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Identification of the pathogen causing twigs and stem dieback in blueberry

蓝莓枝枯病病原菌鉴定



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  43(4): 421 ̄425(2013)
收稿日期: 2012 ̄11 ̄17ꎻ 修回日期: 2013 ̄04 ̄18
基金项目: 云南省教育厅科学研究基金(2011Z032)ꎻ云南省科技厅应用基础研究(面上项目)(2011FZ180ꎻ 2011FZ178)ꎻ昆明学院科学
研究基金 (YJL11002ꎻ XJ11L004)
通讯作者: 余 磊ꎬ副教授ꎬ博士ꎬ主要从事植物病原菌分子生物学研究ꎻ E ̄mail: yuleio425@yahoo. cnꎮ
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研究简报
蓝莓枝枯病病原菌鉴定
余 磊1∗ꎬ 赵建荣1ꎬ Rarisara Impaprasert2ꎬ 徐胜光1ꎬ 吴 旭1
( 1昆明学院农学院ꎬ 云南省高校都市型现代农业工程研究中心ꎬ 昆明 650214ꎻ
2 朱拉隆功大学食品技术学院ꎬ 曼谷 10330ꎬ 泰国)
Identification of the pathogen causing twigs and stem dieback in blueberry  YU Lei1ꎬ
ZHAO Jian ̄rong1ꎬ RARISARA Impaprasert2ꎬ XU Sheng ̄guang1ꎬ WU Xu1   ( 1College of Agronomyꎬ Urban
Modern Agriculture Engineering Research Centerꎬ Kunming Universityꎬ Kunming 650214ꎬ Chinaꎻ 2Department of Food Technol ̄
ogyꎬ Chulalongkorn Universityꎬ Bangkok 10330ꎬ Thailand)
Abstract: The identification of the pathogens isolated from the stem dieback and twigs blight of Highbush
Blueberries (Vaccinium corymbosum L. ) were carried out. 29 diseased samples were observed in Kunming and
Lijiang Yunnan Province ( south ̄western China) . 29 isolates of possible pathogenic fungi were isolated from
stem and twigs of infected blueberry plants. Bases on the pathogenicity experimentꎬ the results showed that LI ̄
JIANG22 was the pathogens of Highbush Blueberries dieback disease. The morphological identification showed
that LIJIANG22 was identified as Neofusicoccum parvum. Identity was confirmed by the analysis of rDNA inter ̄
nal transcribed spacer region (ITS1 ̄5. 8S ̄ITS2) and the translation elongation factor 1 ̄alpha (EF1 ̄α) . BLAST
searches at GenBank showed a high identity with N. parvum reference sequences (ITS: >99% ꎻ EF1 ̄α: 100%
-99% ) . Representative sequences of isolates from both regions were deposited in GenBank ( ITS: Accession
No. JX096632ꎬ isolate LIJING22ꎻ JX096634ꎬ isolate LIJIANG23ꎻ EF1 ̄α: Accession No. JX096636ꎬ
JX096637) . Morphological and molecular identification confirmed this species as N. parvum. N. parvum was
first reported as the pathogen of Highbush Blueberries dieback disease in China.
