全 文 ：园 艺 学 报 2011，38（11）：2193–2198 http: // www. ahs. ac. cn
Acta Horticulturae Sinica E-mail: yuanyixuebao@126.com
收稿日期：2011–07–01；修回日期：2011–10–24
基金项目：国家自然科学基金项目（30771485）；教育部创新团队项目（IRT0976）；行业公益项目（200903004）；重庆市自然科学基金
项目（2008BB1270）
* 通信作者 Author for correspondence（E-mail：zhoucy@swu.edu.cn）
应用 real-time RT-PCR 监测柑橘衰退病毒强、
弱毒株的时序变化
邹 勤 1,2，周 彦 1，李中安 1，周常勇 1,2,*，刘永清 2，苏华楠 2
（1 中国农业科学院柑桔研究所国家柑桔工程技术研究中心，重庆 400712；2 西南大学植物保护学院，重庆 400716）
摘 要：使用褐色橘蚜在提前 7 个月预免疫接种了柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）弱毒株
CT11 的锦橙植株上拮抗接种强毒株 CT14，应用 real-time RT-PCR 技术，监测供试植株中 CTV 强、弱毒
株的含量变化，同时采用内参基因 18S rRNAF/R 及 nad5F/R 校正检测结果。试验结果表明，在拮抗接种
3 个月内始终未能在预免疫的拮抗植株中检测出强毒株 CT14。在 25 头蚜虫拮抗接种后 45 d 和 50 头蚜虫
拮抗接种后 10 d，绝大多数预免疫的拮抗植株中弱毒株的含量高于预免疫的负对照植株，此后弱毒株的
含量基本下降到负对照植株的水平，而负对照植株内弱毒株的含量变化不明显。
关键词：柑橘；柑橘衰退病毒；real-time RT-PCR；弱毒株交叉保护
中图分类号：S 666；S 432.4+1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X（2011）11-2193-06

Monitoring the Temporal Change of the Mild and Severe Strain of Citrus
tristeza virus by Real-time RT-PCR
ZOU Qin1,2，ZHOU Yan1，LI Zhong-an1，ZHOU Chang-yong1,2,*，LIU Yong-qing2，and SU Hua-nan2
（1National Citrus Engineering Research Centre，Citrus Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，
Chongqing 400712，China；2College of Plant Protection，Southwest University，Chongqing 400716，China）
Abstract：Jincheng sweet orange seedlings were pre-inoculated with CTV mild isolate CT11 by
grafting，and seven months later，challenged by severe CTV isolate CT14 with Toxoptera citricida. To
identify and quantitate the mild and severe CTV isolates within the same plant，a real-time RT-PCR
technique was modified and housekeeping genes 18S rRNAF/R and nad5F/R were approached for
rectification. The results showed that CT14 was not detectable in any challenge-inoculated plants three
months after CT14 attacked through aphids. The titer of CT11 in most samples of the plants
challenge-inoculated via 25 or 50 aphids per plant was higher than that in the pre-immunized control plants
on the 45th or 10th day，respectively，then decreased to the same level of the pre-immunized control，
whereas the titer of the mild isolate in the pre-immunized control plants was much stable.
