全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 43(5): 458-466(2013)
收稿日期: 2012-11-12; 修回日期: 2013-06-05
基金项目: 国家质检总局课题(2011IK175)
通讯作者: 朱天辉,教授,博导,主要从事林木病害研究; E-mail: zhuth1227@ tom. com
第一作者: 邵宝林,男,山东东营人,博士研究生,主要从事植物病害研究; E-mail: sbl0218@126. com。
猕猴桃溃疡病菌的分子检测技术研究
邵宝林1,2, 刘 瑶1, 朱天辉1*, 李姝江1
( 1四川农业大学林学院, 雅安 625014; 2 四川出入境检验检疫局, 成都 610000)
摘要:猕猴桃溃疡病是猕猴桃生产上的主要病害,为建立该病的快速诊断技术,本实验通过 RAPD 分析获得一条 1 300 bp
左右的致病菌的特异片段,对该片段进行克隆测序,在测序的基础上设计并合成一对特异引物 F7 / R7,优化特异引物扩增
条件,并验证引物的特异性和灵敏性。 利用该特异引物对包括猕猴桃溃疡病菌在内的 14 个菌株基因组 DNA进行 PCR扩
增表明,只有猕猴桃溃疡病菌能扩增出 1 条约为 950 bp的特异条带,其他菌株及对照均未扩增出特异条带。 对采自果园的
染病枝干组织和接种致病菌的枝干组织的检测表明,该特异引物能特异性地检测到猕猴桃溃疡病菌的存在,其在组织中的
检测灵敏度为 100 fg / μL。 因此,利用设计合成的特异引物 F7 / R7,参考优化的体系和程序,结合简单的试剂盒法提取猕猴
桃溃疡病菌或植物组织 DNA,可以在短时间内完成对该病原菌的分子检测。
关键词:猕猴桃; 溃疡病; RAPD; 特异引物; 丁香假单胞杆菌猕猴桃致病变种
Molecular detection of Pseudomonas syringae pv. actinidiae on bacterial canker of
kiwifruit　 SHAO Bao-lin1,2, LIU Yao1, ZHU Tian-hui1, LI Shu-jiang1 　 ( 1 College of Forestry, Sichuan Agri-
cultural University, Ya’an 625014, Sichuan, China; 2 Sichuan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau, Chengdu 610000,
China)
Abstract: Bacterial canker of kiwifruit is the main disease in kiwifruit production. In order to establish the rap-
id diagnostic technology, a 1 300 bp specific fragment was obtained and sequenced from pathogenic bacteria by
RAPD analysis. Based on the sequences of the specific fragments, a pair of specific primers(F7 / R7)was de-
signed and synthesized. Then, the amplification conditions were optimized and the specificity and sensitivity of
the specific primers were verified. After that the genomic DNA of 14 bacterial strains were amplified by the spe-
cific primer set. The results showed that a 950 bp band was only amplified from the strains of Pseudomonas sy-
ringae pv. actinidiae. In addition, detections for diseased kiwifruit trunk tissues collected from orchard and in-
oculated kiwifruit trunk indicated that the primers detected the existence of Pseudomonas syringae pv. actinidi-
ae. The detection sensitivity of the primer set was 100 fg / μL in the fresh weight. Therefore, using the specific
primer F7 / R7 under the optimized PCR reaction conditions, combined with the simple method of reagent kit for
DNA extraction, the molecular detection for the pathogen of kiwifruit canker can be completed in a short time.
