全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(３): ２９５￣３０１(２０１４)
Ｒｅｃｅｉｖｅｄ ｄａｔｅ: ２０１３￣０１￣０７ꎻ Ｒｅｖｉｓｅｄ ｄａｔｅ: ２０１３￣０９￣２４
Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｉｔｅｍ: Ｃｈａｎｇ￣ｊｉａｎｇ Ｓｃｈｏｌａｒｓ ａｎｄ Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｔｅａｍ ｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (ＰＣＳＩＲＴꎬ ＩＲＴ０９７６)ꎬ ＭＯＡｓ Ｓｐｅｃｉａｌ Ｆｕｎｄ ｆｏｒ Ａｇｒｏ￣Ｓｃｉｅｎ￣
ｔｉｆｉｃ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｕｂｌｉｃ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ (２０１２０３０７６)ꎬ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｎａｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｉｎａ (３０６００４１９)ꎬ ａｎｄ ｔｈｅ
Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｆｕｎｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｅｎｔｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｉｅｓ (ＸＤＪＫ２００９Ｃ１３３) .
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ ａｕｔｈｏｒ: Ｚｈｏｕ Ｃｈａｎｇ￣ｙｏｎｇꎬ Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒꎬ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｈｏｕｃｙ＠ｓｗｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
Ｆｉｒｓｔ Ａｕｔｈｏｒ: Ｌｉｕ Ｊｉｎ￣ｘｉａｎｇꎬ ｆｅｍａｌｅꎬＡｓｓｏｃｉａｔｅ ｐｒｏｆｅｓｓｏｒꎬ Ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｌａｎｔ ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎻ Ｔｅｌ:０２３￣６８３４９３３８ꎬ Ｅ￣ｍａｉｌ: Ｌｊｉｎｘｉａｎｇ＠１２６.ｃｏｍ.
Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ａｎｄ Ｒａｐｉｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｏｕｒ
Ｉｍｐｏｒｔａｎｔ Ｇｒａｆｔ￣ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ
Ｃｉｔｒｕｓ ｂｙ Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ
　 ＬＩＵ Ｊｉｎ￣ｘｉａｎｇꎬ ＺＨＯＵ Ｃｈａｎｇ￣ｙｏｎｇ∗ꎬ ＴＡＮＧ Ｋｅ￣ｚｈｉꎬ ＬＩ Ｌｉｎｇ￣ｄｉꎬ
ＬＩＵ Ｋｅ￣ｈｏｎｇꎬ ＴＩＡＮ Ｘｉａｏꎬ ＬＩ Ｚｈｏｎｇ￣ａｎ
(Ｃｉｔｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｓｏｕｔｈｗｅｓｔ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎻ Ｃｉｔｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ４００７１２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ (ＣＴＶ)ꎬ Ｃｉｔｒｕｓ ｔａｔｔｅｒ ｌｅａｆ ｖｉｒｕｓ (ＣＴＬＶ)ꎬ Ｃｉｔｒｕｓ ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ ｖｉｒｏｉｄ (ＣＥＶｄ)ꎬ ａｎｄ
Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ (Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓ) ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ (ＨＬＢ) ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｇｒａｆｔ￣
ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ. Ａ ｒａｐｉｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｗｉｔｈ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｃｉｔｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｉｍｅｓａｖｉｎｇ ｔｗｏ￣ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｉｎｇ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ. Ｔｈｅ ａｓｓａｙ ｗａｓ
ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｏｓｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｆｉｅｌｄ￣ｇｒｏｗｎ ｔｒｅｅｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ ８９.３％ꎬ １０.７％ꎬ １７.９％
ａｎｄ ２８.６％ ｏｆ ｔｈｅ ２８ ｆｉｅｌｄ￣ｇｒｏｗｎ ｃｉｔｒｕｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＴＶꎬ ＣＴＬＶꎬ ＣＥＶｄ ａｎｄ Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓꎬ ｒｅ￣
ｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙꎬ ａｎｄ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ｈａｌｆ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ
ａｂｓｅｎｃｅ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐ ｇｒａｆｔｅｄ ｂｕｄｌｉｎｇｓ ｗａｓ ｅｖａｌｕａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓꎻ Ｃｉｔｒｕｓ ｔａｔｔｅｒ ｌｅａｆ ｖｉｒｕｓꎻ Ｃｉｔｒｕｓ ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ ｖｉｒｏｉｄꎻ Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ
ａｓｉａｔｉｃｕｓꎻ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ
应用多重 ＰＣＲ技术同步检测柑橘 ４种重要嫁接传播病原　 刘金香ꎬ 周常勇∗ꎬ 唐科志ꎬ 李玲娣ꎬ
刘科宏ꎬ 田 晓ꎬ 李中安　 (西南大学柑橘研究所ꎬ 中国农业科学院柑橘研究所ꎬ重庆 ４００７１２)
摘要:柑橘衰退病毒(Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓꎬＣＴＶ)ꎬ柑橘碎叶病毒(Ｃｉｔｒｕｓ ｔａｔｔｅｒ￣ｌｅａｆ ｖｉｒｕｓꎬＣＴＬＶ)ꎬ柑橘裂皮病类病毒(Ｃｉｔｒｕｓ
ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ ｖｉｒｏｉｄꎬＣＥＶｄ)和柑橘黄龙病(Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇꎬ ＨＬＢ)亚洲种病原(Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ ｌｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ)是重要的柑橘嫁
接传播病原ꎮ 本文建立了同时检测 ＨＬＢ病菌、ＣＴＶ、ＣＥＶｄ 和 ＣＴＬＶ ４种柑橘嫁接病原的一步法、双温多重 ＰＣＲ 检测技术
体系ꎬ同时在体系中设置内参基因ꎮ 应用该体系快速评价了 ４ 种嫁接传播病原在田间侵染情况ꎬ结果表明 ２８ 个田间样品
ＣＴＶ、ＣＥＶｄ、ＣＴＬＶ和 ＨＬＢ感染率分别为 ８９.３ ％、１７.９ ％、１０.７ ％和 ２８.６ ％ꎬ接近半数样品为混合感染ꎮ 并且将该方法应用
于快速评价茎尖嫁接苗病毒的脱除情况ꎮ
关键词:柑橘衰退病毒ꎻ 柑橘碎叶病毒ꎻ 柑橘裂皮病类病毒ꎻ 柑橘黄龙病菌ꎻ 多重 ＰＣＲ
中图分类号: Ｓ４３２.４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０３￣０２９５￣０７
　 　 Ｃｉｔｒｕｓꎬ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｗｉｄｅｌｙ ｇｒｏｗｎ ｆｒｕｉｔ
ｃｒｏｐｓ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅꎬ ｉｓ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｇｒａｆｔ￣ｔｒａｎｓｍｉｓ￣
ｓｉｂｌｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｂｙ ｇｒａｆｔｉｎｇ [１] . Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ
(ＣＴＶ)ꎬ Ｃｉｔｒｕｓ ｔａｔｔｅｒ ｌｅａｆ ｖｉｒｕｓ (ＣＴＬＶ)ꎬ Ｃｉｔｒｕｓ
　
植物病理学报 ４４卷
ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ ｖｉｒｏｉｄ (ＣＥＶｄ)ꎬ ａｎｄ Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉ￣
ｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ ( Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓ) ａｒｅ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｇｒａｆｔ￣ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ｃａ.
Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓꎬ ａ ｐｈｌｏｅｍ￣ｌｉｍｉｔｅｄ ｂａｃｔｅｒｉｕｍꎬ ｉｓ ａｓｓｏｃｉ￣
ａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ (ＨＬＢ) . Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｉｎｆｅｃ￣
ｔｉｏｎｓ ｏｆ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅ ｇｒａｆｔ￣ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ
ｏｆｔｅｎ ｏｃｃｕｒ ｉｎ ｆｉｅｌｄ ｔｒｅｅｓ. Ｔｈｕｓꎬ ｉｔ ｉｓ ｏｆ ｇｒｅａｔ ｉｍｐｏｒ￣
ｔａｎｃｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅｓｅ ｆｏｕｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｃｉｔｒｕｓ ｓｉｍｕｌｔａ￣
ｎｅｏｕｓｌｙ ａｎｄ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔｌｙ.
　 　 Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｄｅｘｉｎｇ ｉｓ ａ ｃｌａｓｓｉｃ ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ[２] .
Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｉｔ ｉｓ ｔｉｍｅ￣ｃｏｎｓｕｍｉｎｇ ａｎｄ ｒｅｑｕｉｒｅｓ
ｓｐｅｃｉａｌｉｚｅｄ ｆａｃｉｌｉｔｉｅｓꎬ ｓｕｃｈ ａｓ ａ ｇｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ｏｒ
ｓｃｒｅｅｎｈｏｕｓｅ. Ｔｈｅ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ (ＰＣＲ)
ｉｓ ａ ｐｏｗｅｒｆｕｌ ａｎｄ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｃｏｍｍｏｎｌｙ ｕｓｅｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ ｄｕｅ ｔｏ ｉｔｓ ｈｉｇｈ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ.
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ( ｍＰＣＲ ) ｈａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ａ ｓｉｎｇｌｅ
ｒｅａｃｔｉｏｎ[３] . Ａｌｔｈｏｕｇｈ ｓｅｖｅｒａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ
ｃｉｔｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｈａｖｅ ｂｅｅｎ ｒｅｐｏｒｔｅｄ [１ꎬ４] ꎬ ｎｏ ｐｒｏｔｏ￣
ｃｏｌ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃ￣
ｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓꎬ ＣＴＶꎬ ＣＴＬＶꎬ ａｎｄ ＣＥＶｄ.
Ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙꎬ ａ ｒａｐｉｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｆｏｕｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｂｙ ｃｏｎｊｕｎｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ
ａ ｃｏ￣ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｌａｎｔ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ
ｗａｓ ｉｎｔｒｏｄｕｃｅｄ.
１　 Ｍａｔｅｒｉａｌｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ
１.１　 Ｐａｔｈｏｇｅｎ ｓｏｕｒｃｅｓ ａｎｄ ｓａｍｐｌｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ
　 　 Ｆｏｕｒ ｂｕｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃａ. Ｌ.
ａｓｉａｔｉｃｕｓ ｆｒｏｍ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ Ｐｒｏｖｉｎｃｅｓꎬ ＣＥＶｄ ｆｒｏｍ
Ｓｉｃｈｕａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅｓꎬ ＣＴＶ ａｎｄ ＣＴＬＶ ｆｒｏｍ
Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｃｉｔｙ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ. Ｔｈｅ ｂｕｄｓ ｗｅｒｅ ｇｒａｆ￣
ｔｅｄ ｏｎｔｏ Ｃａｒｒｉｚｏ ｃｉｔｒａｎｇｅ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ ａ
ｓｃｒｅｅｎｈｏｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｉｔｒｕｓ Ｖｉｒｕｓ Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ
Ｃｅｎｔｅｒ ｌｏｃａｔｅｄ ｉｎ Ｂｅｉｂｅｉ ｄｉｓｔｒｉｃｔ ｏｆ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ. Ｔｈｅｓｅ
ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ｔｈｅ ｍＰＣＲ
ｐｒｏｔｏｃｏｌ.
　 　 Ｔｗｅｎｔｙ￣ｅｉｇｈｔ ｃｉｔｒｕｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ
ｆｒｏｍ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ Ｃｉｔｙꎬ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇꎬ Ｙｕｎｎａｎꎬ Ｚｈｅ￣
ｊｉａｎｇꎬ Ｊｉａｎｇｘｉ ａｎｄ Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ Ｇｕａｎｇｘｉ
Ｚｈｕａｎｇ Ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓ Ｒｅｇｉｏｎꎬ Ｃｈｉｎａꎬ ａｎｄ ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ
ｔｏ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ａｂｏｖｅ￣ｍｅｎ￣
ｔｉｏｎｅｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ. Ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐ ｇｒａｆ￣
ｔｅｄ ｂｕｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ｐｒｏｖｉｄｅｄ ｂｙ Ｍｒｓ Ｋｅ￣ｈｏｎｇ Ｌｉｕ
(Ｃｉｔｒｕｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ ＣＡＡＳ) .
１.２　 Ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ
　 　 Ｌｅａｆ ａｎｄ ｂａｒｋ ｏｒ ｆｒｕｉｔ ｓｋｉｎ (１０￣１５ ｍｇ) ｗａｓ
ｐｌａｃｅｄ ｉｎ ａ １.５￣ｍＬ ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ ｔｕｂｅ ｉｍｍｅｒｓｅｄ ｉｎ ｌｉ￣
ｑｕｉｄ ｎｉｔｒｏｇｅｎ ａｎｄ ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ａｓ
ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙ[５] . Ｔｈｅ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｄｉｒｅｃｔｌｙ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｓｓａｙ.
１.３　 Ｓｉｎｇｌｅ ＰＣＲｓ
　 　 Ｓｉｎｇｌｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｆｏｒ ＣＥＶｄ ａｎｄ ＰＣＲ ｆｏｒ Ｃａ. Ｌ.
