全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$中国烟草总公司特色优质烟叶开发重大专项浓香型项目"
0.("#
#
作者简介$刘维智"
#12+
#!男!在读硕士研究生!主要从事烟草营养分子遗传的研究
3(45-6
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通信作者$刘国顺!教授!博士生导师!主要从事烟草生理生化研究
3(45-6
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缺氮及氮素形态对烟草幼苗
糖代谢的影响机理初探
刘维智!贾宏窻!尹贵宁!时向东!刘国顺"
"河南农业大学 烟草学院!烟草行业烟草栽培重点实验室!郑州
$&"""!
#
摘
!
要$为了探明缺氮及不同氮素形态对烟草幼苗糖代谢的影响机理该试验以(中烟
#""
)为试材!设置正常供氮
为对照"
@A
!
BC
%

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$
F
G#D#
#*缺氮"
0
#
#*单一铵态氮"
0
!
#和单一硝态氮"
0
%
#
$
个处理的沙培试验!检测烟株
功能叶片的全氮*还原糖*总糖*蔗糖淀粉的含量及糖代谢相关酶的活性!并分析根*茎*叶等
%
个部位糖代谢关键
基因"
!"##
*
$%&
*
(!!$
*
)*+,-
#的表达差异结果显示$"
#
#烟株功能叶片的全氮含量表现为
0
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#
@A
#
0
!
#
0
#
"
!
#与
@A
前期相比!
0
#
处理显著增加了烟株叶片的还原糖*总糖*蔗糖及淀粉含量!降低了淀粉酶的活性!但
对转化酶活性影响不显著&其中烟株叶片淀粉积累表现为
0
#
#
0
!
#
@A
#
0
%
"
%
#缺氮及氮素形态对糖转运蛋白
基因"
!"##
#*焦磷酸化酶基因"
)*+,-
#和颗粒淀粉合成酶基因"
(!!$
#等关键基因的表达影响显著研究认
为!缺氮及不同氮素形态下烟草幼苗氮素利用率与淀粉积累成反比!其中蔗糖转运蛋白基因"
!"##
#在氮素形态影
响烟叶糖代谢过程中起关键作用
关键词$烟草&氮素形态&糖代谢&基因表达
中图分类号$
H1$&*+2
文献标志码$
I
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+
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Z
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!!
氮素是植物生长发育所必需的三大营养元素之
一!广泛参与植物体内的生化合成*能量转移*信号
转导等代谢过程!对促进烟草生长发育和新陈代谢
起着重要作用+#(!,土壤中的氮素主要以无机硝态
氮"
BC
%

#和铵态氮"
BE
$
F
#的形态被植物根系细
胞膜上的氮转运蛋白吸收和运输到体内!不同形态
的氮素与烤烟产量和品质的形成密切关系+#,烤烟
叶片中的糖代谢产物主要有总糖*还原糖和淀粉!这
%
种物质的含量对烤烟的品质影响显著与糖代谢
密切相关的基因有蔗糖转运蛋白基因"
!"#
#*蔗糖
转化酶基因"
$%&
#*焦磷酸化酶基因"
)*+,-
#和颗
粒淀粉合成酶基因"
(!!$
#等+%,前人在拟南芥*
大豆和玉米上的研究表明氮肥可以调控糖代谢途
径+$,!因此探讨缺氮及氮素形态对烤烟糖代谢途径
的影响机理!对改善烤烟品质及提高烤烟的氮素利
用率具有重要价值+&,目前关于烟草氮素营养方面
的研究主要集中在产量和品质上!而对烟草氮素营
养影响糖代谢机理方面的研究还鲜有报道+),本试
验主要研究氮素对烟叶糖代谢产物积累及相关基因
表达的影响!旨在探索氮素对烟叶糖代谢产物积累
的响应机理!为进一步调控氮肥施用*提高烟叶品质
提供理论依据
#
!