Key words: kiwifruti; bacterial canker; RAPD; specific primers; Pseudomonas syringae pv. actinidiae
中图分类号: S436. 634　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2013)05-0458-09
　 　 猕猴桃溃疡病是由丁香假单胞杆菌猕猴桃致
病变种(Pseudomonas syringae pv. actinidiae)侵染
引起的病害。 该病原菌最早见于 1989 年日本的报
道[1,2],随后意大利[3]也作了相关报道。 同时,中
国的许多学者也证实引起中国各地猕猴桃溃疡病
的病原菌正是 P. syringae pv. actinidiae[4,5 ~ 7]。 不
　
　 5 期 邵宝林,等:猕猴桃溃疡病菌的分子检测技术研究
过,从猕猴桃树上经常能分离得到几种与致病菌相
似的变种或种[8,9],比如引起花枯病的丁香假单胞
杆菌丁香致病变种(P. syringae pv. syringe)和死
李致病变种(P. syringae pv. morsprunorum),这些
变种或种都很难与致病变种区分开,因此进一步加
大了病害诊断的难度。 传统的生理生化方法鉴定
病原菌,尤其是区分致病变种被认为是一种繁琐和
费时的方法。 近年来,分子标记技术的发展为植物
病原菌的鉴定提供了更为有力的工具,此项技术可
以直接从 DNA 层面确定病原菌,使得病原的鉴
定,病害的诊断变得更为快速准确。 随机扩增多态
性(Random amplified polymorphic DNA, RAPD)
是一种基于 PCR的分子标记技术[10],由于其具有
信息量丰富,技术难度低,费用低,对 DNA 质量要
求低等优点,被认为是以一种分析复杂基因组非常
有效的方法,这种技术已被广泛用于识别和诊断植
物病原菌[11 ~ 14]。 但是,由于该技术使用的随机引
物较短且退火温度较低,导致 RAPD 标记的重复
性较差。 为克服 RAPD 技术这一弊端,需要将获
得的 RAPD标记转化为更为稳定可靠的序列特异
扩增区域(Sequence characterized amplified region,
SCAR)标记[15]。 SCAR标记是一种建立在 RAPD
基础上的更为稳定的技术,它的应用也越来越多地
见诸于各类植物病害的报道[16 ~ 17]。
尽管一些国家已成功获得猕猴桃溃疡病菌的
分子标记[14,18],但是其中并没有适当的标记可以
很好的检测出发生在中国尤其是四川地区的猕猴
桃溃疡病。 同时,国内也鲜有针对猕猴桃溃疡病分
子检测的报道。 为此本研究希望建立一种早期诊
断方法,可以快速准确地从猕猴桃植株上检测出潜
伏侵染的溃疡病菌。
1　 材料与方法
1. 1　 供试菌株及培养条件
供试菌株共 14 株,其中猕猴桃溃疡病致病菌
(P. syringae pv. actinidiae) 5 株,其他与致病菌相
似的变种或种 9 株。 5 株致病菌中有 4 株分别分
离自德阳、邛崃、都江堰和崇州的病株,另一株则购
自于中国林科院森环森保所;9 株相似菌株中,一
部分分离自采集的病株,另一部分则购自于中国林
科院森环森保所(各参试菌株详细情况见表 1)。
Table 1　 Strains of Pseudomonas syringae pathovars or similar strains of
Pseudomonas, or other genuses used in this study
Number Code Species Source
1 DY10 Pseudomonas syringae pv. actinidiae Deyang, Sichuan, China
2 QL14 P. syringae pv. actinidiae Qionglai, Sichuan, China
3 DJY08 P. syringae pv. actinidiae Du Jiangyan, Sichuan, China
4 CZ20 P. syringae pv. actinidiae Chongzhou, Sichuan, China
5 P2105 P. syringae pv. actinidiae Chinese Academy of Forestry, Beijing,China
6 P1336 P. syringae pv. syringae Chinese Academy of Forestry, Beijing,China
7 DY32 P. fluorescens Deyang, Sichuan, China
8 P1368 P. syringae pv. morsprunorum Chinese Academy of Forestry, Beijing,China
9 QL04 Erwina amylovora Qionglai, Sichuan, China
10 P2104 Bacillus pumilus Chinese Academy of Forestry, Beijing,China
11 P2726 P. eruginosa Chinese Academy of Forestry, Beijing,China
12 P1481 Xanthomonas oryzae Chinese Academy of Forestry, Beijing,China