ａｓｉａｔｉｃｕｓ ｗｅｒｅ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｉｎ ａｃｃｏｒｄａｎｃｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ
ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ. [６] ａｎｄ Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ.[７]ꎬ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｓｉｎｇｌｅ ＲＴ￣ＰＣＲ ｆｏｒ ＣＴＶ ａｎｄ ＣＴＬＶ
ｗａｓ ｐｅｒｆｏｒｍｅｄ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｐｒｉｍｅｒｓ (Ｔａｂｌｅ １)
ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｔｏ Ｔａｎｇ ｅｔ ａｌ.[１１] .
Ｔａｂｌｅ １　 ＰＣＲ ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ａｎｄ ｓｉｎｇｌｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ
Ｔａｒｇｅｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｐｒｉｍｅｒ ｎａｍｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′– ３′) Ｐｒｏｄｕｃｔ ｓｉｚｅ / ｂｐ Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓ ＯＩ１ ＧＣＧＣＧＴＡＴＧＣＡＡＴＡＣＧＡＧＣＧＧＣＡ １ １６０ １６Ｓ ｒＤＮＡ [８]
ＯＩ２ｃ ＧＣＣＴＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＡＣＣＣＡＴ
ＣＴＶ ＡＲＩＳＦ ＡＴＧＴＣＡＧＧＣＡＧＣＴＴＧＧＧＡＡＡＴＴ ５１１ Ｐ１８ [１]
ＡＲＩＳＲ ＴＴＣＧＴＧＴＣＴＡＡＧＴＣＲＣＧＣＴＡＡ ＣＡ
ＣＥＶｄ ＣＥＶＦ ＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＣＧＡＧ ３７１ Ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｇｅｎｏｍｅ [９]
ＣＥＶＲ ＣＣＧＧＧＧＡＴＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＣＴＴ
ＣＴＬＶ ＴＬＶＦ ＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＴＧＣＴＧＣＣＡＣＴＴＣＴ ３０９ Ｐａｒｔｉａｌ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ [１]
ＴＬＶＲ ＴＡＣＴＣＴＣＣＧＡＡＣＣＴＧＣＣＴＣＧＡ ＡＡ
Ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ＵＢＱＦ∗ ＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＡＡＣＧＴＴＧＴＣＡＡＴ １９４ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ [１０]
ＵＢＱＲ ＧＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＣＴＧＧＧＡＡＧＣＡ
　 Ｒ: Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒꎻ Ｆ: Ｓｅｎｓｅ ｐｒｉｍｅｒ.
６９２
　
　 ３期 刘金香ꎬ等:应用多重 ＰＣＲ技术同步检测柑橘 ４种重要嫁接传播病原
１.４　 Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙ
　 　 Ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙꎬ Ｏｎｅ￣Ｓｔｅｐ ＲＴ￣ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍ ( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ) ｗａｓ ｕｓｅｄ. Ｔｈｅ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｉｘｔｕｒｅ
( ｔｏｔａｌ ｖｏｌｕｍｅ １０ μＬ) ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ １μＬ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ ａｎｄ ９ μＬ ｏｆ ｔｈｅ ＰＣＲ ｍｉｘｔｕｒｅꎬ ｗｈｉｃｈ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ ５
μＬ ｏｆ ２× ｂｕｆｆｅｒꎬ ０.３ μＬ ｏｆ ５０ ｍＭ ＭｇＳＯ４ꎬ ０.３ μＬ
ｏｆ １０ ｍＭ ｄＮＴＰｓꎬ ０.６ μＬ ｏｆ １００ ｍＭ ＤＴＴꎬ ０.４ μＬ
ｏｆ ＲＴ / Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ Ｍｉｘ (Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎꎬ ＵＳＡ) ꎬ ０.９７
μＬ ｏｆ ｓｔｅｒｉｌｅ ｗａｔｅｒ ａｎｄ １.４３ μＬ ｏｆ ｅａｃｈ ｐｒｉｍｅｒ ｍｉｘ￣
ｔｕｒｅｓ (Ｔａｂｌｅ １) ａｔ ａ ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ０.１６ μＭ
ｆｏｒ ＣＴＬＶꎬ ０.５ μＭ ｆｏｒ ＣＥＶｄꎬ ０.４ μＭ ｆｏｒ ＨＬＢ ａｎｄ
０.１３ μＭ ｆｏｒ ＣＴＶ. Ｐｒｉｍｅｒｓ ｔｏ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｇｅｎｅ ｗｅｒｅ
ｕｓｅｄ ａｓ ａｎ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ (ＵＢＱ￣Ｆꎬ ￣Ｒꎬ ｅａｃｈ ａｔ ０.２４
μＭ) . Ｔｈｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ｗａｓ ｉｎｃｕｂａｔｅｄ ａｔ ５５°Ｃ ｆｏｒ ３０ ｍｉｎ
ｆｏｒ ｃＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬ ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ａ ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ
ａｔ ９４℃ ｆｏｒ ５ ｍｉｎ. Ｔｈｅｎ ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ３５ ＰＣＲ ｃｙｃｌｅｓ ｗｅｒｅ
ｒｕｎꎬ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ａ ｔｗｏ￣ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ＰＣＲ ｃｙｃｌｅ ｗｉｔｈ ｄｅ￣
ｎａｔｕｒａｔｉｏｎ ａｔ ９４℃ ｆｏｒ ３０ ｓ ａｎｄ ｐｒｉｍｅｒ ａｎｎｅａｌｉｎｇ ａｎｄ
ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ ａｔ ６８℃ ｆｏｒ ８０ ｓꎬｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ ｆｉｎａｌ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ
ａｔ ６８℃ ｆｏｒ ７ ｍｉｎ. Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ
ａｎａｌｙｓｅｄ ｏｎ ａ １. ５％ ａｇａｒｏｓｅ ｇｅｌ ａｎｄ ｓｔａｉｎｅｄ ｗｉｔｈ
ｅｔｈｉｄｉｕｍ ｂｒｏｍｉｄｅ.
１.５　 Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ
　 　 Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌꎬ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄꎬ ｌｉｇａｔｅｄ
ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｐＭＤ１９￣Ｔ ｖｅｃｔｏｒ (ＴａＫａＲａ)ꎬ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ
(ＢＧＩꎬ Ｃｈｉｎａ) . Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗａｓ
ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ａ ＢＬＡＳＴ ｓｅａｒｃｈ ｏｆ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ
ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｄａｔａｂａｓｅｓ ( ｈｔｔｐ: / /
ｗｗｗ.ｎｃｂｉ.ｎｌｍ.ｎｉｈ.ｇｏｖ / ｂｌａｓｔ) .
