全 文 ：园艺学报，2015，42 (1)：183–190.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2014-0740；http：//www. ahs. ac. cn 183
T3 基因型柑橘衰退病毒实时荧光定量RT-PCR
检测体系的建立及应用
陶珍珍 1,2，李中安 2，贾 敏 1，唐 萌 2，唐科志 2，周常勇 2,*，周 彦 2,*
（1 西南大学植物保护学院，重庆 400715；2中国农业科学院柑桔研究所，重庆 400712）
摘 要：根据不同基因型柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）ORF1a 的序列差异，设计 T3 基
因型CTV的特异性引物T3-4F/R，通过优化得到最佳反应条件建立T3基因型CTV分离株的SYBR GreenⅠ
实时荧光定量 RT-PCR，并进行灵敏性、重复性试验。应用该方法测定柑橘植株中 T3 基因型 CTV 分离株
含量。建立了一种特异性检测 T3 基因型 CTV 分离株的 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 RT-PCR 检测方法，
其灵敏性比普通 RT-PCR 方法高 100 倍。标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系，扩增效率为
97.1%，相关性系数为 0.992。组内和组间变异系数均小于 2.94%，表明该方法重复性好。田间样品中 T3
基因型 CTV 含量差异较大，最高含量是最低含量的 1 250 倍。本研究中建立的实时荧光定量 RT-PCR 检
测方法能够准确检测柑橘植株内的 T3 基因型 CTV 分离株，可用于研究 T3 基因型的 CTV 的变化规律。
关键词：柑橘衰退病毒；T3 基因型；实时荧光定量 RT-PCR
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2015）01-0183-08

Development and Application of a Quantitative RT-PCR Approach for
Quantification of T3 Genotype of Citrus tristeza virus
TAO Zhen-zhen1,2，LI Zhong-an2，JIA Min1，TANG Meng2，TANG Ke-zhi2，ZHOU Chang-yong2,*，
and ZHOU Yan2,*
（1College of Plant Protection，Southwest University，Chongqing 400715，China；2Citrus Research Institute，Chinese
Academy of Agricultural Sciences，Chongqing 400712，China）
Abstract：This study established a quantitative RT-PCR method with primers T3-4F/R based on the
conserved nucleotide sequence of Citrus tristeza virus（CTV）gene ORF1a. The results showed that the
method was at least hundred times higher than that with conventional PCR. A good linear correlation（R2 =
0.992）obtained from two standard curve of cRNA. The amplification efficiency was 97.1%. Three-time
repeats revealed that the coefficients of variation between the intra- and inter-assay were both within
2.94%，indicating a reliating reproducibility detection method to CTV. There was noticeable differences
among the content of T3 genotype in field samples，the highest content can reach to 1 250 times the lowest.
The method was used for accurate determination of T3 genotype in the plant，and could be used to study

收稿日期：2014–08–19；修回日期：2014–12–26
基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（201203076-01）；重庆市自然科学基金项目（CSTC2012jjA80029）；重庆市应用开发计
划项目（CSTC2014yykfA8005）；柑橘学重庆市市级重点实验室开放基金项目（CKLC201101）；中央高校基本科研业务费资助项目
（XDJK2014C027，XDJK2014A001）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhoucy@swu.edu.cn；zybook1@163.com）
Tao Zhen-zhen，Li Zhong-an，Jia Min，Tang Meng，Tang Ke-zhi，Zhou Chang-yong，Zhou Yan.
Development and application of a quantitative RT-PCR approach for quantification of T3 genotype of Citrus tristeza virus.
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the variation of T3 genotype.
Key words：Ctrus tristeza virus（CTV）；T3 genotype；quantitative RT-PCR

柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）引起的柑橘衰退病是柑橘生产中的重要病害之一
（Bar-Joseph et al.，1989；Roistacher，1992）。根据 CTV 在不同寄主上引起的症状差异，早期报道
中将 CTV 被分为了 T36、T30、T3、VT、B165 等 5 种不同的基因型（Karasev et al.，1995；Mawassi
et al.，1996；Albiach-Martí et al.，2000；Harper et al.，2009；Roy & Brlansky，2010）。其中，T36
基因型的 CTV 分离株主要引起酸橙（C. aurantium）、葡萄柚（C. paradisi）实生苗的速衰症状，T3
和 VT 基因型的 CTV 分离株主要引起甜橙、柚类等植株的茎陷点、植株矮化、果实变小、品质降低
症状等（Lopez et al.，1998；Kong et al.，2000）。
已有许多技术用于检测和区别不同基因型 CTV 分离株，应用单克隆抗体 MCA13 识别 T36 基因
型的 CTV 分离株（Permar et al.，1990）。随着实时定量 PCR 技术的发展，植物病原体以及监控病原
物感染的精确检测和定量分析得以实现（Boonham et al.，2002；Winton et al.，2002；Mercado-Blanco
et al.，2003）。有学者用实时荧光定量 RT-PCR 对柑橘组织内 CTV 进行定量分析（Ruiz-Ruiz et al.，
2007；Saponari et al.，2008），并运用 TaqMAN 探针区分某些 T36 基因型分离株和部分茎陷点分离
株（Ruiz-Ruiz et al.，2009）。已有报道应用 TaqMan 探针法对 T36、T30、VT 等 3 种基因型 CTV 定
量分析（Ananthakrishnan et al.，2010），但 T3 基因型 CTV 分离株的实时荧光定量 RT-PCR 检测体系
尚无报道。因此建立一种成本低且应用较广的 SYBR GreenⅠ实时荧光定量 RT-PCR 检测方法，以确
定的 CTV T3 基因型的含量很有必要。
1 材料与方法
1.1 供试材料及核酸提取
试验于 2013 年 10 月至 2014 年 3 月进行。试验中所用柑橘苗木由中国农业科学院柑桔研究所
提供，柑橘衰退病毒 T36、T30、VT、T3 基因型的阳性对照由美国佛罗里达大学柑橘研究与教育中
心 William Dawson 教授赠送。所有 CTV 毒源保存于中国农业科学院柑桔研究所国家柑橘苗木脱毒
中心。
按照Trizol试剂（Invitrogen，中国）说明书的方法提取毒源植株的总RNA，琼脂凝胶电泳检测
RNA完整性，用分光光度计（SmartSpecTM Plus，Bio-Rad，美国）测定浓度和纯度，以A260/A280= 1.9
~ 2.1 的总RNA作为实时荧光定量RT-PCR的模板，并在–80 ℃下保存备用。
1.2 RT-PCR扩增与克隆鉴定
根据 GenBank 公布的 T3 基因型 CTV 分离株的 ORF1a 基因序列，利用 Oligo 7 软件设计实时特
异性引物 T3-4F（5′-TCTAAATTCTACCCGAGGCAT-3′）和 T3-4R（5′-TTTTCCGCTTGTGTATAAAC
GA-3′）。用 NCBI 的 Primer-BLAST 进行比对，保证引物的特异性。
采用特异性引物 T3-4F 和 T3-4R 进行 RT-PCR 扩增，10 μL 反转录体系中加入 RNA 模板 4 μL，
5× RT-buffer 2 μL，无 RNase 水 2 μL，dNTPs 0.5 μL，T3-4R 引物（10 μmol · L-1）0.5 μL，RNasin 0.5
μL，RTase 0.5 μL。反应程序为：42 ℃反转录 30 min，94 ℃加热 1 min。
反转录结束后以 1 μL cDNA 为模板进行 25 μL 的 PCR 体系，反应体系：无 RNase 水 19.8 μL，
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10× buffer（Mg2+）2.5 μL，T3-4F 0.5 μL，T3-4R 0.5 μL，Ex-Taq 酶（5 U · μL-1）0.2 μL，cDNA 模板
1 μL。扩增程序：95 ℃ 4 min；95 ℃ 30 s，62 ℃ 20 s，72℃ 20 s，35 个循环；然后 72 ℃延
伸 5 min。
PCR产物经电泳后与大肠杆菌pEASY-1 载体连接，转化pEASY-1，接种于含有氨苄西林
（Aampicillin，AMP）的LB培养基平板，37 ℃过夜培养，挑取单菌落白斑接种于含有AMP的LB培
养基，37 ℃培养过夜培养。克隆经PCR鉴定后送广州英骏公司测序。
1.3 标准品cRNA的制备
以总 RNA 为模板采用有 T7 启动子修饰引物 T3-T7-4F 和 T3-4R 进行 RT-PCR，扩增的产物经电
泳、切胶回收后，用 T7 体外转录试剂盒（TOYOBO）进行体外转录合成 cRNA，并用 RNase-Free
DNaseⅠ对 cRNA 进行纯化。用分光光度计测定其纯度和浓度，测定 A260 值，计算 cRNA 纯度，参
考公式计算拷贝数（Fronhoffs et al.，2002），拷贝数 = 6.02 × 1023（拷贝 · μL-1）× RNA 浓度（g · μL-1）
/质量 MW（g · mol-1）。其中：MW = RNA 碱基数（bp）× 330 D/bp，经计算得 cRNA 拷贝数为 2 × 1013
拷贝 · μL-1。
1.4 实时荧光定量RT-PCR条件的优化及体系的确定
1.4.1 引物浓度的优化
以 2 × 101 ~ 2 × 109 拷贝 · μL-1 cRNA 标准品为模板，设定不同浓度（500、400、300、200、100
nmol · L-1）进行实时荧光定量 RT-PCR，观察不同引物浓度下的扩增效率和溶解曲线。
1.4.2 退火温度的优化
以 2 × 108 拷贝 · μL-1cRNA 标准品为模板，分别检测以 65、64.5、63.3、61.4、58.9、57.1、55.8
和 55 ℃为退火温度时荧光信号的变化，选取 Ct 值最小且扩增曲线最好的温度。
1.4.3 标准曲线的建立
将标准品 cRNA 用 TaKaRa 的 EASY Dilution（D9160A）按 10 倍梯度稀释为 2 × 101 ~ 2 × 109
拷贝 · μL-1 9 个梯度，分别以此为模板，在优化条件下进行荧光定量 PCR 检测，每一浓度设定 3 个
技术重复，同时设定阴性对照、空白对照和阳性对照。反应体系含 SYBR GreenⅠ的 qPCR Mix
（TaKaRa，中国）10 μL、10 μmol · L-1 正反向引物 0.2 μL，cDNA 1 μL 和 ddH2O 8.6 μL；荧光定量
PCR 扩增条件：95 ℃预变性 30 s，95 ℃ 5 s，63 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，40 个循环，仪器（iCyler IQTM，
Bio-Rad，美国）自动生成标准曲线。
1.5 实时荧光定量RT-PCR反应体系的验证
1.5.1 实时荧光定量 RT-PCR 的特异性试验
分别以柑橘裂皮病毒（Citrus exocortis viroid，CEVd）、柑橘碎叶病毒（Citrus tatter leaf virus，
CTLV）和 T36、T30、VT、T3 基因型 CTV 分离株总 RNA 为模板，进行实时荧光定量 RT-PCR，检
测本体系的特异性。
1.5.2 实时荧光定量 RT-PCR 的灵敏性试验
以 10 倍梯度的 2 × 101 ~ 2 × 109 拷贝 · μL-1 cRNA 为模板分别进行常规 RT-PCR 和实时荧光定量
RT-PCR，比较这两种方法的灵敏性。