Key words：Citrus；Citrus tristeza virus；real-time RT-PCR；mild strain cross protection

柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus，CTV）引起的柑橘衰退病是世界柑橘产区的严重病害

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（Moreno et al.，2008）。中国大量种植的优质甜橙和柚类对茎陷点型衰退病敏感，同时中国普遍存
在传毒力最强的褐色橘蚜（Toxoptera citricidus），因此柑橘茎陷点型衰退病对中国柑橘产业的危害
日趋严重。
虽然弱毒株交叉保护技术已在巴西、澳大利亚和南非等国广泛应用于防治茎陷点型柑橘衰退
病，并且中国已证明 CT11、CT9 等多个弱毒株对重庆田间主要的 CTV 茎陷点型强毒株 CT14 具有
较好的拮抗作用（周彦，2007；周彦 等，2008），但保护机理还不清楚，弱毒株诱导的基因沉默可
能参与了这一过程（Zhou，2001；Loebenstein & Carr，2006）。近年来，real-time RT-PCR 技术已开
始应用于 CTV 的检测（Ruiz-Ruiz et al.，2007，2009；刘红光 等，2008；Saponari et al.，2008），
而掌握植株中强、弱毒株的时序变化将有助于了解交叉保护防治衰退病的机理。本研究以 CTV 基因
组 5′端的 K17 区域为靶标，对植株中 CTV 强、弱毒株含量变化进行监控，以期掌握强、弱毒株互
作与交叉保护防治效果的关系。
1 材料与方法
1.1 毒源、植物材料及供试蚜虫
所用 CTV 强毒株 CT14、弱毒株 CT11，以及一年生锦橙无病毒实生苗和无毒褐色橘蚜的无翅
成蚜均由西南大学柑橘研究所提供，所有试材放置于温室（24 ~ 28 ℃）中备用。
1.2 弱毒株交叉保护试验
2008 年 9 月将 CTV 弱毒株 CT11 嫁接接种于一年生无毒锦橙实生苗。2009 年 5 月将无毒褐色
橘蚜在感染强毒株 CT14 的锦橙嫩梢上取食 24 h 获毒后，移至 10 株预免疫嫁接接种 CT11 的锦橙植
株嫩梢上，每株各放置 25 头获毒蚜虫，取食 24 h 后杀死蚜虫。正对照：无病毒锦橙实生苗上每株
喂食 25 头带毒褐色橘蚜 24 h；负对照：2008 年嫁接接种了弱毒株的实生苗，每株喂食 25 头无毒蚜
虫 24 h。
2010年 4月将 2008年预免疫嫁接接种CT11的 4株锦橙植株每株用 50头蚜虫接种强毒株CT14。
正对照：无病毒锦橙实生苗上每株喂食 50 头带毒褐色橘蚜 24 h；负对照：2008 年嫁接接种了弱毒
株的实生苗，每株喂食 50 头无毒蚜虫 24 h。所有供试植株保存于温室（24 ~ 28 ℃）。
1.3 总 RNA 提取
在 25 头蚜虫接种后 15、30、45、60 和 90 d，以及 50 头蚜虫接种后 10、20、30、40 和 60 d，
参考周常勇等（2001）和曹庆芹等（2005）的方法，分别取 5 ~ 10 mg 供试植株顶部树皮和叶片，
放入 1.5 mL eppendoff 离心管，在液氮上用小研磨棒磨碎后加入 100 μL Trizol（Invitrengen 公司），
室温放置 5 min 后依次加入 5 μL 3 mol · L-1，pH 5 的 KAc 缓冲液，30 μL 氯仿进行总 RNA 提取。
总 RNA 在–20 ℃下保存备用。
1.4 引物设计
根据 real-time RT-PCR 的引物设计要求，利用引物设计软件 Primer Premier 5 在 CTV 基因组 5′
端 ORF1b 的 K17 区域设计通用引物 ZQ2F/R，用于检测负对照和拮抗植株中的 CTV 含量（表 1）；
引物 TQ1/2 特异扩增 CTV 强毒株 CT14，不能扩增弱毒株 CT11 和阴性对照（于庆涛，2008）；引物
18S rRNAF/R（Brunner et al.，2004）和 nad5F/R（Menzel et al.，2002）用作内参，校正各样品中
CTV 的含量。
11 期 邹 勤等：应用 real-time RT-PCR 监测柑橘衰退病毒强、弱毒株的时序变化 2195

图 1 ZQ2 F/R 引物对的扩增效果
1 泳道为阴性对照，2 ~ 8 泳道为阳性样品，
M 为 100 bp 梯度 DNA 标准分子量。
Fig. 1 PCR profile of primer ZQ2F/R
Lane 1 is the negative control；Lanes 2–8 are the positive samples；
M：DNA marker with 100 bp ladders.
