全 文 ：园艺学报，2016，43 (1)：55–60.
Acta Horticulturae Sinica
doi：10.16420/j.issn.0513-353x.2015-0482；http：//www. ahs. ac. cn 55
柑橘品种对不同基因型柑橘衰退病毒的抑制及
变异的影响
唐 萌，金 鑫，周常勇，李中安，陶珍珍，周 彦*
（西南大学柑橘研究所，中国农业科学院柑橘研究所，国家柑橘工程技术研究中心，重庆 400712）
摘 要：为研究不同柑橘品种对柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）不同基因型的抑制效果，
将 T36、T30、VT 和 T3 等基因型 CTV 的毒源分别接种于‘赛蒙斯’甜橙、‘邓肯’葡萄柚、‘墨西哥莱
檬’和‘强徳勒柚’，运用 RT-qPCR 技术检测被接种植株中 CTV 复制水平的差异。结果表明，‘墨西哥莱
檬’最适于 CTV 各基因型的复制。‘邓肯’葡萄柚中 VT、T3 和 T36 基因型的复制水平最低。4 种柑橘品
种对 T36 基因型 CTV 都有明显的抑制作用。通过对 CTV 的 CP 基因进行分析发现，VT 基因型 CTV 在‘赛
蒙斯’甜橙中发生了较大变异。
关键词：柑橘；品种；柑橘衰退病毒；基因型；RT-qPCR；序列分析
中图分类号：S 666 文献标志码：A 文章编号：0513-353X（2016）01-0055-06

Suppression and Sequence Variation of Citrus tristeza virus Genotypes by
Citrus Cultivars
TANG Meng，JIN Xin，ZHOU Chang-yong，LI Zhong-an，TAO Zhen-zhen，and ZHOU Yan*
（Citrus Research Institute，Southwest University，Chinese Academy of Agricultural Sciences，National Citrus Engineering
Research Center，Chongqing 400712，China）
Abstract：For the preliminary study on the suppression of Citrus tristeza virus（CTV）genotypes by
different citrus cultivars. Four genotypes of CTV were graft-inoculated to‘Symons’Sweet orange，
‘Mexican Lime’，‘Duncan’grapefruit and‘Chandler Pummelo’. The results of RT-qPCR showed that
‘Mexican Lime’was most suitable for the survival of these four CTV genotypes. The cope levels of VT，
T3 and T36 genotypes in‘Duncan’grape fruit were much more lower than in other citrus cultivars.
Furthermore，T36 genotype was reduced significantly by all of the citrus cultivars. Sequence analysis
indicated that CP gene of VT genotype had frequent mutation in sweet orange.
Key words：Citrus；cultivar；Citrus tristeza virus；genotype；RT-qPCR；sequence analysis

柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）引起的柑橘衰退病是柑橘重要病害之一，可侵染大
多数柑橘种及其近缘种（Bar-Joseph et al.，1989）。由于 CTV 在田间以蚜虫传播为主，且蚜虫发生
世代多、传毒率高，因此通过使用无病毒苗木或防治蚜虫来防治柑橘衰退病效果不明显。目前的研

