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Identification and biological characteristic of blueberry Diaporthe bud blight pathogen

蓝莓间座壳芽枯病病原菌鉴定及其生物学特性



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  45(5): 556 ̄560(2015)
收稿日期: 2014 ̄08 ̄31ꎻ 修回日期: 2015 ̄05 ̄29
基金项目: 农业部公益性行业 (农业) 科研专项 ( 201103037)ꎻ 辽宁省科学技术计划资助 ( 2013204001)ꎻ 沈阳市科技计划资
助(F12 ̄132 ̄3 ̄00)
通讯作者: 李天来ꎬ教授ꎬ主要从事设施园艺植物研究ꎻE ̄mail:tianlaili@126.comꎮ
doi:10.13926 / j.cnki.apps.2015.05.015
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研究简报
蓝莓间座壳芽枯病病原菌鉴定及其生物学特性
严雪瑞ꎬ 王 旭ꎬ 胡梦琼ꎬ 代汉萍ꎬ 傅俊范ꎬ 李天来∗
(沈阳农业大学ꎬ 沈阳 110866)
Identification and biological characteristic of blueberry Diaporthe bud blight
pathogen  YAN Xue ̄rui ꎬWANG Xuꎬ HU Meng ̄qiongꎬ DAI Han ̄pingꎬ FU Jun ̄fanꎬ LI Tian ̄lai  (Shen ̄
yang Agricultural Universityꎬ Shenyang 110866ꎬ China)
Abstract: Bud blight was a new disease on blueberry. Pathogenicityꎬ identification and biological
characteristics of bud blight pathogen were conducted in this study. The pathogen was placed in Diaporthe eres
clade in phylogenitic tree based on combined ITSꎬEF1 ̄α and TUB sequences. Comprehensive analysis of mor ̄
phological characteristics and phylogenitic tree identified the pathogen as Diaporthe eres. This pathogen was dif ̄
ferent from the reported Diaporthe spp. on blueberry in phylogenitic positionꎬ symptoms and morphological cha ̄
racteristics. The biological characteristics test showed that the pathogen perferred high temperatureꎬ and was not
sensitive to light and nutrition.
Key words: blueberryꎻ Diaporthe bud blightꎻ Diaporthe eresꎻ biological characteristics
文章编号: 0412 ̄0914(2015)05 ̄0556 ̄05
    蓝莓(Vaccinium corymbosum L.)ꎬ属于杜鹃花
科(Ericaceae)越橘属(Vaccinium)多年生小浆果类
果树ꎬ果实蓝色ꎬ营养丰富ꎬ具有良好的保健作用ꎮ
随着蓝莓的大面积商业化种植ꎬ其病害的发生也愈
加频繁ꎮ 2013年 7月对沈阳市蓝莓种植园病害调
查时ꎬ发现一种新病害ꎮ 该病主要危害基生枝中上
部芽眼ꎬ受害芽坏死ꎬ芽眼周围出现褐色或红褐色
椭圆形病斑ꎬ凹陷ꎬ后期中部呈灰白色ꎬ病斑
1~2 cmꎬ发病率约 15%ꎬ严重影响蓝莓产量ꎮ 本研
究针对该病害进行了致病菌分离和柯赫氏证病测
定ꎬ并对致病菌进行了鉴定ꎮ
1  材料与方法
1.1  病原菌的分离与鉴定
1.1.1  病原菌的分离  从沈阳市蓝莓种植园采集
患病枝条ꎬ病原菌分离参照 Fang[1]的方法进行ꎬ并