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1.5.3 实时荧光定量 RT-PCR 的重复性试验
以 10 倍梯度的 2 × 104 ~ 2 × 108 系列浓度的标准品 DNA 为模板，每个稀释度 3 个重复，进行实
时荧光定量 RT-PCR，并重复进行 3 次试验，获得 Ct 值、标准差（SD）和变异系数（CV）。
1.6 田间样品CTV T3 基因型相对含量检测
以柑橘 FBOX 基因作为内参基因（Mafra et al.，2012）进行校正，对田间样品 T3 基因型 CTV
进行相对定量检测，反应体系 qPCR Mix 10 μL，10 μmol · L-1 正反向引物 0.2 μL，cDNA 1 μL 和 ddH2O
8.6 μL，在实时荧光定量 PCR 仪上进行反应。反应程序：95 ℃预变性 30 s，95 ℃ 5 s，63 ℃ 15 s，
72 ℃ 20 s，40 个循环，每个处理 3 个重复。仪器附带软件根据设定参数自动计算出 Ct 值，设 Ct
值最多样品 T3 基因型 CTV 的含量为 1，实时定量 RT-PCR 采用 2-ΔΔCt 法进行相对含量计算。
2 结果与分析
2.1 RT-PCR扩增与克隆鉴定
以感染 T3 基因型 CTV 的柑橘 RNA 为模
板，用T3-4F/R引物对ORF1a片段进行RT-PCR
扩增，扩增产物经 2%的琼脂糖凝胶电泳，阳
性对照均能扩增出 1 条大小为 143 bp 的特异性
条带，阴性对照无特异性扩增（图 1）。将检测
阳性的 PCR 产物克隆后送英骏公司测序，序列
在 NCBI 经 Blast 分析，与 T3 基因型 CTV
（KC525952）序列同源性为 100%，由此确定
扩增片段的正确性。