１.６ 　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ
　 　 Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｓｓａｙꎬ ｅｘ￣
ｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｒｅｅｓ ｗｅｒｅ ｄｉｌｕｔｅｄ ｓｅｒｉａｌｌｙ
ｉｎ ａ ｔｅｎ￣ｆｏｌｄ ｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｆｒｏｍ ｕｎｉｎｆｅｃｔｅｄ ｔｒｅｅｓ ａｎｄ ｔｅｓｔｅｄ
ｉｎ ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｆｏｒｍａｔｓ.
２　 Ｒｅｓｕｌｔｓ
２.１　 Ｓｉｎｇｌｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙ
　 　 Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ＰＣＲ ａｓｓａｙｓꎬ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｆｒａｇ￣
ｍｅｎｔｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｏ ｅａｃｈ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗｅｒｅ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓꎬ ｗｈｅｒｅａｓ ｎｏ
ｕｎｓｅｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｎｄ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｈｅａｌｔｈｙ ｃｉｔｒｕｓ
ｔｉｓｓｕｅｓ. Ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＴＶ￣ ａｎｄ ＣＴＬＶ￣ｓｐｅ￣
ｃｉｆｉｃ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｂｙ ｕｎｉｐｌｅｘ￣ＰＣＲ ｗａｓ ｓｈｏｗｎ ｉｎ Ｆｉｇ. １.
Ｔｈｅ ｓｉｚｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ５１１ ｂｐ ｆｏｒ
ＣＴＶ ａｎｄ ３０９ ｂｐ ｆｏｒ ＣＴＬＶ.
Ｆｉｇ. １　 Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＴＶ ａｎｄ ＣＴＬＶ ｂｙ ｓｉｎ￣
ｇｌｅ ＲＴ￣ＰＣＲ
(ａ) Ｌａｎｅ １￣３: ＣＴＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄꎻ Ｌａｎｅｓ ４ ａｎｄ ５: Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎ￣
ｔｒｏｌ. (ｂ) Ｌａｎｅｓ １￣３: ＣＴＬＶ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄꎻ Ｌａｎｅｓ ４ ａｎｄ ５: Ｈｅａｌｔｈｙ
ｃｏｎｔｒｏｌ.
２.２　 Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙ
　 　 Ｖａｒｉｏｕｓ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｅｒｅ ｔｅｓｔｅｄ ｔｏ ｏｐｔｉｍｉｚｅ ｔｈｅ
ｍＰＣＲ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓꎬ ｅｓｐｅｃｉａｌｌｙ ｗｉｔｈ ｒｅｓｐｅｃｔ ｔｏ ｐｒｉｍｅｒ
ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ. Ａｔ ｆｉｒｓｔꎬ ｉｎ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｓｙｓｔｅｍꎬ ａｔ ａ
ｆｉｎａｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ０.２ μＭ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ ａｌｌ ｇｅｎｅｓꎬ
ｅｘｃｅｐｔ ｆｏｒ ０.４ μＭ ｐｒｉｍｅｒ ｆｏｒ Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓꎬ ｔｈｅ
ｌｏｗｅｓｔ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ ｆｏｒ
ＣＥＶｄꎬ ｗｈｅｒｅａｓ ＣＴＶ ｇａｖｅ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ａｍｏｕｎｔ ｏｆ
７９２
　
植物病理学报 ４４卷
ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ. Ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ
ａｌｌ ｔａｒｇｅｔｓꎬ ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ＣＴＶ
ｗａｓ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ ｔｏ ０.１３ μＭ ａｎｄ ｔｈｏｓｅ ｆｏｒ ＣＥＶｄ ａｍ￣
ｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗｅｒｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｏ ０.５ μＭ. Ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ ｏｎ ＣＴＶ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｉｓ ｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｄ ｉｎ Ｆｉｇ. ２. Ａｔ ａ ＣＴＶ
ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ０.１ μＭꎬ ｌｉｔｔｌｅ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ. Ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｎａｌ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｍｉｘｔｕｒｅꎬ ｔｈｅ ｃｏｎ￣
ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＴＬＶ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ０. １６ μＭ ａｎｄ
ｔｈａｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓ ｐｒｉｍｅｒｓ ｗａｓ ０. ４ μＭ.
Ｎｏｎｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｎｏｔ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ａｎｙ ｏｆ ｔｈｅ
ｓａｍｐｌｅｓ ｔｅｓｔｅｄ. Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｆｒａｇｍｅｎｔ ｗａｓ
ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｌｙ ｉｎ ａｌｌ ｃｉｔｒｕｓ ｓａｍｐｌｅｓ ａｎａｌｙｓｅｄ.
Ｗｈｅｎ ａ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｆｏｕｒ ｓｉｎｇｌｅ￣ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ ｗａｓ
ｓｕｂｊｅｃｔｅｄ ｔｏ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲꎬ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ
ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙ ｂｙ ｔｈｅ ｍｉｘｔｕｒｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ
ｆｏｒ Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓꎬ ＣＴＶꎬ ＣＴＬＶꎬ ＣＥＶｄ ａｎｄ ｔｈｅ
ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ (Ｆｉｇ. ３ꎬ Ｌａｎｅ １) .
Ｆｉｇ. ２ 　 Ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａ￣
ｔｉｏｎｓ ｏｎ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＴＶ ｂｙ
ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ
Ｌａｎｅｓ １￣４ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ ａ ｍｉｘ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ａｎｄ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｐｒｉｍｅｒ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ. Ｌａｎｅ １: ０.０２ μＭꎻ Ｌａｎｅ ２: ０.０６ μＭꎻ
Ｌａｎｅ ３: ０.１ μＭꎻ Ｌａｎｅ ４: ０.１３ μＭꎻ Ｌａｎｅ ５: Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎ￣
ｔｒｏｌꎻ Ｍ: １００ ｂｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ.
　 　 Ｔｏ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅ ｔｈｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌꎬ ａｌｌ ｔｈｅ ＰＣＲ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄꎬ
ｃｌｏｎｅｄꎬ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｄ. Ｔｈｅｉｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ
ｂｏｔｈ ｔｈｅ ｅｘｐｅｃｔｅｄ ｓｉｚｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ
ｇｅｎｏｍｉｃ ｒｅｇｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ.
２.３ 　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ
ＰＣＲ ａｓｓａｙｓ
　 　 Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｍＰＣＲ ｗａｓ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ ｕ￣
ｓｉｎｇ １０￣ｆｏｌｄ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｍｉｘ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄｓ. Ｐａｔｈｏｇｅｎ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｂａｎｄｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｏｔａｌ
ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｔ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ １０￣４ｆｏｒ ＣＴＶꎬ １０￣３ ｆｏｒ Ｃａ. Ｌ.