对分离得到的病原菌在 PDA上进行纯培养ꎮ
1.1.2  病原菌的致病性测定  选取 2 年生健康蓝
莓植株ꎬ茎部进行表面消毒ꎬ用灭菌接种针在茎部
芽处制造伤口ꎬ将配好的孢子悬浮液(105个 / mL)
滴在伤口处ꎬ用灭菌脱脂棉包裹伤口进行保湿处
理ꎬ重复 3次ꎮ 用无菌水处理的植株作为对照ꎮ
1.1.3  病原菌的鉴定
    (1)形态学鉴定   供试菌株于 25℃ꎬPDA 培
养ꎬ观察 5 ~ 30 d 的菌落形态和产孢特征ꎬ以及在
苜蓿杆上诱导的分生孢子器特征ꎮ
    (2)分子生物学鉴定   采用 CATB 法提取该
菌的总 DNAꎬ以此为模版分别进行 ITS、EF1 ̄α 和
TUB 基因的扩增ꎮ 引物 ITS1 ( 5′ ̄TCCGTAGGT ̄
GAACCTGCGG ̄3′) / ITS4(5′ ̄TCCTCCGCTTATT ̄
 
  5期 严雪瑞ꎬ等:蓝莓间座壳芽枯病病原菌鉴定及其生物学特性
GATATGC ̄3′)ꎻ EF1 ̄728F ( 5′ ̄CATCGAGAAGT ̄
TCGAGAAGG ̄3′) / EF1 ̄986R(5′ ̄TACTTGAAGG ̄
AACCCTTACC ̄3′)ꎻBt ̄2a(5′ ̄GGTAACCAAATC ̄
GGTGCTGCTTTC ̄3′) / Bt ̄2b ( 5′ ̄ACCCTCAGTG ̄
TAGTGACCCTTGGC ̄3′)ꎮ 反应体系和反应程序
参照 Udayanga 等[2]的方法ꎮ 扩增产物经检测后
送生工生物工程(上海)有限公司进行测序ꎮ
    (3)序列分析   从 GenBank 中获取模式菌
株[2~5]的相关序列ꎬ 采用 CLUSTALW 2. 0 和
MEGA 5 用邻接法(NJ)对供试菌株及模式菌株进
行 ITS、EF1 ̄α和 TUB基因联合系统发育分析[4]ꎮ
1.2  病原菌生物学特性
    以 3 mm的菌饼作为出发菌落直径ꎬ进行不同
培养基(PDA、PCA、孟加拉红、蓝莓茎秆煎汁和
WA)、不同碳源(分别用葡萄糖、果糖、可溶性淀
粉、麦芽糖置换 Czapek 培养基中的蔗糖)、不同氮
源(分别用甘氨酸、半胱氨酸、丙氨酸、蛋白胨置换
Czapek培养基中 NaNO3)、不同光照(分别在全光
照、全黑暗、12 h光暗交替、24 h 光暗交替)条件处
理ꎬ25℃下培养ꎬ5、7和 9 d 后测量菌落直径ꎬ每个
处理重复 3次ꎮ
    不同温度对供试菌的影响ꎬ选用 3 mm的菌饼
作为出发菌落直径ꎬ分别置于 15℃、20℃、25℃、
27℃和 30℃的 PDA 平板上培养ꎬ5 、7 和 9 d 后分
别测量菌落直径ꎬ每个处理重复 3次ꎮ
    采用 Excel和 SPSS17.0对数据进行整理和分析ꎮ
2  结果与分析
2.1  病原菌的分离与形态学鉴定
    病样组织分离获得形态一致的白色菌落ꎬ供试
菌株编号为 LNSY003ꎮ 在 PDAꎬ25℃、12 h光暗交
替条件下ꎬ培养 7 d的菌落直径达 9 cmꎬ白色ꎬ边缘
规则ꎬ气生菌丝致密ꎬ毡状ꎮ 培养 30 d 的菌落表面
散生黑褐色分生孢子器ꎬ分生孢子器形状不规则ꎬ
顶部呈乳突状ꎬ可见黄色分生孢子角ꎮ 寄主病样镜
检观察到 α 型与 β 型分生孢子:α 型分生孢子单
胞ꎬ透明无色ꎬ椭圆形至梭形ꎬ两端各有一个明显的
油球(5.0~8.0)μm×(2.0 ~ 2.5)μmꎻβ 型分生孢子
单胞ꎬ透明无色ꎬ线性ꎬ一端常成钩状ꎬ无油球
(20~30)μm×1.25 μmꎮ 供试菌株在苜蓿杆+WA
培养基上形成黑褐色不规则分生孢子器ꎬ分生孢子
器顶部分泌黄色分生孢子角ꎬ分生孢子器(280 ~
300)μm (图 1 ̄C、D、E、H、I)ꎮ
2.2  病原菌的致病性测定
    接种后的蓝莓置于 28℃条件下培养ꎬ接种 9 d
后ꎬ接种部位出现褐色凹陷病斑ꎬ对照不发病ꎮ 对
接种发病的植株病斑部位进行再次分离ꎬ均能得到
形态特征与原始菌株一致的病原菌 (图 1 ̄A、
B、F、G)ꎮ
Fig. 1  Blueberry bud blight symptom and its pathogen characteristics
A and B: Affected buds in the fieldꎻ C: Pycnidia &Gregarious pycnidia on PDAꎻ
D: Morphological characteristics of Diaporthe eresꎻ
E: α and β conidiaꎻ F: Blueberry symptoms 7 dpiꎻG: CKꎻ H and I: Pycnidia on autoclaved stems of alfalfa+WA.