13 P2090 P. syringae Chinese Academy of Forestry, Beijing,China
14 P2430 P. syringae pv. tomato Chinese Academy of Forestry, Beijing,China
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植物病理学报 43 卷
　 　 各供试菌株接种至牛肉膏蛋白胨培养基
(BPA;牛肉膏 3 g / L,蛋白胨 10 g / L,蔗糖 10 g / L,
琼脂 20 g / L,pH 7. 0)上培养,挑取单菌落移植至
新鲜的 BPA,25℃培养 1 ~ 2 d备用。
1. 2　 供试材料 DNA提取
挑取纯化后的各供试菌株移植至 LB 液体培
养基(胰蛋白胨 10 g / L,酵母提取物 5 g / L,NaCl
10 g / L),25℃下 250 rpm摇床培养过夜,培养好的
菌悬液使用天根公司生产的细菌基因组 DNA 提
取试剂盒提取各供试菌株的基因组 DNA。 采回的
染病组织,健康组织以及接种了病原菌的猕猴桃组
织的基因组 DNA 均采用天根公司生产的植物基
因组 DNA 提取试剂盒提取。 所有提取获得的
DNA样品的浓度及质量,通过比较琼脂糖凝胶电
泳条带强度和测量 260 nm / 280 nm 吸光比率进行
检测。 检测好的 DNA样品保存至 -20℃备用。
1. 3　 RAPD扩增
120 条随机引物用于筛选猕猴桃溃疡病菌的
特异片段,其中包括 40 条 10 bp 长的引物和 80 条
12 bp长的引物。 每个 RAPD 扩增反应总体积为
25 μL,包括 2. 5 μL 10 × Buffer(0. 5 mol / L KCl,
100 mmol / L Tris-HCl pH 8. 3,1% Triton X-100);2
μL 25 mmol / L 的 MgCl2; 2 μL 10 mmol / L 的
dNTPs;1 μL 10 μmol / L 的引物;0. 2 μL 5 U / μL
的 Taq酶;1 μL 100 ng / μL的 DNA模板;16. 3 μL
ddH2O。 反应混合液先在 94℃预变性 5 min,进入
循环 94℃变性 1 min,36℃退火 1 min,72℃延伸 2
min,共 40 个循环,最后延伸 10 min,在 4℃下保
存。 反应结束后,取 5 μL 扩增产物在 1. 5%琼脂
糖凝胶中 100 V电压条件下电泳 30 min,经溴化乙
锭(EB)染色后在 BIO-RAD 凝胶成像系统上观
察、拍照。
1. 4　 特异片段克隆测序
使用凝胶回收试剂盒将 RAPD 筛选出的特异
片段从琼脂糖凝胶上分离纯化出来,然后克隆到
pMD19-T载体上,再转化至大肠杆菌(Escherichia
coli)JM109 细胞中。 将转化后的 E. coli置于含有
氨苄青霉素、IPTG 和 X-Gal 的培养基上 37℃培养
过夜,进行蓝白斑筛选并用 PCR 法鉴定插入的片
段。 采用碱裂解法提取含有目的克隆的转化菌的
质粒 DNA。 将纯化后的质粒 DNA 送往大连宝生
物(TaKaRa)工程有限公司测序。
1. 5　 SCAR特异引物设计
根据 RAPD特异片段的序列,用 Primer Premi-
er 5. 0 软件设计 SCAR 特异引物对 F7 / R7。 设计
好的引物对由上海生工(Sangon)生物技术有限公
司合成。
1. 6　 特异引物 PCR扩增条件优化
针对模板 DNA 浓度、引物浓度进行 4 水平 2
因素试验,以对模板、引物浓度进行优化,具体实验
设计见表 2(其中 Premix为 Taq酶、dNTPs、MgCl2、
10 × buffer 以及上样色素的混合物,由宝生物公司
生产,因其用量由公司优化确定,故本实验不再进
行优化);反应程序除退火温度外均与 RAPD 反应
相同,只需用梯度 PCR优化退火温度(其中退火温
度的梯度范围按照引物说明书设定为 55 ~ 65℃),
以此确定特异引物的最优扩增条件。
1. 7　 SCAR特异引物特异性验证
以所有供试菌株的 DNA 为模板,用特异引物
F7 / R7 进行 PCR 扩增,以双蒸水为对照。 PCR 反
应条件采用 1. 6 中优化确定的反应体系和程序,反
应产物用 1. 5%琼脂糖凝胶进行电泳检测。
1. 8　 猕猴桃枝干组织溃疡病菌的特异性验证
分别以猕猴桃溃疡病菌,采自果园的染病枝干
组织以及接种病原菌的未显症枝干和已显症状枝
干组织的基因组 DNA 为模板,用特异引物 F7 / R7
按照 1. 6 优化后的条件进行 PCR 扩增,以健康猕
猴桃组织和双蒸水作对照。 反应产物进行 1. 5%
琼脂糖凝胶电泳检测。
1. 9　 SCAR特异引物灵敏性验证
用核酸浓度测定仪测定所提取的猕猴桃溃疡
病菌基因组 DNA浓度,并采用浓度梯度稀释法稀
释到 1 × 10 -5 ng / μL,以双蒸水为对照,用特异性
引物 F7 / R7 按照 1. 6 优化后的反应体系和程序进
行 PCR扩增,扩增产物同样进行 1. 5%琼脂糖凝胶
电泳检测。
064
　
　 5 期 邵宝林,等:猕猴桃溃疡病菌的分子检测技术研究
Table 2　 The experimental design for optimization of PCR conditions
Number Premix DNA Template 40 ng / μL F7 10 μmol / L R7 10 μmol / L
1 12. 5 1. 0 0. 5 0. 5