收稿日期：2015–09–25；修回日期：2016–01–18
CSTC2015JCYJBX0043基金项目：重庆市两江学者项目；重庆市基础与前沿研究计划重点项目（ ）；中央高校基本科研业务费项目
（XDJK2015A009）；重庆市应用开发计划项目（CSTC2014YYKFA8005）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhouyan@cric.cn）
Tang Meng，Jin Xin，Zhou Chang-yong，Li Zhong-an，Tao Zhen-zhen，Zhou Yan.
Suppression and sequence variation of Citrus tristeza virus genotypes by citrus cultivars.
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究证明，运用交叉保护技术，即在无病毒柑橘上预免疫接种有保护作用的弱毒株，是防治衰退病最
有效的方法（Zanutto et al.，2013）。CTV 存在复杂的株系分化现象，根据其生物学性状的差异，以
及 5′序列的差异，CTV 被分为了 T36、T30、T3、VT 和 B165 等 5 种基因型（Hilf et al.，2005），其
中 T36、T30、T3、VT 是中国 CTV 的主要基因型（Zhou et al.，2007）。T36 基因型的 CTV 分离株
主要引起酸橙（Citrus aurantium）、葡萄柚（C. paradisi）实生苗的速衰症状，T3 和 VT 基因型的 CTV
分离株主要引起甜橙（C. sinensis）、柚类（C. grandis）等植株的茎陷点、植株矮化、果实变小、品
质降低症状，B165 基因型主要为害枳及其杂种，T30 基因型为弱毒株（Harper et al.，2009；Roy &
Brlansky，2010）。目前对 CTV 产生症状及其差异的分子机理仍不清楚（Dawson et al.，2013）。此
外，前期研究还显示，混有多基因型的 CTV，其构成在不同类型的寄主中会发生变化，但不清楚是
寄主对CTV基因型的抑制效果还是CTV各基因型间的相互作用造成了这一现象（Zhou et al.，2013）。
由于寄主与 CTV 的互作关系可能引发交叉保护中存在的品种专化性，及其在植株上的症状有差异，
为此，本研究中以 T36、T30、T3 和 VT 等中国主要的 4 种 CTV 基因型为切入点，研究柑橘品种和
基因型 CTV 的互作，从而明确不同品种对不同基因型 CTV 的影响，以期进一步了解 CTV 与寄主的
相互作用。
1 材料与方法
1.1 供试材料
所用 T36、T30、VT、和 T3 基因型 CTV 分离株由美国佛罗里达大学柑橘研究与教育中心
William Dawson 教授赠送。上述单基因型 CTV 分离株毒源保存在‘赛蒙斯’甜橙[Citrus sinensis（L.）
Osbeck. Symons]上，2014 年 4 月分别嫁接于西南大学柑橘研究所提供的无病毒‘赛蒙斯’甜橙、‘邓
肯’葡萄柚（C. paradisi Macf. Duncan）、‘墨西哥莱檬’[C. aurantifolia（Christm）Swing.‘Mexican
Lime’]和‘强徳勒柚’[C. grandis（L.）Osbeck. Chandler Pummelo]实生苗。每株实生苗嫁接接种
3 块 0.5 cm × 2 cm 毒源植株的皮。每个毒源在每个柑橘品种上重复 5 次。为保证试验条件的一致性，
植株接种后放置于 24 ~ 28 ℃的温室中备用。试验期间保持土壤湿润，水、光照、管理等一致。
接种 12 个月后，参照 Garnsey 等（1993）的方法对新梢进行 DTBIA 检测，并在确认感染 CTV
的植株中每个品种选取 3 株长势一致的植株进行总核酸提取。
1.2 总核酸提取
从阳性植株的 5 个不同方向分别选取总共 30 mg 嫩叶，混合后按照 RNAiso plus（TaKaRa，日
本）说明书的方法抽提总核酸，并重复 3 次。通过 1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测总核酸的完整性，并
使用 SmartSpecTM Plus 型分光光度计（Bio-Rad，美国）测定其浓度及纯度。为避免反复冻融，获得
的总核酸分装后在–20 ℃下保存备用。
1.3 CP基因的扩增与序列分析
参照 Gillings 等（1993）的方法，采用特异性引物 CP-F（5′-ATGGACGACGAAACAAAG-3′）
和 CP-R（5′-TCAACGTGTGTTGAATTT-3′）进行 RT-PCR 扩增。扩增产物经切胶纯化后连接于
pMD19-T 载体（TaKaRa，日本），并转化受态细胞 DH5α（BioMed，中国）。选取阳性克隆送上海
英潍捷基贸易有限公司测序。测序结果用 MEGA 4.0 软件进行分析。
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1.4 RT-qPCR检测及数据分析
参照李玲娣等（2013）的方法，采用特异性引物 HD-F（5′-CGAGTCTGGGGTAGAAGTAACG
A-3′）、HD-R（5′-GGTCAAGAATCTGCACAGG-3′）和 Mafra 等（2012）的内参引物 FBOX-F（5′-TTGGA
AACTCTTTCGCCACT-3′）、FBOX-R（5′-CAGCAACAAAATACCCGTCT-3′）合成 cDNA，5 μL 反
转录体系包括 ddH2O 0.3 μL，总 RNA 模板 2.5 μL，10 mmol · L -1 dNTP 0.5 μL，5 × RT-Buffer 1 μL，
10 mmol · L -1 反向引物 0.25 μL，RNAsin（Toyobo，日本）0.2 μL，RTase（Toyobo，日本）0.25 μL，
42 ℃反转录 20 min，94 ℃ 1 min。
反转录结束后以 cDNA 1 μL为模板进行25 μL的qPCR反应，体系包括2 × SYBR Green Supermix
（Promega，美国）12.5 μL，10 mmol · L -1 正向和反向引物各 0.6 μL，ddH2O 10.3 μL。qPCR 反应
条件为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s ，60 ℃ 15 s ，72 ℃ 20 s，在 72 ℃采集荧光信号，36 个循环。
每个样品 3 次重复，仪器经 iQ5 软件（Bio-Rad，美国）根据设定参数自动计算出 Ct 值，实时定量
RT-PCR 反应结束后，以柑橘 FBOX 基因作为内参基因进行校正，并采用 2-ΔΔCt 方法（Livak &
Schmittgen，2001）计算 CTV 在不同柑橘品种中的复制水平。
采用 Excel 2003 和 SPSS18.0 软件分析各基因型 CTV 在不同柑橘品种中的复制水平是否存在显
著性差异。
2 结果与分析
2.1 CP基因的扩增与序列分析
接种 12 个月后，接种的树皮全都存活，且所有被接种的品种的 DTBIA 检测都为阳性。通过 1.5%
的琼脂糖凝胶电泳检测显示，柑橘各样品 RNA 电泳图谱 28S、18S 带型清晰。经分光光度计测定后，
获得的 RNA 为 400 ~ 600 μg · mL-1，纯度为 A260/A280 = 1.77 ~ 1.85。