Key words: Highbush Blueberriesꎻ diebackꎻ molecular identification
文章编号: 0412 ̄0914(2013)04 ̄0421 ̄05
    蓝莓 (Vaccinium spp. )ꎬ是一类属于杜鹃花科
(Ericaceae) 越橘属 (Vaccinium) 的多年生小浆果
类果树ꎬ广泛地应用于医药、保健、化妆品和环境保
护等各方面ꎬ联合国粮农组织将其果实列为人类世
界五大健康食品之一ꎬ也是我国南方酸性土丘陵地
区值得发展的经济作物ꎮ 全国已超过 10 个省份
开始大面积的蓝莓商业化栽培ꎬ预计未来 10 年将
超过 10 万 hm2 [1]ꎮ 但是ꎬ随着生产面积的不断扩
大ꎬ蓝莓病害也日趋严重ꎬ严重影响和制约蓝莓产
业的发展ꎮ 2010 年至今ꎬ在云南省昆明市周边及
丽江市蓝莓种植区发生一种病害ꎬ主要为害嫩枝、
枝条和主干ꎬ发病初期ꎬ感病枝条上产生红褐色圆
或椭圆形坏死斑ꎬ随后逐渐扩大ꎬ造成枝条干枯死
亡ꎬ并可扩展造成主干枯萎ꎮ 调查发现ꎬ该病发病
率通常在 10% ~ 20% ꎬ重者可达 25% 以上ꎬ可引
起蓝莓整株枯萎死亡ꎮ 本文通过病原菌分离、致病
 
植物病理学报 43 卷
性测定及传统、分子鉴定ꎬ明确了该病的病原ꎬ以期
为病害防治提供理论依据ꎮ
1  材料与方法
1. 1  病原菌的分离和培养
从云南省石林县、富源县和丽江市采集表现枝
枯和茎枯病症状的蓝莓病害标本 (图 1 ̄A、B、C)ꎬ
采用常规组织分离法ꎬ分别从发病植株的枝茎干的
病健交界处进行分离ꎮ 分离到的菌株经纯化后在
PDA 上进行培养和形态观察ꎮ 选取编号为 LI ̄
JIANG22 的菌株为供试菌株ꎬ将其斜面培养物置
于 0 ~ 4℃ 冰箱中保存备用ꎮ
1. 2  致病性测定
自石林县种植基地采集 2 年龄蓝莓苗 (V.
corymbosum L. )ꎬ种植在塑料盆中ꎬ每盆 1 棵苗ꎮ
用 LIJIANG22 菌株在温室内分别接种ꎬ使用灭菌
解剖刀在距离植株基部 10 cm 处ꎬ斜切 2 ~ 3 mm
深的伤口作为接种点ꎬ接入生长旺盛带 PDA 培养
基的菌块ꎬ接种点用塑料膜包裹少许湿的灭菌脱脂
棉保湿ꎬ3 d 后将包裹物取下ꎮ 重复 3 次ꎮ 接种已
灭菌 PDA 培养基块为对照ꎮ
1. 3  病原菌形态学观察
将供试菌株接种到 PDA 平板上ꎬ于 25℃ 培养
箱中培养 7 ~25 d 后ꎬ肉眼观察菌落形态特征ꎬ在光
学显微镜下观察培养病菌的分生孢子形态ꎬ并测量
其大小ꎮ 根据病原菌的产孢特征及其在 PDA 培养
基上的形态特征ꎬ参照文献[2]进行病菌鉴定ꎮ
1. 4  rDNA ITS 的 PCR 扩增与序列分析
1. 4. 1  病原菌 DNA 的提取  将供试菌株接种到
PD 培养液于 25℃ 振荡 (160 r / min) 培养 6 ~ 7 d
后收集菌丝体ꎮ 基因组 DNA 的提取和纯化采用
CTAB 方法进行ꎬ并置于 -20℃ 冰箱中保存待用ꎮ
1. 4. 2  核糖体 rDNA ̄ITS 区段扩增  PCR 反应在
ABI 2720 PCR 仪上进行ꎮ 使用 25 μL PCR 反应
体系:10 × 缓冲液 (含 15 mmol / L Mg2 + ) 2. 5 μL、
Fig. 1  Symptoms of twigs and stem dieback on blueberry
A: Twigsꎻ B: Stemꎻ C: Brown discoloration.