表 1 本试验所用引物的序列
Table 1 The sequences of the primers used in this study
引物
Primer
序列（5′–3′）
Sequences（5′–3′）
片段/bp
Length
参考文献
References
ZQ2F AACGGGGTGACCAAGAC 170
ZQ2R AACCGACACAGTTTAGTATAGC
TQ2 TCGTGTAATTTTTCCGACGAC 270 于庆涛，2008
TQ1 AAGCCCGACATCAAACACTT
nad5F GATGCTTCTTGGGGCTTCTTGTT 115 Menzel et al.，2002
nad5R GCGGATCCTCGGACATATATGA
18S rRNAF AATTGTTGGTCTTCAACGAGGAA 74 Brunner et al.，2004
18S rRNAR AAAGGGCAGGGACGTAGTCAA
1.5 real-time RT-PCR 体系
5 μL 反转录体系包括 ddH2O 2.23 μL，总 RNA 1 μL，10 mmol · L-1 dNTP 0.1 μL，5 × RT-Buffer l
μL，10 mmol · L-1 反向引物 0.25 μL，RNAsin（Toyobo，40 U · μL-1）0.2 μL，RTase（Toyobo，1 000
U · μL-1）0.22 μL，42 ℃反转录 30 min。
real-time PCR 反应体系包括 2 × SYBR Green Supermix（Bio-Rad 公司试剂盒）12.5 μL，10
mmol · L-1 正向和反向引物各 0.5 μL，cDNA 2 μL，ddH2O 9.5 μL。引物 TQ1/2 及 nad5F/R 的 PCR 反
应条件为：95 3 min℃ ；95 10 s℃ ，60 15 s℃ ，72 20 s℃ ，在 72 ℃采集荧光信号，40 个循环；最
后 72 ℃延伸 1 min。引物 18S rRNAF/R 和 ZQ2F/R 的退火温度分别为 60 ℃和 50 ℃。每个样品两个
技术重复。
1.6 扩增效率及数据分析
将 PCR 产物 10 倍梯度稀释后作为模板进行 real-time PCR，每个处理 2 个重复，从而验证各个
引物的扩增效率。测得的 Ct 值（threshold cycle，阈值循环数）经 Bio-Rad 的 iQ5 软件自动计算相对
表达量，其计算是根据纳入了各基因扩增效率的 Pfaffl 法（Livak & Schmittgen，2001；Pfaffl，2001）。
CTV 的相对表达量均经过两个内参基因 18S rRNAF/R 和 nad5F/R 共同进行校正。Ct 值大于 30 的样
品判定为阴性。
2 结果与分析
2.1 ZQ2F/R 引物的特异性和各引物的扩增效
率
引物 ZQ2F/R 的扩增产物为 170 bp（图 1）。
将其 PCR 产物的序列在 NCBI 中进行 BLAST
比对，其与 GenBank 中 CTV 序列的同源性最
高（97%）。在 real-time RT-PCR 检测时发现使
用引物 ZQ2 F/R 扩增生成的熔解曲线仅有单一
峰，而阴性对照不产生明显的峰值。由此确定
了该引物的特异性，用于检测植株中 CTV 的总
含量。使用 iQ5 软件分析发现，引物 nad5F/R、
18S rRNAF/R、TQF/R 和 ZQ2F/R 的扩增效率分别为 95.5%、96.0%、95.0%和 93.6%。
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2.2 2009 年 25 头橘蚜接种后供试植株中 CTV 含量的变化
正对照植株在接种后 15 d 即检测到强毒株 CT14，在接种后 60 d 时 4 株正对照植株的样品都可
以检测到 CT14，其中一半植株的嫩叶比嫩皮更早检测到 CTV。正对照植株中 CT14 含量达最大值
的时间不一致，接种后 30 ~ 90 d 不等。
褐色橘蚜拮抗接种预免疫植株之后10个月，所有10个拮抗接种的植株都未检测到强毒株CT14。
7 个拮抗接种的植株于接种后 15 ~ 45 d（共 3 次）分别进行准确定量，其中 3 个植株接种后 60 和
90 d 再进行两次准确定量。以褐色橘蚜拮抗接种后的预免疫植株 J1 在接种 15 d 的皮中弱毒株 CT11
的含量为对照，设相对表达量为 1，其它样品中弱毒株的相对表达量以对照的倍数表示。拮抗植株
J2、J3、J4 和 3 株负对照植株中弱毒株含量的时序变化见图 2。本试验中每个样品的两个技术重复
之间有很好的重复性，而同一处理不同植株间病毒含量差异较大。
分析发现，3 个负对照植株中弱毒株 CT11 的含量达到高峰的时间不一致，前 45 d 其含量普遍
较低。前 3 次监测的 7 株拮抗植株，大多数样品中弱毒株的含量在橘蚜接种后逐渐增加，到 45 d 其
含量达到最大值，高于负对照植株中弱毒株的含量。在橘蚜接种 45 d 以后拮抗植株中弱毒株的含量
下降或者与负对照植株中的含量差异不明显（图 2）。
图 2 树皮和叶内 CT11 的相对表达量的时序变化
J 为拮抗植株（实线）；CK 为负对照植株（虚线）。
Fig. 2 The relative expression levels of CT11 in the bark and leaf
J：The challenged plants（real line）；CK：The mock control（broken line）.