材料和方法
=*=
!
供试材料
供试烤烟品种为(中烟
#""
)!种子由北方烟草
育种中心提供
=*>
!
试验设计与处理
沙培试验于
!"#!
年在河南农业大学科教园区
进行!人工气候室内生长!基本条件$光强
%""
"
4;6
-
4
!
-
.
#
!光周期
#)>
!温度
!&^
烟草种子消毒
后在无菌水中黑暗催芽!露白后供给
#
%
$
营养液至
$
片真叶完全展开!然后进行营养处理+,试验设
置正常供氮处理"
@A
#*缺氮处理"
0
#
#*单一铵态氮
BE
$
F
"
0
!
#和单一硝态氮
BC
%

"
0
%
#共
$
个处理
"表
#
#!处理时间为
%
周!每个处理设置
#"
次重复
=*?
!
样品采集
每个处理均选择
&
株长势一致的烟株!分别采
集根*茎和叶等
%
个部位样品!其中叶片采集完全展
开的功能叶片"从上往下数第
$
片叶#迅速置于液
氮中!于
2"^
冰箱冻存!用于基因表达分析其
余试验所涉及到的叶片生理指标测定均为采集的烟
株功能叶片"从上往下数第
$
片叶#
=*@
!
单株生物量统计及功能叶片表型观察
每个处理均选择
&
株长势一致的烟株!清洗干
净根部!在分析天平上整株称重!做好记录同时!
采集完全展开的功能叶片"从上往下数第
$
片叶#!
用尼康
_+"""
进行拍照
=*A
!
测定指标与方法
=*A*=
!
还原糖*总糖*淀粉及全氮含量+2,
!
取
"*&
=
新鲜烟叶!去主脉!采用德国
S:56II
流动分析仪
测定含量
=*A*>
!
蔗糖含量+1,
!
取
"*&
=
叶片加入
&4J
蒸馏
水研磨为匀浆!
$"""?
%
4-/
离心
#"4-/
&取上清液
采用蒽酮法测定蔗糖含量
=*A*?
!
酶活性
!
将
"*!
=
叶片放入
24J#` B5@6
中研磨为匀浆后
%"""?
%
4-/
!离心
#"4-/
&参照
T<:
等+#",的方法测定转化酶活性!参照
_;:>6:?7
等+##,的方法测定淀粉酶活性
=*A*@
!
基因表达分析
!
采用
0?-N;6
法提取烟草
根*茎和叶
%
个部位的总
aBI
!样品通过随机引物
法反转录合成
8_BI
根据
R:/b5/发布的蔗糖转
运蛋白基因"
!"##
#*蔗糖转化酶基因"
$%&
#*焦磷
酸化酶基因"
)*+,-
#和颗粒淀粉合成酶基因"
(.
!!$
#的序列设计各基因扩增引物"表
!
#!进行荧光
实时定量
c@a
分析按照
K/V-7?;
=
:/
公司的
a:56(
[5.7:?[-]
"
SQbaR?::/
#试剂盒说明书进行实时
定量
a0(c@a
!每个样品
%
次重复实时定量的实
表
=
!
试验处理方案
05U6:#
!
0:.77?:574:/7
Z
?;
=
?54
"
44;6
%
J
#
处理
0?:574:/7
BE
$
BC
%
AE
!
cC
$
A
!
SC
$
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=
SC
$
-
+E
!
C @5@6
!
-
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!
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$
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"
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#
!
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"
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#
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-
$E
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C [
=
"
BC
%
#
!
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0
#
" # # "*+& # " " " "
0
!
" # # "*+& # "*& # " "
0
%
" # # "*!& "*!& " " "*+& "*&
#%&
%
期
!!!!!!!!!!!
刘维智!等$缺氮及氮素形态对烟草幼苗糖代谢的影响机理初探
表
>
!
烟草糖代谢途径及营养元素转运蛋白
基因荧光定量
$BC
引物序列
05U6:!