224
 
  4 期     余 磊ꎬ等:蓝莓枝枯病病原菌鉴定
dNTP (各 2. 5 mmol / L) 1μL、通用引物 ITS1 和
ITS4 (5 μmoL) 各 1 μL (引物: ITS1 5′ ̄TCCG ̄
TAGGTGAACCTGCGG ̄3′ ꎻ ITS4 5′ ̄TCCTCCGCT ̄
TATTGATATGC ̄3′)、Taq DNA 聚合酶(5 U / μL)
0􀆰 25 μL、模板 DNA (20ng) 1 μL、双蒸水 18. 25
μLꎮ PCR反应条件:95℃预变性 5 minꎻ95℃变性 30
sꎬ56℃退火 30 sꎬ72℃延伸 1 minꎬ共 35个循环ꎻ72℃
延伸 10 minꎮ 经 1. 2%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产
物ꎮ 在每次反应中设阴性对照(不含模板 DNA)ꎮ
1. 4. 3   EF1 ̄α 基因序列扩增   使用 50 μL PCR
反应体系[3]:10 ×缓冲液(含 15 mmol / L Mg2 + ) 5
μL、MgCl2 ( 25 mmol / L ) 2 μL、 dNTPs (各 10
mmol / L) 1 μL、引物 EF1 ̄728F 和 EF1 ̄986R(0. 5
mmol / L)各 2 μL (引物: EF1 ̄728F 5′ ̄ CATC ̄
GAGAAGTTCGAGAAGG ̄3′ꎻ EF1 ̄986R 5′ ̄TACT ̄
TGAAGGAACCCTTACC ̄3′)ꎬ Taq DNA 聚合酶
(5 U / μL) 0. 25 μLꎬ模板 DNA (20 ng) 2 μLꎬ双
蒸水 35. 75 μLꎮ PCR 反应条件:95℃预变性 3
minꎻ95℃变性 30 sꎬ55℃退火 30 sꎬ72℃延伸 60 sꎬ
共 35 个循环ꎻ最后 72℃延伸 5 minꎮ 经 1. 2%琼脂
糖凝胶电泳检测 PCR产物ꎮ 在每次反应中设阴性
对照(不含模板 DNA)ꎮ
1. 4. 4  PCR 扩增产物测序和序列分析   将 PCR
扩增产物经 DNA纯化试剂盒进行纯化回收后ꎬ送
上海生工进行正反双向测序ꎮ 将测序结果在
http: / / www. ncbi. nlm. nih. gov 网站上利用
BLAST 下的 nucleotide ̄nucleotide blastn 与 Gen ̄
Bank上已经发表的基因进行同源性对比ꎻ测序结
果之间的多重比较在 DNAMAN软件上进行ꎮ
2  结果与分析
2. 1  病原菌的分离结果与形态特征观察
采回的 29 份蓝莓枝枯病样共分离获得 29 株
菌株ꎬ根据菌落特征发现各菌株没有明显差异ꎬ为
同一种类型的真菌ꎮ 菌株 LIJIANG22 在 PDA 上
26℃培养 5 d的菌落直径为 75. 5 mm ~ 80. 6 mmꎬ
菌丝生长迅速ꎬ气生菌丝发达ꎬ初期基质、菌丝和气
生菌丝均为白色(图 2 ̄A)ꎬ5 ~ 6 d气生菌丝变为灰
黑色ꎬ21 d产生黑色子实体(分生孢子器)ꎬ呈梨形
或球形ꎬ直径为 245. 6 μm ~ 418. 2 μmꎬ平均为
289. 3 μmꎮ 成熟的分生孢子为单细胞ꎬ无隔ꎬ近椭
圆形至纺锤形ꎬ薄壁半透明ꎬ大小为(12. 5 ~ 21. 5)
μm × (4. 6 ~ 7. 0) μmꎬ平均 17. 3 μmꎮ 根据病原
菌的培养性状和形态学特征ꎬ参照真菌分类相关文
献[5]的描述ꎬ初步鉴定该病原菌为小新壳梭孢
(Neofusicoccum parvum)ꎮ
2. 2  致病性测定
接种后 4 d即可看到有病斑扩展ꎬ10 d 后接种
枝条出现木质部变色及枯萎症状(图 2 ̄B)ꎮ 对接
种发病后的枯萎植株再次进行病菌的分离ꎬ均能获
得与原分离菌株一致的病原菌ꎮ 对照接种未表现
出任何发病症状ꎬ也未分离出任何真菌ꎮ 根据柯赫
氏法则ꎬ证明接种菌株 LIJIANG22 为蓝莓的致病
菌ꎮ
2. 3  序列分析
经 ITS1 和 ITS4 引物对 rDNA ̄ITS 序列ꎬ以及
引物 EF1 ̄728F和 EF1 ̄986R 对 EF1 ̄α 基因序列扩
增ꎬ从 LIJIANG22菌株基因组中分别扩增获得 545 bp
Fig. 2  Morphology of the pathogen (A) and shoot blight symptoms at blueberry
seedling following inoculation with Neofusicoccum parvum (B)
324
 
植物病理学报 43 卷
Fig. 3  Phylogenetic tree of 18S rDNA ̄ITS sequences of pathogen strains and related species
和 402 bp 的序列ꎬ分别将序列提交至 GenBank
( ITS: Accession No. JX096632ꎻ EF1 ̄α: Acces ̄
sion No. JX096636)ꎬ并在 GenBank中进行序列一
致性比较ꎮ 结果表明ꎬ供试菌株 ITS 序列与 N.
