芹适合于冷凉
环境下生长!这与鸭儿芹为冷凉型蔬菜相吻合)!*
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