!
0;U588;
=
6<8;.:4:75U;6-8
Z
57>Y5
W
.
d
<5/7-757-V:
c@a
Z
?-4:?.:
d
<:/8:;P/<7?-:/7.7?5/.
Z
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=
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名称
B54:
序列号
S:?-:./<4U:?
引物序列"
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%
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#
c?-4:?.:
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&e
%
%e
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!"## f[#)$)$"
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$
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a
$
I@@R0I@I@00@@00IR@
$%& IO%"&"$$*!
f
$
@0@@I@RI@@@I00I@I@
&
a
$
RRIII@0@@@0RIRI0I@I
)*+,- _H%111#&
f
$
@R0RI0IIR00@@@00R0RR
&
a
$
0@I@I00R0@@@@0I0I@RR
(!!$ _H")1!+"*#
f
$
RR0IRRIIII0@II@0RR0R@
&
a
$
0I0@@I0R@@I00@I@II0@@
/!& J#21"!
f
$
R@000@00@R0@@@I0@I
&
a
$
@@@@IIR0I@@@0@R0I0
验数据采用
!

##
01算法+#!,进行分析!假设目的基因
在胁迫处理下的表达量是对照"正常培养#的
%
倍!
%G!

##
01
!
##
01G
处理"
01
样品
01/!&
#
@A
"
01
样品
01/!&
#
=*D
!
数据处理
采用
S-
=
4
Z
6;7#"*"
和
ScSS#!*"
进行数据处
理和统计分析
!
!
结果与分析
>*=
!
缺氮及不同氮素形态下烟草幼苗功能叶片表
型*单株生物量及全氮含量分析
在烟株经过缺氮及不同氮素形态处理
%
周后!
对烟株功能叶片表型观察"图
#
!
I
#发现!缺氮"
0
#
#
阻碍了烟株的正常生长!烟叶表现出发黄等缺氮症
状!铵态氮处理"
0
!
#叶片表型和正常供氮处理"
@A
#
表型基本一致!而硝态氮处理"
0
%
#叶片明显大于其
余
%
个处理!叶片颜色也比较深单株生物量统计
"图
#
!
b
#表明!
0
#
*
0
!
和
0
%
处理
%
周后生物量分别
是对照
@A
的
1&*#&`
*
#""*!&`
和
#"$*#!`
!且均
与对照差异显著"
*
$
"*"&
#
$
个处理植株之间的
叶片全氮含量均达到了显著差异水平"
*
$
"*"&
#!
并表现为
0
%
#
@A
#
0
!
#
0
#
"图
#
!
@
#!这与上述
$
个处理叶片表型表现相一致以上结果说明缺氮及
不同氮素形态下烟株的氮素利用率不同!从而影响
了烟草幼苗的正常生长发育
>*>
!
缺氮及不同氮素形态对烟草幼苗叶片还原糖*
总糖*蔗糖及淀粉含量的影响
在烟株经过缺氮及不同氮素形态处理
%
周后!
对烟草幼苗叶片还原糖*总糖*蔗糖及淀粉含量进行
检测图
!
!
I
$
_
结果显示!与
@A
相比!
0
#
$
0
%
处理烟株叶片还原糖含量分别显著提高了
#&2*&#`
*
图
#
!
缺氮及不同氮素形态下烟草幼苗功能
叶片表型*单株生物量及全氮含量分析
@A
*
0
#
*
0
!
*
0
%
分别表示正常供氮*缺氮*铵态氮和硝态氮处理&
不同小写字母表示处理间存在显著差异"
*
$
"*"&
#&下同
f-
=
*#
!
c>:/;7
WZ
:5/97;756B8;/7:/7;P7;U588;/-7?;
=
:/5/99-PP:?:/7P;?4.;P/-7?;
=
:/P;?4.5/9U-;45..
@A
!
0
#
!
0
!