2 12. 5 1. 5 0. 5 0. 5
3 12. 5 2. 0 0. 5 0. 5
4 12. 5 2. 5 0. 5 0. 5
5 12. 5 1. 0 1. 0 1. 0
6 12. 5 1. 5 1. 0 1. 0
7 12. 5 2. 0 1. 0 1. 0
8 12. 5 2. 5 1. 0 1. 0
9 12. 5 1. 0 1. 5 1. 5
10 12. 5 1. 5 1. 5 1. 5
11 12. 5 2. 0 1. 5 1. 5
12 12. 5 2. 5 1. 5 1. 5
13 12. 5 1. 0 2. 0 2. 0
14 12. 5 1. 5 2. 0 2. 0
15 12. 5 2. 0 2. 0 2. 0
16 12. 5 2. 5 2. 0 2. 0
2　 结果与分析
2. 1　 供试材料 DNA提取结果
以提取的所有供试菌株 DNA 为模板,用 16S
rDNA细菌通用引物进行扩增,电泳检测结果表明,
所有供试菌株 DNA 模板均能扩增出一条1 500 bp
左右的条带,而对照不能扩增出条带,说明提取的供
试菌株 DNA符合扩增要求;而提取的猕猴桃组织的
DNA经电泳检测,也有非常清晰的条带,由此亦可
说明提取的猕猴桃组织 DNA也符合后续试验的要
求。 电泳检测图见图 1和图 2。
Fig. 1　 PCR profiles of 16S rDNA universal primers
Lane M: 2 kb DNA ladder; Lane CK: ddH2O; Lane 1-14: Strains of P. syringae pathovars
or similar strains of Pseudomonas or other species listed in Table 1.
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植物病理学报 43 卷
Fig. 2 　 PCR profiles of genomic DNA of ki-
wifruit tissues
Lane M: 2 kb DNA ladder; Lane 1-2: Genomic DNA of
healthy kiwifruit tissues; Lane 3-4: Genomic DNA of dis-
eased kiwifruit tissues which collected from orchard; Lane 5-
6: Genomic DNA of inoculated kiwifruit tissues.
2. 2　 RAPD特异引物及致病菌特异片段筛选
用 120 条随机引物扩增所有参试菌株的基因
组 DNA,根据各引物 RAPD 扩增电泳图谱所示,
其中只有引物 P7 (5′-CGCAGCCGAGAT-3′)可
以反复产生特异、稳定和清晰的条带(图 3),且
该条带只能从致病菌 P. syringae pv. actinidiae
中扩增出来,其他参试菌株基因组 DNA 和双蒸
水对照均不能扩增出此条带。 引物 P7 即为检测
猕猴桃溃疡病菌的特异随机引物,而扩增出的特
异条带即为致病菌的特异片段,该特异片段基因
组大小约为1 300 bp 左右,适宜以此为基础设计
特异引物检测猕猴桃溃疡病。
　 　 将引物 P7 产生的特异片段从琼脂糖凝胶上
回收纯化出来并与载体 pMD19-T Vector连接,然
后转化至 E. coli JM109 细胞中。 用碱裂解法从
转化菌中提取重组质粒即可得到目的克隆。 再
将纯化后的质粒送往大连宝生物(TaKaRa)工程
有限公司测序,测序结果如图 4 所示。
2. 3　 SCAR特异引物设计
根据特异片段的序列,用 Primer Premier 5. 0
软件设计一对特异引物 F7 / R7。 引物正向序列
F7 为 5′-CAATCATTTCGCCAGACGC-3′,位于
特异序列的 68 bp ~ 85 bp;反向序列 R7 为 5′-
CTACGAGGTTAGGTTCAGAGT-3′,位于特异序
列的 1 000 bp ~ 1 020 bp,目的片段约为 950 bp
(见图 4 中下划线部分)。
2. 4　 特异引物 PCR扩增条件的优化
利用梯度 PCR 优化退火温度,从 55℃ 到
65℃由梯度 PCR仪自动设置 12 个梯度。 结果表
明,12 个退火温度均能扩增出较好的条带,相对
来说第 3 条带更为清晰和稳定,因此该特异引物
最适退火温度确定为 56℃ (图 5)。 再对 DNA 模
板和引物浓度进行梯度检测,由图 6 可知,在 25
μL 反应体系中,当引物浓度介于 0. 5 ~ 1. 5 μL
时,条带随着模板浓度的增加而逐渐变亮;当引
物浓度为 2 μL 时,条带在模板浓度较低时比较
明亮,模板浓度过高时,反而变暗;相对而言,引
物浓度为 1 μL 时,尤其是 7、8 泳道中条带相比
其它条带更清晰,由此得出,引物浓度为 1 μL、模
板 DNA浓度为 2 ~ 2. 5 μL 时反应效果较好。 因
Fig. 3　 RAPD profiles generated with primer P7
Lane M: 2 kb DNA ladder; Lane 1-14: Strains of P. syringae pathovars or similar
strains of Pseudomonas or other species listed in Table 1; Lane CK: ddH2O.