ａｓｉａｔｉｃｕｓꎬ ＣＥＶｄ ａｎｄ ＣＴＬＶ (Ｆｉｇ. ４) . Ｔｈｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉ￣
ｔｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｓｉｎｇｌｅ ａｎｄ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗｅｒｅ ｓｉｍｉ￣
ｌａｒ ｆｏｒ ａｌｌ ｆｏｕｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｕｐｏｎ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎ ｔｅｓｔｉｎｇ.
Ｆｉｇ. ３　 Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｓｉｎｇｌｅ ｉｎｆｅｃ￣
ｔｉｏｎ ｅｘｔｒａｃｔｓ
Ｌａｎｅ １: Ｍｉｘ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｔｅｓｔｅｄ ｉｎ Ｌａｎｅｓ ２￣５ꎻ Ｌａｎｅ ２:
Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓꎻ Ｌａｎｅ ３: ＣＴＶꎻ Ｌａｎｅ ４: ＣＥＶｄꎻ Ｌａｎｅ ５: ＣＴＬＶꎻ
Ｌａｎｅ ６: Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｍ: １００ ｂｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ.
Ｆｉｇ. ４　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｉｅｓ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ (ａ) ａｎｄ ｓｉｎ￣
ｇｌｅ ＰＣＲ (ｂ) ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａｎ￣
ｄｉｄａｔｕｓ Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓꎬ ＣＴＶꎬ ＣＴＬＶ ａｎｄ
ＣＥＶｄ
Ｌａｎｅ １￣５: １０￣ｆｏｌｄ ｓｅｒｉａｌ ｄｉｌｕｔｉｏｎｓ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｔｈｅ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｌａｎｅ ６: Ｗａｔｅｒ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｍ: １００
ｂｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ.
８９２
　
　 ３期 刘金香ꎬ等:应用多重 ＰＣＲ技术同步检测柑橘 ４种重要嫁接传播病原
２.４ 　 Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｏｕｒ ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｉｎ ｆｉｅｌｄ￣ｇｒｏｗｎ
ｔｒｅｅｓ ａｎｄ ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐ ｇｒａｆｔｅｄ ｂｕｄｌｉｎｇｓ
　 　 Ｔｈｅ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ ｆｏｒ ｔｈｅ
ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓꎬ ＣＴＶꎬ ＣＴＬＶꎬ ａｎｄ
ＣＥＶｄ ｉｎ ｆｉｅｌｄ￣ｇｒｏｗｎ ｓａｍｐｌｅｓ ( Ｆｉｇ. ５￣ａ ).
Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ ｈａｌｆ ｏｆ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏ￣ｉｎｆｅｃｔｅｄ
ｗｉｔｈ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｏｎｅｐａｔｈｏｇｅｎ ａｎｄ ｔｈｒｅｅ ｐｌａｎｔｓ ｃｏｎｔａｉｎｅｄ
ｕｐ ｔｏ ｔｈｒｅｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ (Ｆｉｇ. ５￣ａꎬ Ｌａｎｅ ５). Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ
ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐ ｇｒａｆｔｅｄ ｂｕｄｌｉｎｇｓ ｗｅｒｅ ａｓｓａｙｅｄ ｒａｐｉｄｌｙ ｂｙ ｔｈｉｓ
ｍｅｔｈｏｄꎬ ｏｖｅｒ ８０％ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｃｏｎｆｉｒｍｅｄ ｔｏ ｂｅ ｖｉｒｕｓ￣
ｆｒｅｅ (Ｆｉｇ. ５￣ｂ). Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ２８
ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｅｅｓ ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ｓｗｅｅｔ ｏｒａｎｇｅꎬ
ｌｅｍｏｎꎬ ｍａｎｄａｒｉｎꎬ ａｎｄ ｍａｎｄａｒｉｎ ｈｙｂｒｉｄ ｃｕｌｔｉｖａｒｓ ｉｓ
ｓｕｍｍａｒｉｚｅｄ ｉｎ Ｔａｂｌｅ ２. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ
８９.３％ꎬ １７.９％ꎬ １０.７％ꎬ ａｎｄ ２８.６％ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ￣ｇｒｏｗｎ
ｃｉｔｒｕｓ ｓａｍｐｌｅｓ ｗｅｒｅ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｗｉｔｈ ＣＴＶꎬ ＣＥＶｄꎬ
ＣＴＬＶꎬ ａｎｄ Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ.
３　 Ｄｉｓｃｕｓｓｉｏｎ
　 　 Ｔｈｅ ｃｉｔｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ＣＴＶꎬ ＣＴＬＶꎬ ＣＥＶｄ ａｎｄ
Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓ ａｒｅ ａｌｌ ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓꎬ ｄｉｓ￣
ｔｒｉｂｕｔｅｄ ｗｏｒｌｄｗｉｄｅꎬ ａｎｄ ｃａｕｓｅ ｈｉｇｈ ｌｏｓｓｅｓ ｔｏ ｃｉｔｒｕｓ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ. Ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｔｌｙꎬ ｗｅ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ｔｈｅｓｅ ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎｓ ａｓ ｔｈｅ ｔａｒｇｅｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ａ ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ. Ｉｎ ｔｈｅ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｍｕｌｔｉ￣
ｐｌｅｘ ａｓｓａｙｓ ｆｏｒ ｃｉｔｒｕｓ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ[１２]ꎬ ｔｗｏ￣ｓｔｅｐ ＲＴ￣
ＰＣＲ ｗｔｉｈ ｔｈｒｅｅ￣ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｉｎｇ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄꎬ ａｎｄ
ｎｏ ｍｏｒｅ ｔｈａｎ ｔｈｒｅｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｗｅｒｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ ｄｅ￣
ｔｅｃｔｅｄ. Ｈｅｒｅꎬ ａ ｏｎｅ￣ｓｔｅｐ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｔａｒｇｅｔｓ ｗａｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄꎬｉｎ ｗｈｉｃｈ
ａ ｔｗｏ￣ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ｃｙｃｌｉｎｇ ｆｏｒ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｗａｓ
ａｄｏｐｔｅｄ. Ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｔｗｏ￣ｓｔｅｐ ａｓｓａｙꎬ ｔｈｅ ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｉｓ ｍｏｒｅ ｔｉｍｅｓａｖｉｎｇ ａｎｄ ｃｏｕｌｄ ｄｅｃｒｅａｓｅ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ.