!
0
%
.75/9P;?7>:/;?456.<
ZZ
6
W
;P/-7?;
=
:/
"
BC
%

DBE
$
F
G#D#
#!
/-7?;
=
:/9:P-8-:/8
W
!
.-/
=
6:544;/-<4
5/9.-/
=
6:/-7?57:7?:574:/7.
!
?:.
Z
:87-V:6
W
&
0>:/;?4566:77:?.
-/9-857:.-
=
/-P-85/79-PP:?:/8:54;/
=
7?:574:/7.
57"*"&6:V:6
&
0>:.54:5.U:6;Y
1"*$2`
和
!+*21`
!总糖含量分别显著提高了
!&#*
)#`
*
#!&*)&`
和
)2*&1`
!蔗糖含量则分别显著提
高了
%1*$1`
*
$)*1#`
和
#)*%+`
"
*
$
"*"&
#&它们
的淀粉含量在
0
#
处理下比
@A
显著提高
$%*%#`
!
在
0
!
处理下与
@A
相近!在
0
%
处理下反比
@A
显
著降低
!!*2+`
整体来看!
$
个处理中缺氮处理叶
片中糖物质含量最高!铵态氮和硝态氮次之!正常供
氮处理最低!这说明缺氮及不同氮素形态显著影响
着烟株幼苗的糖代谢物质积累尤其是缺氮处理淀
粉含量最高!而硝态氮处理淀粉含量最低!推测是由
于烟草喜硝态氮!在利用硝态氮的同时需要相应地
消耗糖类"酮酸*烯酸#!使叶鞘内贮藏的淀粉减少!
这符合烟株幼苗期.得氮耗糖/的规律
>*?
!
缺氮及不同氮素形态对烟草幼苗叶片糖代谢
途径关键基因表达的影响
大量的研究表明!蔗糖和淀粉的合成与蔗糖
转运蛋白"
SL0#
#*转化酶"
KBg
#*颗粒淀粉合成酶
!%&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
"RbSSK
#和
I_cR
焦磷酸化酶"
IRc5.:
#的活性或
基因表达量密切相关+#",利用荧光定量
c@a
技术
对不同氮素形态烟草糖代谢相关基因进行转录水平
的表达分析结果"图
%
#显示!蔗糖转运蛋白基因
"
!"##
#在幼苗根*茎*叶等
%
个部位表达量均以铵
态氮处理"
0
!
#最高!并均显著高于其他
%
个处理"
*
$
"*"&
#!如
0
!
处理根部*茎部和叶部表达量分别
是对照"
@A
#的
%*&#
倍*
+*&2
倍和
#*%)
倍!而各部
位
0
#
和
0
%
处理表达量均低于相应对照!其中
0
%
处理根部和叶片基因表达量仅有对照的
$"*#)`
和
%)*#+`
"图
%
!
I
#&蔗糖转化酶基因"
$%&
#于幼苗
根*茎*叶中表达量在
@A
和
0
#
处理中均无显著差
图
!
!
缺氮及不同氮素形态下烟草还原糖*总糖*蔗糖及淀粉含量分析
f-
=
*!
!
I/56
W
.-.;P7;U588;=
:/5/99-PP:?:/7P;?4.;P/-7?;
=
:/?:9<8-/
=
.<
=
5?
!
7;756.<
=
5?
!
.<8?;.:5/9.75?8>8;/7:/7.
图
%
!
缺氮及不同氮素形态下烟株不同部位糖代谢关键基因的
H(c@a
分析
%
*
根&
&
*
茎&

*
叶
f-
=
*%
!
I/56
W
.-.;P7;U588;=
:/5/99-PP:?:/7P;?4.;P/-7?;
=
:/-/
9-PP:?:/7
Z
5?7.;P
=
6<8;.:4:75U;6-.4\:
W=
:/::]
Z
?:..-;/
%
*a;;7
&
&
*S7:4
&

*J:5P
%%&
%
期
!!!!!!!!!!!