图 1 目标片段 RT-PCR 琼脂糖凝胶电泳图
M：100 bp 分子量 marker；1 ~ 5：阳性样品；
6：阴性对照；7：水对照。
Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR product
M：100 bp DNA marker；1–5：Positive control；
6：Negative control；7：Water. 2.2 实时荧光定量RT-PCR条件的优化和反应
体系的确定
2.2.1 引物浓度
用 500、400、300、200 和 100 nmol · L-1 不同浓度的引物进行实时荧光 RT-PCR，比较相对荧光
强度和 Ct 值大小。发现引物浓度为 100 nmol · L-1 时，相对荧光强度最高，Ct 值最小，扩增效率 97.1%，
R2 = 0.992。因此，选择 100 nmol · L-1 的引物为该体系引物浓度。
2.2.2 退火温度
设引物浓度为 100 nmol · L-1 对退火温度 55 ~ 65 ℃进行最适选择。当退火温度在 63.3 ℃时，相
对荧光强度最高，Ct 值最小，此温度时的熔解曲线为单一峰。因此，选择 63 ℃作为该体系的退火
温度。
2.3 实时荧光定量RT-PCR反应体系的验证
2.3.1 特异性
分别以 CEVd、CTLV 和 T36、T30、VT、T3 基因型 CTV 的总 RNA 为模板，进行实时定量 RT-PCR
检测，结果表明只有 T3 基因型 CTV 有扩增，其它均无扩增（图 2）。

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图 2 特异性检测结果
Fig. 2 Specific test

2.3.2 实时荧光定量 PCR 与普通 PCR 灵敏度比较
将 cRNA 标准品用 TaKaRa 的 EASY Dilution（D9160A）按 10 倍梯度制成拷贝数为 2 × 101 ~ 2 ×
109 拷贝 · μL-1 的 cRNA，进行荧光定量 PCR 检测及普通 PCR 检测。结果显示：实时荧光定量 PCR
能检测到 2 × 101 拷贝 · μL-1 的 cRNA（图 3）；而普通 PCR 只能检测到 2 × 103 拷贝 · μL-1 的 cRNA
（图 4）。这表明实时荧光 PCR 检测比普通 PCR 检测的灵敏度高 100 倍。



图 3 不同浓度拷贝数 · μL-1cRNA 的 real-time RT-PCR 扩增曲线
Fig. 3 Amplification plots of real-time RT-PCR using cRNA samples at different
diluted concentration copies · μL-1



图 4 不同浓度 cRNA 的普通 RT-PCR 电泳图
Fig. 4 Agarose gel electrophoresis of RT-PCR product using cRNA samples at
different diluted concentrations

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2.3.3 重复性检测结果
据扩增曲线及统计学分析结果各梯度组内重复检测的变异系数最大为 0.57%，表明该方法具有
较好的组内重复性。组间重复性试验结果（表 1）显示，各梯度的变异系数最大为 2.94%，表明该
方法具有较好的组间重复性。

表 1 重复性试验结果
Table 1 The result of reproducibility
组内重复
Reproducibility test of intra-assay
组间重复
Reproducibility test of extra-assay
cRNA 浓度/
（拷贝 · μL-1）
Concertration Ct 平均值
Mean Ct value
标准差
SD
变异系数/%
CV
Ct 平均值
Mean Ct value
标准差
SD
变异系数/%
CV
2 × 104 29.08 0.07 0.24 29.01 0.19 0.65
2 × 105 24.66 0.14 0.57 24.71 0.23 0.93
2 × 106 21.07 0.03 0.14 21.07 0.25 1.19
2 × 107 17.03 0.02 0.11 17.19 0.27 1.57
2 × 108 13.87 0.05 0.36 13.59 0.40 2.94