　 　 Ａｌｔｈｏｕｇｈ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｓｈｏｒｔ ｌｅｎｇｔｈ
ｏｆｔｅｎ ｇｉｖｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｆｏｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉ￣
ｐｌｅｘ ＰＣＲꎬ ｌｏｎｇ ｔａｒｇｅｔ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｏｆ ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ
１ ０００ ｂｐ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｕｓｅｄ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎｓ[１３] . Ｉｎ ｔｈｉｓ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ｐｒｏｃｅｄｕｒｅꎬ ｐｒｉｍｅｒｓ
ｆｏｒ Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｔｈａｔ ｇａｖｅ ａ ｌｏｎｇｅｒ
ｐｒｏｄｕｃｔ (１ １６０ ｂｐ) ｂｅｃａｕｓｅ Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓ ｗａｓ ｉ￣
ｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ｃｏｎｓｉｓｔｅｎｔｌｙ ｂｙ ｔｈｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｐｒｏｄｕｃｔ. Ｉｎ
ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｓｅｌｅｃｔｅｄ ａｓ ａｎ ｉｎｔｅｒ￣
ｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｔｏ ｖａｌｉｄａｔｅ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｎｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｍＰＣＲ ａｓｓａｙｓ[１１] . Ｍｏｒｅｏｖｅｒꎬ
ｔｏ ａｃｈｉｅｖｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｉｓ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎ￣
ｔｒｏｌꎬ ａ ｐａｉｒ ｏｆ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｐｒｉｍｅｒｓ ｆｏｒ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ
ｐａｒｔｉａｌ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｕｂｉｑｕｉｔｉｎ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｒｅｄｅ￣
ｓｉｇｎｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｂａｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｒｅｐｏｒｔｅｄ
ｂｙ Ｂｒｕｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ. [１０] .
　 　 Ａ ｒａｐｉｄ ｍｉｎｉ￣ｐｒｅｐ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ
ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ. Ｂｏｔｈ ＲＮＡ ａｎｄ
ＤＮＡ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙꎬ ｗｈｉｃｈ ｍｅｔ ｔｈｅ
ｄｅｍａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ
ａｎｄ ＤＮＡ ｗｅｒｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｏｕｇｈ ｔｈｅ
ｆｏｕｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ａｒｅ ａｌｌ ｓｙｓｔｅｍｉｃａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓꎬ ｔｈｅｉｒ
Ｆｉｇ. ５　 Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓꎬ ＣＴＶꎬ ＣＴＬＶ ａｎｄ ＣＥＶｄ ｉｎ ｆｉｅｌｄ￣ｇｒｏｗｎ ｃｉｔｒｕｓ
ｓａｍｐｌｅｓ (ａ) ａｎｄ ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐ ｇｒａｆｔｅｄ ｂｕｄｌｉｎｇｓ (ｂ)
(ａ) Ｌａｎｅｓ １￣６ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ ｔｏ ｓｉｘ ｓａｍｐｌｅｓ ｌｉｓｔｅｄ ｉｎ Ｔａｂｌｅ ２. Ｌａｎｅ １: ｎｏ. ７ꎻ Ｌａｎｅ ２: ｎｏ. ２２ꎻ Ｌａｎｅ ３: ｎｏ. １０ꎻ
Ｌａｎｅ ４: ｎｏ. ２６ꎻ Ｌａｎｅ ５: ｎｏ. ２３ꎻ Ｌａｎｅ ６: ｎｏ. １８ꎻ Ｌａｎｅ ７: Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ Ｍ: １００￣ｂｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ.
(ｂ) Ｌａｎｅｓ １￣６:Ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐ ｇｒａｆｔｅｄ ｂｕｄｌｉｎｇｓꎻ Ｌａｎｅ ７: Ｍｉｘ ｏｆ ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｔｅｓｔｅｄꎻ Ｌａｎｅ ８: Ｈｅａｌｔｈｙ ｃｏｎｔｒｏｌꎻ
Ｍ: １００ ｂｐ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍａｒｋｅｒ.
９９２
　
植物病理学报 ４４卷
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＣＴＶꎬ ＣＥＶｄꎬ ＣＴＬＶ ａｎｄ
Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓ ｉｎ ２８ ｆｉｅｌｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｏｒａｎｇｅꎬ
ｍａｎｄａｒｉｎꎬ ｍａｎｄａｒｉｎ ｈｙｂｒｉｄꎬ ａｎｄ ｌｅｍｏｎ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｉｎ Ｃｈｉｎａ
Ｎｏ. Ｃｕｌｔｉｖａｒ
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ
Ｏｒｉｇｉｎ ｏｆ ｓａｍｐｌｅ ＣＴＶ ＣＥＶｄ ＣＴＬＶ
Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ
Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓ
１ Ｓｈａｔａｎｇｊｕ ｍａｎｄａｒｉｎ Ｙｕｎｎａｎ ＋ ￣ ￣ ￣
２ Ｓｈａｔａｎｇｊｕ ｍａｎｄａｒｉｎ Ｙｕｎｎａｎ ＋ ￣ ￣ ＋
３ Ｅｕｒｅｋａ ｌｅｍｏｎ Ｙｕｎｎａｎ ￣ ￣ ￣ ￣
４ Ｅｕｒｅｋａ ｌｅｍｏｎ Ｙｕｎｎａｎ ＋ ￣ ￣ ＋
５ Ｘｉｎｇｇｕｏ ｓｗｅｅｔ ｏｒａｎｇｅ Ｊｉａｎｇｘｉ ＋ ＋ ￣ ￣
６ Ｎｅｗｈａｌｌ ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅ Ｊｉａｎｇｘｉ ＋ ＋ ￣ ￣
７ Ｈａｍｌｉｎ ｓｗｅｅｔ ｏｒａｎｇｅ Ｊｉａｎｇｘｉ ＋ ￣ ￣ ￣
８ Ｎｅｗｈａｌｌ ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅ Ｊｉａｎｇｘｉ ￣ ￣ ￣ ＋
９ Ｍｉｙａｇａｗａ ｗａｓｅ ｕｎｓｈｉｕ Ｈｕｎａｎ ＋ ￣ ￣ ￣
１０ Ｅｈｉｍｅ ｋａｓｈｉ Ｎｏ. ２２ Ｈｕｎａｎ ＋ ￣ ￣ ￣
１１ Ｅｈｉｍｅ ｋａｓｈｉ Ｎｏ. ２８ Ｈｕｎａｎ ＋ ￣ ￣ ￣
１２ Ｎａｎｋａｎ ｕｎｓｈｉｕ Ｎｏ. ２０ Ｈｕｎａｎ ＋ ￣ ￣ ￣
１３ Ａｍａｋｕｓａ Ｔａｎｇｏｒ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ＋ ￣ ￣ ￣
１４ Ｏｉｔａ ｕｎｓｈｉｕ Ｚｈｅｊｉａｎｇ ￣ ￣ ￣ ￣
１５ ＡｍａｋｕｓａＴａｎｇｏｒ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ＋ ￣ ￣ ￣
１６ Ｔａｒｏｃｏ ｂｌｏｏｄ ｏｒａｎｇｅ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ＋ ＋ ＋ ￣