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植物病理学报 45卷
2.3  分子生物学鉴定
    对供试菌的 ITS、EF1 ̄α和 TUB基因扩增并测
序ꎬ分别获得 576 、330 和 520 bp 的基因片段ꎬ
GenBank登录号分别为 KJ867089、KJ867090ꎮ 将
其与获得的模式菌株进行单独、联合系统发育树分
析 (图 2、 表 1 )ꎮ 供 试 菌 株 LNSY003 位 于
Diaporthe eres 种群内ꎬ与已报道的蓝莓其他种
Diaporthe vaccinii、D. ambigua、D. australafricana、
D. neotheicola (现已归入 D. foeniculacea 种群
内) [2~4]处于不同的分支ꎮ
2.4  病原菌的生物学特性
    在不同培养基、碳源、氮源、光照和温度条件的
试验结果表明:该菌适宜在 PDA培养基上生长ꎬ最
适碳源为可溶性淀粉ꎬ最适氮源为蛋白胨ꎻ喜高温ꎬ
最适温度为 27℃ꎻ对光不敏感ꎬ在 4 种光照条件下
均能正常生长ꎬ且菌落生长直径差异性不显著ꎮ
3  结论与讨论
    目前国际上对 Diaporthe / Phomopsis 属真菌
鉴定主要采用形态与分子手段相结合技术ꎬ
其中 ITS、EF1 ̄α 和 TUB 基因主要用于对该属真
菌系统发育地位的确定ꎬ以较好地区分 Diaporthe
种群ꎮ 本研究的系统发育结果与 Udayanga 等 [4]、
Gomes等 [3]相关的 Diaporthe 分类种群划分结
果基本一致ꎬ供试菌株 LNSY003 与已报道有关
Diaporthe蓝莓致病菌均不同ꎬ处于 Diaporthe eres
种群分支内ꎮ Udayanga 等[4]采用系统发育分析的
方法对Diaporthe eres种群进行了研究ꎬ将Phomo ̄
mopsis oblonga 、 Phomopsis cotoneastri 、 Phomopsis
Fig. 2  NJ tree based on combined ITSꎬ EF1 ̄α and TUB genes
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  5期 严雪瑞ꎬ等:蓝莓间座壳芽枯病病原菌鉴定及其生物学特性
Table 1  Strains and sequences used in neighbor ̄joining phylogenetic analysis
Species Strains Host
GenBank accession
ITS EF1 ̄α TUB
Diaporthe ambigua CBS114015 Pyrus communis KC343010 KC343736 KC343978
CBS117167 Aspalathus linearis KC343011 KC343737 KC343979
D. australafricana CBS111886 Vitis vinifera KC343038 KC343764 KC344006
CBS113487 Vitis vinifera KC343039 KC343765 KC344007
D. foeniculacea CBS123208 Foeniculum vulgare KC343104 KC343830 KC344072
CBS123209 Foeniculum vulgare KC343105 KC343831 KC344073
CBS187.27 Cameliia sinensis KC343107 KC343833 KC344075
D. phaseolorum CBS116019 Caperonia palustri KC343175 KC343901 KC344143
CBS116020 Aster exilis KC343176 KC343902 KC344144
D. vaccinii CBS122114 Vaccinium corymbosum KC343225 KC343951 KC344193
CBS160.32 Vaccinium corymbosum KC343228 KC343954 KC344196
D. eres AR3538 Acer campestre KC343075 KC343801 KC344043
BBAP ̄407 Cotoneaster sp. KC343090 KC 343816 KC344058
CBS116953 Pyrus pyrifolia KC343147 KC343873 KC344115
CBS587.79 Pinus pentaphylia KC343153 KC343879 KC344221
AR5193 Ulmus laevis KJ210529 KJ210550 KJ420799
AR5196 Ulmus laevis KJ210533 KJ210554 KJ420817
CBS439.82 Cotoneaster sp. FJ889450 GQ250341 JX275431
AR3672 Pyrus pyrifolia JQ807469 JQ807418 KJ420819
CBS113470 Castanea sativa KC343146 KC343872 KC344114
DNP128 Castaneae mollissimae JF957786 KJ210561 KJ420801
DNP129 Castaneae mollissimae JQ619886 KJ210560 KJ420800
LNSY003 Vaccinium corymbosum KJ867089 KJ867090 KP696757
Diaporthella corylina CBS121124 Corylus sp. KC343004 KC343730 KC343972
 
castaneae ̄mollisimae 和 Phomopsis fukushii 并 入
Diaporthe eres种群中ꎮ Diaporthe eres寄主范围广
泛ꎬ能够侵染越橘属植物ꎬ形态学特征变化较大ꎬ在
培养基和苜蓿杆上都能够形成 2 种孢子ꎬα 孢子
(6~9) μm × ( 3 ~ 4) μmꎬ β 孢子 ( 18 ~ 29) μm ×
(1~1.5)μmꎬ供试菌株 LNSY003 在形态特征上与
Diaporthe eres相近ꎮ 结合形态学和系统发育分析
将病原菌确定为 Diaporthe eresꎮ
    本文报道的 Diaporthe eres与已报道蓝莓其他
种(Diaporthe vaccinii、D. ambigua、D. australafri ̄
cana、D. neotheicola)不仅在系统发育上处于不同
分支ꎬ而且在发病症状、菌落形态、产孢特征方面也
存在明显差异ꎮ 其他 4个种群主要引起茎秆溃疡、
枝枯症状ꎬ而 LNSY003 主要引起芽枯症状ꎮ
Diaporthe vaccinii在 PDA上菌落边缘有明显的分
层环痕ꎬ而 LNSY003菌落边缘平坦ꎮ D. ambigua、
D. australafricana、D. neotheicola 和 LNSY003 在
产孢特征方面存在明显差异ꎮ 生物学特性研究结
果表明蓝莓芽枯病病菌最适培养基为 PDAꎬ最适
碳源为可溶性淀粉ꎬ最适氮源为蛋白胨ꎮ 该菌对光
照不敏感ꎬ喜高温ꎬ最适生长温度 27℃ꎮ 对该菌的
发病规律、侵染特性尚需进一步研究ꎮ
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植物病理学报 45卷
参考文献
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责任编辑:于金枝
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