parvum的同源性为 99% ꎻEF1 ̄α序列与 N. parvum
的一致性为 100% ~ 99% ꎮ
利用 DNAMAN 软件以 rDNA  ̄ITS 和 EF1 ̄α
序列聚类分析结果均表明ꎬ供试菌株与 N. Parvum
聚为同一个分支ꎬ进化距离最近(图 3)ꎮ 根据病原
菌的形态特征、rDNA ̄ITS、EF1 ̄α 序列同源性比较
及致病性测试结果ꎬ鉴定该病原菌为小新壳梭孢
(N. parvum)ꎮ
3  结论与讨论
本研究通过病菌培养、致病性测定、形态特征
观察、18S rDNA ITS、EF1 ̄α序列分析ꎬ鉴定了引起
蓝莓枝枯病的病原菌为小新壳梭孢 N. Parvum
(Pennycook & Samuels) Crousꎬ Slippers & A. J. L
Phillips (2006)ꎬ是子囊菌葡萄座腔菌科 Botryo ̄
sphaeriaceae的一种无性型菌物ꎬ为林木和果树常
见的病原真菌ꎮ N. parvum和 N. ribis在形态上非
常相似ꎬ仅通过 ITS 序列不能很好地将两者区别
开ꎬ因此本文选用同时扩增 ITS和 EF1 ̄α序列作为
准确鉴定该供试菌株的分子依据ꎮ
近年蓝莓(Vaccinium spp. ) 作为一种新兴小
浆果果树在我国大量种植ꎬ是南方酸性土丘陵地区
值得发展的经济作物ꎮ 据报道 N. Parvum 是智利
(Chile) 蓝莓商业种植过程中一种重要病原菌ꎬ所
引起的蓝莓枝条枯萎、溃疡ꎬ以及其他病原物引起
的病害发生率达 15% ~ 45% ꎮ 该病原菌也造成阿
根廷(Argentina)蓝莓种植业的较大损失[4]ꎮ 我国
关于蓝莓病虫害方面的研究报道较少ꎮ Xu 等[5]
报道辽宁地区一种引起蓝莓枝干溃疡病的病原菌
为 Botryosphaeria dothideaꎬ主要为害 2 ~ 3 年生幼
树主干及侧枝ꎮ 作者在云南蓝莓种植园中调查发
现ꎬ N. Parvum主要为害嫩枝、枝条和主干ꎬ并可
造成整株枯萎死亡ꎬ 1 年及多年生植株发病情况
也较为严重(图 1 ̄B)ꎬ这与 B. dothidea 引起的症
状有所区别ꎮ 造成蓝莓枯萎死亡的病害在一些蓝
莓商业化种植基地有危害加重趋势ꎬ需引起生产部
门的重视ꎬ有必要开展蓝莓病害发生规律及防治措
施的深入研究ꎮ
参考文献
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  4 期     余 磊ꎬ等:蓝莓枝枯病病原菌鉴定
[M] . Beijing: China Agriculture Press (北京: 中国
农业出版社)ꎬ 2001. 441 -442.
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理学报)ꎬ 2012ꎬ 42(5): 532 -535.
责任编辑:于金枝
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