１７ Ｙｕｈｏｎｇ ｓｗｅｅｔ ｏｒａｎｇｅ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ＋ ￣ ￣ ￣
１８ Ｆｅｎｇｙｕａｎ Ｎｏ. ７２￣１ ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ＋ ＋ ￣ ￣
１９ Ｐｏｗｅｌｌ ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ＋ ￣ ＋ ￣
２０ Ｔａｒｏｃｏ ｂｌｏｏｄ ｏｒａｎｇｅ Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ ＋ ￣ ￣ ￣
２１ Ｘｉｎｈｕｉ ｓｗｅｅｔ ｏｒａｎｇｅ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ＋ ＋ ￣ ＋
２２ Ａｎｌｉｕ ｓｗｅｅｔ ｏｒａｎｇｅ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ＋ ￣ ￣ ＋
２３ Ｓｈａｔａｎｇｊｕ ｍａｎｄａｒｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ＋ ￣ ＋ ＋
２４ Ｓｈａｔａｎｇｊｕ ｍａｎｄａｒｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ＋ ￣ ￣ ￣
２５ Ａｎｌｉｕ ｓｗｅｅｔ ｏｒａｎｇｅ Ｇｕａｎｇｘｉ ＋ ￣ ￣ ￣
２６ Ｓｅｉｋｅ ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅ Ｇｕａｎｇｘｉ ＋ ￣ ￣ ＋
２７ Ｓｅｉｋｅ ｎａｖｅｌ ｏｒａｎｇｅ Ｇｕａｎｇｘｉ ＋ ￣ ￣ ￣
２８ Ａｎｌｉｕ ｓｗｅｅｔ ｏｒａｎｇｅ Ｇｕａｎｇｘｉ ＋ ￣ ￣ ＋
Ｎｕｍｂｅｒ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ (％) ２５(８９.３) ５(１７.９) ３(１０.７) ８(２８.６)
ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｉｎ ｃｉｔｒｕｓ ｐｌａｎｔ ｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ. Ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ
ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ Ｃａ. Ｌ. ａｓｉａｔｉｃｕｓ ａｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｍｉｄｒｉｂ
ｏｆ ｍａｔｕｒｅ ｌｅａｖｅｓ[１４]ꎬ ｗｈｅｒｅａｓ ＣＴＶ ｉｓ ｍｏｒｅ ａｂｕｎｄａｎｔ
ｉｎ ｂａｒｋ ｔｈａｎ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ｏｒ ｌｅａｖｅｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｓ ｈｉｇｈｅｒ ｉｎ ｙｏｕｎｇ ｔｉｓｓｕｅｓ ｔｈａｎ ｉｎ ｏｌｄ
ｔｉｓｓｕｅｓ[１５] . Ｔｈｕｓꎬ ｔｈｅ ｓａｍｐｌｅｓ ｆｏｒ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅ￣
ｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈｅ ｍｉｄｒｉｂ ｏｆ
ｂｏｔｈ ｍａｔｕｒｅ ａｎｄ ｙｏｕｎｇ ｌｅａｖｅｓꎬ ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｔｏ ｔｅｎｄｅｒ
ｂａｒｋｓ.
　 　 Ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙꎬ ｔｈｅ ｍＰＣＲ ａｓｓａｙ ｗａｓ ａｐｐｌｉｅｄ
００３
　
　 ３期 刘金香ꎬ等:应用多重 ＰＣＲ技术同步检测柑橘 ４种重要嫁接传播病原
ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｇｒａｆｔ￣ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｂｌｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ｃｉｔ￣
ｒｕｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ. Ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｓꎬ ＣＴＶ ｗａｓ ｔｈｅ ｐｒｅ￣
ｄｏｍｉｎａｎｔ ｓｐｅｃｉｅｓꎬ ｗｈｅｒｅａｓ ｔｈｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ＣＥＶｄ
ａｎｄ ＣＴＬＶ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｗａｓ ｓｐｏｒａｄｉｃ. Ｏｆ ｔｈｅ
ｓａｍｐｌｅｓ ｃｏｌｌｅｃｔｅｄ ｆｒｏｍ ｃｏａｓｔａｌ ａｒｅａｓꎬ ｃｏ￣ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ
ＣＴＶ ａｎｄ ＨＬＢ ｗａｓ ｆｒｅｑｕｅｎｔꎬ ｗｈｅｒｅａｓ ｃｏ￣ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ｂｙ
ＣＴＶ ａｎｄ ＣＴＬＶ ｏｃｃｕｒｒｅｄ ｓｅｌｄｏｍｌｙ.
　 　 Ｃｉｔｒｕｓ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｎｅｅｄｓ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｒｅｌｉａｂｌｅ
ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ ｍｅｔｈｏｄｓ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ. Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ
ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＰＣＲ ａｓｓａｙ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ｈｅｒｅｉｎ ｉｓ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ
ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｓｅ ｆｏｕｒ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｉｎ ｎｕｒｓｅｒｉｅｓ ｏｒ ｉｎ ｆｉｅｌｄꎬ ａｎｄ ｆｏｒ
ｔｈｅ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ
ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｉｎ ｓｈｏｏｔ￣ｔｉｐ ｇｒａｆｔｅｄ ｂｕｄｌｉｎｇｓꎬ ｗｈｉｃｈ
ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｖｉｒｕｓ￣ｆｒｅｅ ｐｒｏｐａｇａｔｉｏｎ.
Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅｓ
[１] 　 Ｒｏｙ Ａꎬ Ｆａｙａｄ Ａꎬ Ｂａｒｔｈｅ Ｇꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｐｏｌｙ￣
ｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒｅｌｉａｂｌｅꎬ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ
ａｎｄ ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎ ｃｉｔｒｕｓ
ｔｒｅｅｓ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ ２００５ꎬ１２９:
４７－５５.
[２] 　 Ｒｏｉｓｔａｃｈｅｒ Ｃ Ｎꎬ Ｃａｌａｖａｎ Ｅ Ｃꎬ Ｂｌｕｅ Ｒ Ｌꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｎｅｗ
ｍｏｒｅ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｃｉｔｒｏｎ ｉｎｄｉｃａｔｏｒ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｌｄ
ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｃｉｔｒｕｓ ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ ｖｉｒｏｉｄ (ＣＥＶｄ) [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ
Ｄｉｓｅａｓｅ Ｒｅｐｏｒｔｅｒꎬ １９７７ꎬ ６１: ｌ３５－１３９.