刘维智!等$缺氮及氮素形态对烟草幼苗糖代谢的影响机理初探
图
$
!
缺氮及不同氮素形态下烟株叶片糖代谢途径关键酶活性的分析
f-
=
*$
!
I/56
W
.-.;P6:5P.<
=
5?4:75U;6-8\:
WZ
57>Y5
W
.;P7;U588;
Z
65/7=
:/P;?4.
异!在单一氮素形态"
0
!
和
0
%
处理#下根部和茎中转
化酶基因表达量略有提高!而叶片中转化酶基因表达
量却略有降低"图
%
!
b
#&颗粒淀粉合成酶关键基因
(!!$
表达量在烟草幼苗根部表现为缺氮处理
"
0
#
#*铵态氮处理"
0
!
#和硝态氮处理"
0
%
#下显著高
于正常供氮烟株"
@A
#!在茎中差异不显著!而在叶片
中以缺氮处理"
0
#
#最高!比对照提高了
$!*+#`
!硝态
氮处理"
0
%
#最低!仅有对照的
$)*##`
"图
%
!
@
#&
).
*+,-
基因表达量在幼苗根部以铵态氮处理"
0
!
#最
高!正常供氮处理"
@A
#最低!其在茎中的表达量仍
以铵态氮处理"
0
!
#最高!而在叶片中的表达水平表
现为正常供氮处理"
@A
#显著高于"
*
$
"*"&
#其他
%
个处理"图
%
!
_
#结果说明不同氮素形态从糖代谢
关键基因转录水平上影响着烟株幼苗的糖代谢过
程!其中蔗糖转运蛋白基因"
!"##
#在铵态氮素影
响烟草糖代谢途径中起关键作用
>*@
!
缺氮及不同氮素形态对烟草幼苗叶片糖代谢
途径关键酶活的影响
在烟株经过低氮及不同氮素形态处理
%
周后!
对糖代谢关键酶转化酶和淀粉酶活性进行检测!结
果如图
$
所示由图
$
!
I
可以看出!
$
个处理中烟
草幼苗叶片转化酶活性差异不显著!这与上述检测
的转化酶基因"
$%&
#表达结果相一致"图
%
!
b
#&由
图
$
!
b
可以看出!幼苗叶片淀粉酶活性在缺氮处理
"
0
#
#*铵态氮处理"
0
!
#和硝态氮处理"
0
%
#中均显著
低于正常供氮"
@A
#"
*
$
"*"&
#!分别只达到正常供
氮处理"
@A
#的
$#*1)`
*
&&*&1`
和
)"*1)`
以上
结果说明淀粉酶活性在缺氮及不同氮素影响烟草幼
苗糖代谢过程中起更重要作用
%
!
讨
!
论
大量的研究表明烟草叶片中碳水化合物的含量
受到光照*干旱*海拔高度等生态环境因素的影
响+#%(#&,土壤供氮量及氮素形态对烟叶品质影响较
大!但是目前关于氮素用量及不同氮素形态对烟草
碳水化合物的影响机制还未有报道本试验对缺氮
及不同氮素形态下烟草植株功能叶片蔗糖与淀粉合
成相关基因的表达水平*酶活性*总糖含量*还原糖
及淀粉含量进行研究分析!发现缺氮及不同氮素形
态对烟叶糖代谢途径影响显著!淀粉积累量表现为
缺氮"
0
#
#
#
铵态氮"
0
!
#
#
正常供氮"
@A
#
#
硝态氮
"
0
%
#!进一步从分子水平分析糖代谢途径关键基因
的表达情况表明!蔗糖转运蛋白基因"
!"##
#各部
位表达量在铵态氮处理中显著高于其他处理
蔗糖是高等植物光合产物运输的主要形式!研
究表明!