图 1 RT-PCR 扩增产物电泳图
Fig. 1 Electrophoresis of RT-PCR product
M：Marker；1：RT-PCR product.
获得的总核酸经 RT-PCR 扩增后均能产生 672 bp 的条带，与已知 CTV CP 基因大小一致（图 1）。
PCR 产物经克隆、测序后，分别与 T36（EU937521.1）、T30（EU937520.1）、VT（KC517494.1）和
T3 分离株（KC525952.1）的 CP 基因进行序列比对，T30 和 T3 基因型嫁接接种后，其 CP 基因分
别出现了 1 ~ 3 个位点的变化，且第 660 位碱
基均发生了由 T 变为 C 的同义替换。T36 基因
型在不同品种上也分别出现了 1 ~ 2 处同义替
换。VT基因型接种后其CP基因变化较为复杂，
其接种于‘赛蒙斯’甜橙后出现了 48 处变异，
其中最主要的由 G 变为 A（14 处），T 变为 C
（13 处）和 C 变为 T（12 处），且以同义突变
为主。VT 基因型接种于‘强徳勒柚’、‘邓肯’
葡萄柚和‘墨西哥莱檬’后的变异较少，且都
为 T 变为 C 的同义突变，以及 G 变为 A 的非
同义突变。
2.2 CTV 4 种基因型在相同品种内的复制水平
经看家基因校正后的结果（表 1）显示，接种于相同柑橘品种的 4 种 CTV 基因型的复制水平差

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异显著（P < 0.05）。‘强徳勒柚’中 VT 基因型的复制水平均高于其他 3 种基因型，‘墨西哥莱檬’
中 T3 基因型的复制水平最高，且 T3 和 VT 基因型的复制水平不存在显著差异。‘赛蒙斯’甜橙中
的 VT 与 T3 和‘邓肯’葡萄柚中 VT 和 T30 基因型的复制水平间也不存在显著差异。‘强徳勒柚’
中各基因型的复制水平都存在显著性差异（P < 0.05）。T36 在所用 4 种柑橘品种中受到明显的抑制
作用，其复制水平最低（P < 0.05）。

表 1 CTV 不同基因型在柑橘品种内的复制水平
Table 1 The copy levels CTV genotypes in the citrus cultivars
CTV 基因型
Genotype of CTV
‘强徳勒柚’
‘Chandler Pummelo’
‘墨西哥莱檬’
‘Mexican Lime’
‘赛蒙斯’甜橙
‘Symons’sweet orange
‘邓肯’葡萄柚
‘Duncan’grapefruit
T36 0.0086 ± 0.0010 d B 0.0356 ± 0.0025 c A 0.0109 ± 0.0028 c B 0.0022 ± 0.0002 c C
T30 0.0517 ± 0.0098 b B 0.4487 ± 0.0329 b A 0.0589 ± 0.0050 b B 0.0530 ± 0.0372 a B
T3 0.0397 ± 0.0122 c C 1.7454 ± 0.1799 a A 0.6554 ± 0.0837 a B 0.0132 ± 0.0036 b D
VT 0.2091 ± 0.0233 a C 1.3766 ± 0.1899 a A 0.7357 ± 0.2033 a B 0.0608 ± 0.0051 a D
注：小写字母表示在相同品种中的差异显著性（P < 0.05）；大写字母表示在不同品种中的差异显著性（P < 0.05）。
Note：Small letters indicate significant difference in same citrus cultivar（P < 0.05）；Big letters indicate significant difference in same CTV
genotype（P < 0.05）.