2.3 2010 年 50 头橘蚜接种后供试植株中 CTV 含量的变化
4 个正对照植株在 60 d 内全部感染了强毒株 CT14，预免疫接种了 CT11 的拮抗植株和负对照至
第 3 个月仍未检测到 CT14，空白对照一直不含 CTV。
4 个拮抗植株和 3 个负对照植株的皮内弱毒株含量变化见图 3。在拮抗接种强毒株 CT14 以后，
图 3 皮内 CT11 的相对表达量的时序变化
J 为拮抗植株（实线）；CK 为负对照植株（虚线）。
Fig. 3 The relative expression levels of CT11 in the bark
J：The challenged plants（real line）；CK：The mock control（broken line）.
11 期 邹 勤等：应用 real-time RT-PCR 监测柑橘衰退病毒强、弱毒株的时序变化 2197

拮抗植株顶部皮内弱毒株 CT11 在接种后 10 d 的含量很高，然后在 30 d 或 40 d 内存在下降趋势。而
负对照植株内病毒含量在 40 d 内变化不大。
3 讨论
本试验中拮抗植株未检测到强毒株 CT14，这说明弱毒株 CT11 起到了很好的拮抗作用。预免疫
植株在 25 头蚜虫接种后 45 d 和在 50 头蚜虫接种后 10 d，其绝大多数样品内弱毒株的含量高于预免
疫的对照，后期弱毒株的含量下降或者与预免疫的对照差异不大。这可能是由于蚜虫接种强毒株后
植株产生了应激反应，植株内弱毒株的含量相应迅速升高，从而抑制了强毒株的入侵或者增殖，后
期由于强毒株未能在植株内定植，其应激消失或强度降低，所以弱毒株的含量也随之降低。根据基
因沉默机理推测，预免疫的植株受到强毒株的侵染时，植株细胞内的 RdRp（依赖 RNA 的 RNA 聚
合酶）会增多，从而复制更多的小 RNA（Loebenstein & Carr，2006）。RdRp 增多，可能是本试验中
弱毒株含量升高的原因。
本试验中弱毒株交叉保护效果与前人的结果（Zhou，2001；周彦 等，2008）有一定差异。于
庆涛（2008）在接种了弱毒株 4 个月后用 25 头褐色橘蚜接种强毒株，5 个植株有 3 株感染了强毒株
CT14，可能是由于本试验中苗龄较大或是由于在接种弱毒株 7 个月后再接种的强毒株，延长预免疫
接种弱毒株的时间可提高保护效果（Wen et al.，1991）。
Trizol 法抽提的总 RNA 的浓度和纯度均较高（于庆涛 等，2007），因此本试验采用 Trizol 法进
行抽提。此外，为了保障试验的连续性，本研究中结合周常勇等（2001）的微量快速抽提方法取样
量少的优点，每次只取 5 ~ 10 mg 植物组织进行 RNA 提取。由于柑橘组织内含多糖较多，为了去除
多糖的干扰，在抽提过程中加入了 3 mol · L-1、pH 5 的 KAc 缓冲液（曹庆芹 等，2005）。此微量 Trizol
法能够稳定地抽提总 RNA，可应用于 real-time RT-PCR 检测。
选择稳定表达的内参基因是进行相对定量分析的关键。对于研究病毒在植物中的表达量，18S
rRNAF/R 在不同的环境条件下或者病毒侵染前后表现很好的稳定性（Jain et al.，2006）。由于没有
任何基因在不同组织或各种试验处理条件下其表达量维持恒定，所以最好使用多个内参基因进行校
正，检测结果才准确。本试验的另外一个内参基因 nad5F/R 具有扩增剪接后的 mRNA 的特点，从而
避免假阴性（Menzel et al.，2002）。本试验表明两个内参基因的表达基本稳定。
CTV 除含有基因组 RNA 外，在 3′端还具有许多不同的亚基因组双链 RNA，因此在比较 CTV
强弱毒株的含量时应针对同一区域进行分析。于庆涛（2008）在 CTV 基因组 5′端 ORF 1b 的 K17 区
域设计了特异扩增强毒株 CT14 的引物 TQ，然后用 3′端的通用引物扩增总的 CTV。本研究利用其
TQ 引物，然后在同一靶标 K17 区域设计了 ZQ2F/R 引物来检测植株中 CTV 的总量。
本研究结果将为研究 CTV 侵染机制，病毒与寄主互作及弱毒株交叉保护奠定一定的基础。今后
可以继续研究强弱毒株的含量变化与小 RNA 的含量变化之间的关系，从而为进一步揭示弱毒株交
叉保护机理奠定基础。

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