2.4 田间甜橙中T3 基因型CTV的相对含量检测
以柑橘 FBOX 基因为内参基因，应用建立
的实时荧光定量 RT-PCR 体系对田间样品进行
相对定量分析。根据不同样品 T3 和 FBOX 基
因 Ct 值高低选择，设含 T3 基因型 CTV 最多
的样品含量为 1，计算其它样品相对含量。
表 2 实时荧光定量 RT-PCR 检测 T3 基因型 CTV 含量
Table 2 Detection and quantitation of T3 genotype of Citrus
tristeza virus isolate
样品号
Sample
number
T3 Ct平均值
Mean T3 Ct
value
FBOX Ct 平均值
Mean FBOX Ct
value
T3 相对含量
T3 relative
content
1 15.23 24.61 1
2 16.48 21.59 0.422 ± 0.074
3 18.89 21.45 0.008 ± 0.002
4 16.58 21.02 0.392 ± 0.077
5 18.31 20.73 0.118 ± 0.026
6 21.40 19.99 0.014 ± 0.008
7 17.77 20.16 0.172 ± 0.049
8 18.48 19.82 0.106 ± 0.018
9 17.24 20.36 0.249 ± 0.103
10 18.35 24.04 0.115 ± 0.017
11 16.20 23.68 0.511 ± 0.042
12 15.82 23.34 0.665 ± 0.204
13 19.39 23.90 0.056 ± 0.025
14 17.52 21.25 0.204 ± 0.045
15 19.99 20.31 0.037 ± 0.008

结果（表 2）表明，不同样品中，T3 基因
型 CTV 的相对含量存在显著差异，最低相对含
量为 0.008。
3 讨论
本研究中建立了 T3 基因型 CTV 分离株的
实时荧光定量 RT-PCR 检测方法。
目前已经报道了运用 real-time RT-PCR 检
测不同木本植物和昆虫媒介携带病毒（Marbot
et al.，2003；Schneider et al.，2004；Olmos et al.，
2005；Osman & Rowhani，2006；Osman et al.，
2007），并已经有运用实时荧光定量 RT-PCR 研究 CTV 不同分离株相关文献报道。Ruiz-Ruiz 等（2007）
用 TaqMAN 探针区分 CTV 株系，但是该方法不能将所有强毒株和弱毒株区分。Ananthakrishnan 等
（2010）对 T36、VT 和 T30 基因型 CTV 分离株设计引物运用 TaqMAN 探针检测其在柑橘体内相对
表达量。中国田间主要以 T3、VT 两种基因型 CTV 分离株引起的茎陷点症状为主（Zhou et al.，2013）。
目前只有 T36、T30、VT 基因型 CTV 的实时检测方法，尚无 T3 基因型 CTV 的检测方法。因此建
立 T3 基因型的实时 PCR 体系对保障中国柑橘产业安全显得尤为重要。

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由于 CTV 的 ORF1a 区域位于 5′端非翻译区（Untranslated Regions，UTR），该区域较 3′端的 UTR
区变异大，5′端 UTR 区相似性不足 70%，能很好地区别 T36、T30、VT 基因型 CTV 分离株，此外，
CTV 的 ORF1a 不会产生亚基因组 RNA 和缺损 RNA，因此以其为靶标设计引物，可以更好地反映
T3 基因型 CTV 分离株在柑橘中的含量。
本研究建立的实时荧光定量 RT-PCR 检测体系可特异性检测 T3 基因型 CTV 分离株。在以 cRNA
作为标准品时相关性系数（R2）为 0.992，扩增相率（E）为 97.1%，Ct 值与其拷贝数呈良好的线性
关系，说明该体系具有较好的检测效率，真实可靠。该体系比普通 RT-PCR 方法灵敏度高 100 倍，
可以准确有效检测柑橘中 T3 基因型 CTV 分离株含量，从而更准确灵敏检测地田间样品中的 T3 基
因型 CTV，对确保柑橘产业安全健康发展具有重要的战略意义。
田间柑橘植株内 CTV 的基因型多且复杂，一般是混合基因型存在。本研究中检测出同一品种甜
橙植株体内的 T3 基因型 CTV 的含量存在着显著差异，最低相对含量为 0.008，最高为 1，出现如此
大的差异可能是其他基因型的 CTV 含量较高，T3 含量减少，或毒源植株中 CTV 分布不均匀所致。
通过熔解曲线、标准曲线的扩增效率及灵敏性验证结果表明本研究中建立的 SYBR Green 的实
时荧光定量 RT-PCR 检测体系灵敏、准确，比普通 RT-PCR 的灵敏性高 100 倍。该方法不仅能准确
检测柑橘中 T3 基因型 CTV 分离株，还可测定其在植株体内的相对含量，为以后遗传多样性研究及
监测不同基因型 CTV 的流行奠定一定基础。

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