2.3 CTV同一基因型在 4 种品种内的复制水平
T36、T3 和 VT 基因型的复制水平在‘墨西哥莱檬’中最高，其次为‘赛蒙斯’甜橙、‘强徳勒
柚’和‘邓肯’葡萄柚（表 1）。VT 基因型在‘墨西哥莱檬’中的复制水平是其在‘邓肯’葡萄柚
的 22.6 倍。T3 和 VT 基因型在 4 种柑橘品种中的复制水平都存在显著性差异（P < 0.05）。T30 基因
型的复制水平在‘墨西哥莱檬’中最高，其次依次为‘赛蒙斯’甜橙、‘邓肯’葡萄柚和‘强徳勒柚’，
且其在‘强徳勒柚’、‘赛蒙斯’甜橙和‘邓肯’葡萄柚中的复制水平不存在显著性差异。
3 讨论
将 CTV 分离株接种于不同的柑橘类型时，其 dsRNA 构成、血清学特性、CP/HinfⅠ组群构成、
SSCP 谱型以及致病力等方面可能会发生改变（王志刚 等，2007；周彦 等，2007）。早期的研究认
为，CTV 不同株系在植株中的分布不均是造成这一现象的主要原因（Ayllon et al.，1999）；后来的
研究显示，CTV 在不同类型柑橘上的适应性存在差异，甜橙适于 CTV 各基因型的增殖，而枳柚对
T30 和 T36 基因型存在明显的抑制现象（Weng et al.，2010；Zhou et al.，2013）。由于前期研究中均
以混合基因型的 CTV 分离株作为研究对象，因此无法区分是寄主与 CTV 基因型的相互作用，还是
各 CTV 基因型间的相互干扰造成了不同柑橘品种中 CTV 基因型复制水平出现的差异。为此，本研
究中选用单基因型 CTV 进行研究。此外，由于接种后植株放置于 24 ~ 28 ℃的温室中保存，因此 CTV
在植株中的分布和含量不会因时间变化而发生明显的波动（Bar-Joseph et al.，1989；Moreno et al.，
2008）。故本研究中只在 2015 年 4 月植株统一抽梢时从阳性植株的不同方向进行重复取样检测。检
测的结果进一步证实柑橘品种对 CTV 基因型复制水平的影响十分明显，其中‘墨西哥莱檬’较适于
CTV 各基因型的增殖，‘赛蒙斯’甜橙则对 T30 基因型有较强的抑制效果。此外，本研究中选用的
4 种柑橘品种对 T36 基因型都表现出了显著的抑制效果，作为已知进化速度最慢的植物病毒（Silva et
al.，2012），CTV 在不同寄主中都具有极强的稳定性，因突变、重组造成序列丢失或生物学性状改
变的概率很低（Weng et al.，2007）。相同的 CTV 分离株在不同环境条件下经过 100 多年的独立演
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化，其基因组仍保持一致（Albiach-Martí et al.，2000）。本研究中虽然 T3、T30 和 T36 基因型嫁接
接种于‘墨西哥莱檬’、‘赛蒙斯’甜橙、‘强徳勒柚’和‘邓肯’葡萄柚后其 CP 基因几乎没有发生
变化，但 VT 基因型嫁接接种于‘赛蒙斯’甜橙后其 CP 基因发生了较大的变化，这可能也与寄主
品种与 CTV 基因型的互作有关。
本研究的结果还显示，‘墨西哥莱檬’、‘赛蒙斯’甜橙和‘强徳勒柚’中 CTV 各基因型的复制
水平与植株对 CTV 的抗性呈负相关性，这与先前的研究结果（Ruiz-Ruiz et al.，2007）相符。但在
敏感品种‘邓肯’葡萄柚中 T36、T3 和 VT 基因型的复制水平最低，且‘邓肯’葡萄柚中 T30 基因
型的复制水平也仅略高于抗性品种‘强徳勒柚’。造成这一现象的原因可能是 CTV 强毒株在植株中
引发的症状不仅与其复制水平有关，也与其侵染植株后诱导寄主产生的超敏反应等免疫应答有关
（Maria et al.，2010）。
国外经验表明，交叉保护是防治柑橘衰退病最有效的方法，近年的研究也首次证实，只有在相
同基因型的 CTV 间才会发生交叉保护作用（Folimonova et al.，2010；Olivier & Pietersen，2014），
并且已陆续在 T36 等原先认为只有强毒株的基因型中发现了致病力较弱的株系（Lee & Keremane，
2013），因此掌握不同柑橘品种对 CTV 基因型的相互作用，将为今后进一步开展交叉保护防治柑橘
衰退病提供重要的技术支持。

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