"#
家族成员在蔗糖长距离运输中的重要
作用+#),!
bh?\6:
等+#+,通过抑制烟草的
!"#
表达而
导致维管束中蔗糖含量降低!开花延迟本研究表
明!给烟草幼苗供应单一铵态氮"
0
!
#显著增加了
根*茎*叶等
%
个部位蔗糖转运蛋白基因的表达!这
预示着铵态氮可能通过改变蔗糖转运蛋白的活性来
影响糖代谢物质的流向!这与试验中检测到铵态氮
处理叶片中蔗糖含量最高的结果相一致本研究表
明!单一铵态氮"
0
!
#对烟草叶片糖代谢途径的影响
可能主要依赖于蔗糖转运蛋白"
SL0#
#另外!本
研究还发现缺氮处理烟草幼苗叶片中蔗糖含量也很
高!这可能是由于该处理处于缺氮胁迫下!氮素吸收
量少!因此糖消耗量较少!造成了蔗糖的积累!这和
前人报道的.得氮耗糖/规律相一致+#2,
对植物体内淀粉合成代谢的研究表明!转化酶
基因"
$%&
#和焦磷酸化酶基因"
)*+,-
#
!
个基因
的表达及酶活性大小意味着功能叶片中内含物积累
的状况+#1(!",本研究发现!缺氮处理和
!
个单一氮
素形态处理"
0
!
*
0
%
#烟草幼苗叶片焦磷酸化酶基因
"
)*+,-
#的表达量均显著低于正常供氮处理!而转
化酶基因"
$%&
#表达量在
$
个处理中差异不显著!
表明
)*+,-
基因在糖代谢淀粉合成中起关键作
用推测在缺氮条件下!虽然烟草叶片
)*+,-
基
因的表达量低于正常供氮!但是由于该处理处于氮
素营养胁迫状态!耗糖量少!淀粉分解较少!这与本
$%&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
试验中得到的缺氮处理下淀粉酶活性最低的结果相
一致!所以缺氮条件下叶片中淀粉含量仍显著高于
正常供氮&根据
)*+,-
基因在幼苗组织中的表达
情况!推测硝态氮处理幼苗淀粉合成能力大于铵态
氮处理!但是由于烟草对不同形态氮素的利用率不
同!导致消耗的淀粉也不相同!表现在淀粉酶活性上
是硝态氮处理大于铵态氮处理因此!最终
$
个处
理中幼苗叶片淀粉积累量表现为缺氮"
0
#
#
#
铵态
氮"
0
!
#
#
正常供氮"
@A
#
#
硝态氮"
0
%
#同时!
$
个
处理幼苗叶片的全氮含量也表现为硝态氮"
0
%
#
#
正常供氮"
@A
#
#
铵态氮"
0
!
#
#
缺氮"
0
#
#!符合植
物的碳氮平衡规律
颗粒淀粉合成酶"
RbSSK
#紧密结合在淀粉粒
上!能通过
5(#
!
$(_(
糖苷键将
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中的葡萄糖残
基加到引物的非还原端!形成线性大分子+!#,本试
验对颗粒淀粉合成酶基因"
(!!$
#的表达检测结
果表明!缺氮处理叶片的
(!!$
基因表达量显著
高于其他处理!即
(!!$
基因在
0
#
处理烟叶中活
跃表达!说明氮营养胁迫处理烟叶中直链淀粉含量
可能较高!当然这还需要进一步的验证
综上所述!本研究结果表明!烟草幼苗对不同氮
素形态的利用率与淀粉积累呈反比!与前人.得氮耗
糖/结论相一致!且烟草幼苗对硝态氮的利用率最
高&糖代谢途径基因表达分析表明!蔗糖转运蛋白基
因"
!"##
#可能在铵态氮素影响烟草糖代谢途径中
起关键作用!这为调控不同氮素形态配比提高烟草
氮素利用率及改善烟叶品质奠定了理论基础
参考文献!
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