[３] 　 Ｇｒｉｅｃｏ Ｆꎬ Ｇａｌｌｉｔｅｌｌｉ Ｄ. Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ￣
ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ｖｉｒｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ
ｇｌｏｂｅ ａｒｔｉｃｈｏｋｅ [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９９９ꎬ
１４７: １８３－１８５.
[４] 　 Ｉｔｏ Ｔꎬ Ｉｅｋｉ Ｈꎬ Ｏｚａｋｉ Ｋ. Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｉｘ
ｃｉｔｒｕｓ ｖｉｒｏｉｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｅ ｓｔｅｍ ｇｒｏｏｖｉｎｇ ｖｉｒｕｓ ｆｒｏｍ ｃｉｔｒｕｓ
ｐｌａｎｔｓ ｂｙ ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ
ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓꎬ
２００２ꎬ １０６: ２３５－２３９.
[５] 　 Ｚｈｏｕ Ｃ Ｙꎬ Ｈａｉｌｓｔｏｎｅｓ Ｄꎬ Ｃｏｎｎｏｒ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ｍｅｔｈｏｄ
ｆｏｒ ｍｉｃｒｏ ａｎｄ ｒａｐｉｄ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ
(ＣＴＶ) ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｐｐｌｉｅｄ ｔｏ ＲＴ￣ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ) [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｆｕｊｉａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ(福建农业大学学报) ꎬ ２００１ꎬ ３０: ２００.
[６] 　 Ｗａｎｇ Ｘ Ｆꎬ Ｚｈｏｕ Ｃ Ｙꎬ Ｔａｎｇ Ｋ Ｚꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｒｅｌｉｍｉｎａｒｙ
ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｖｉｒｏｉｄｓ ｉｎ
Ｃｈｉｎａ [ Ｊ] . Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａꎬ ２００８ꎬ ７:
１０９７－１１０３.
[７] 　 Ｄｉｎｇ Ｆꎬ Ｄｅｎｇ Ｘ Ｘꎬ Ｈｏｎｇ Ｎꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｉｔｒｕｓ Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ (ＨＬＢ) ｂａｃｔｅｒｉｕｍ
ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ １６Ｓ ｒＤＮＡ ａｎｄ １６Ｓ / ２３Ｓ
ｒＤＮＡｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ｒｅｇｉｏｎｓ ａｍｏｎｇ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎ Ｃｈｉｎａ [ Ｊ] .
Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ １２４: ４９５－
５０３.
[８] 　 Ｊａｇｏｕｅｉｘ Ｓꎬ Ｂｏｖé Ｊ Ｍꎬ Ｇａｒｎｉｅｒ Ｍ. ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｔｈｅ ｔｗｏ′ Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ′ ｌｉｂｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ
ｗｉｔｈ ｇｒｅｅｎｉｎｇ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ [ Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ
Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓꎬ １９９６ꎬ１０: ４３－５０.
[９] 　 Ｇｒｏｓｓ Ｈ Ｊꎬ Ｋｒｕｐｐ Ｇꎬ Ｄｏｍｄｅｙ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎｄ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ ａｎｄ
Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｏｉｄ[ Ｊ] . Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙꎬ １９８２ꎬ １２１: ２４９－２５７.
[１０] Ｂｒｕｎｎｅｒ Ａ Ｍꎬ Ｙａｋｏｖｌｅｖ Ｉ Ａꎬ Ｓｔｒａｕｓｓ Ｓ Ｈ. Ｖａｌｉｄａｔｉｎｇ
ｉｎｔｅｒｎａｌ ｃｏｎｔｒｏｌｓ ｆｏｒ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｐｌａｎｔ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｓｔｕｄｉｅｓ [Ｊ] . ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ ４: １４.
[１１] Ｔａｎｇ Ｋ Ｚꎬ Ｐｅｎｇ Ｊꎬ Ｗａｎｇ Ｘ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ｑｕｉｃｋ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
ｏｆ Ｃｉｔｒｕｓ ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ ｖｉｒｏｉｄ ( ＣＥＶｄ ) ｂｙ ｏｎｅ￣ｓｔｅｐ
ＲＴ￣ ＰＣＲ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ａｃｔａ Ｈｏｒｔｉｃｕｈｕｒａｅ Ｓｉｎｉｃａ
(园艺学报) ꎬ ２００５ꎬ３２: ４０８－４１３.
[１２] Ｄｉｎｇ Ｆꎬ Ｃａｏ Ｑꎬ Ｗａｎｇ Ｇ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｎ ｔｈｅ
ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｃｉｔｒｕｓ Ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎꎬ Ｃｉｔｒｕｓ ｅｘｏｃｏｒｔｉｓ ｖｉｒｏｉｄꎬ Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ ｂｙ
ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ＲＴ￣ＰＣＲ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ) [ Ｊ ] . Ａｃｔａ
Ｈｏｒｔｉｃｕｈｕｒａｅ Ｓｉｎｉｃａ(园艺学报)ꎬ ２００６ꎬ ３３ꎬ ９４７－９５２.
[１３] Ｃｈａｎｇ Ｌꎬ Ｚｈａｎｇ Ｚꎬ Ｙａｎｇ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｓｔｒａｗｂｅｒｒｙ ＲＮＡ ａｎｄ ＤＮＡ ｖｉｒｕｓｅｓ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲ ｕｓｉｎｇ
ｔｏｔａｌ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ａｓ ａ ｔｅｍｐｌａｔｅ [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００７ꎬ １５５: ４３１－４３６.
[１４] ＬｉＷꎬ Ｌｅｖｙ Ｌꎬ Ｈａｒｔｕｎｇ Ｊ Ｓ. Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ
‘ Ｃａｎｄｉｄａｔｕｓ Ｌｉｂｅｒｉｂａｃｔｅｒ ａｓｉａｔｉｃｕｓ ’ ｉｎ ｃｉｔｒｕｓ ｐｌａｎｔｓ
ｗｉｔｈ ｃｉｔｒｕｓ ｈｕａｎｇｌｏｎｇｂｉｎｇ [Ｊ] . Ｐｈｙｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２００９ꎬ
９９: １３９￣１４４.
[１５] Ｌｉｕ Ｋ Ｈꎬ Ｚｈｏｕ Ｙꎬ Ｗａｎｇ Ｘ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ ｏｆ
Ｃｉｔｒｕｓ ｔｒｉｓｔｅｚａ ｖｉｒｕｓ ａｍｏｎｇ ｔｈｒｅｅ ｈｏｓｔｓ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ
ｔｉｓｓｕｅｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ ) [ Ｊ ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ
Ｓｃｉ￣Ｔｅｃｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ(西北
农林科技大学学报)ꎬ ２００５ꎬ ３３:１０９－１１０.
责任编辑:曾晓葳
１０３