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　 5 期 邵宝林,等:猕猴桃溃疡病菌的分子检测技术研究
Fig. 4　 Nucleotide sequences of Pseudomonas syringae pv. actinidiae specific DNA fragment
Underlined sequences are forward and reverse primers for detection of a specific DNA fragment in
P. syringar pv. actinidiae; Shadow sequences are primer P7 used in RAPD analysis.
Fig. 5　 PCR profiles of different annealing temperature by using designed primer F7 / R7
Lane M: 2 kb DNA ladder; Lane 1-12: 55℃, 55. 2℃, 55. 7℃, 56. 8℃, 57. 8℃, 59. 1℃, 60. 5℃,
61. 8℃, 63. 1℃, 64. 2℃, 65℃, 65. 5℃, respectively; Lane CK: ddH2O.
364
　
植物病理学报 43 卷
Fig. 6　 PCR profiles of different concentrations of DNA templates
and primers by using specific primer F7 / R7
Lane M: 2 kb DNA ladder; Lane 1-16: Different concentrations of DNA templates and primers listed in Table 2.
此确定特异引物 PCR 扩增的最佳反应体系为:
12． 5 μL Premix Taq(含 Taq 酶、dNTPs、Taq 缓冲
液、MgCl2 及上样色素;TaKaRa 公司);1 μL 引物
F7 / R7(10 μmol / L);2. 5 μL 模板 DNA(40 ng /
μL);ddH2O补足至 25 μL;反应程序为:95℃预变
性 4 min;进入循环 94℃变性 1 min;56℃退火 1
min;72℃延伸 1 min;共 35 个循环;72℃延伸 7
min;最后 4℃保存。
2. 5　 设计引物特异性验证
利用设计的特异引物对 F7 / R7 扩增所有供试
菌株的基因组 DNA。 电泳结果表明,只有猕猴桃溃
疡病致病菌基因组 DNA能扩增出一条约为 950 bp
的条带,而其他供试菌株及对照均无条带产生(图
7),说明所设计的引物具有一定的特异性,能够从众
多相似菌株中检测出猕猴桃溃疡病菌。 同时回收其
中一条亮带进行测序,测序结果在 NCBI 中与
RAPD筛选出的特异片段序列进行 BLAST比对,比
对结果显示二者相似性达到 99% ,说明特异引物
F7 / R7和随机引物 P7 检测结果相同,进一步证明
RAPD标记成功转化为更为稳定的 SCAR标记。
2. 6　 猕猴桃枝干组织溃疡病菌特异检测
分别以猕猴桃溃疡病菌基因组 DNA,接种致
病菌的未显症状枝干和已显症状病枝干,以及采自
果园的已出现典型症状的枝干和健康枝干组织的
基因组 DNA为模板,用特异引物 F7 / R7 进行 PCR
扩增。 结果表明,接种后未显症枝干和已显症状病
枝以及采自果园的病枝的基因组 DNA,均能扩增
出一条约为 950 bp 的特异性条带(该特异条带经
回收测序,再与 RAPD 特异条带进行 BLAST 比
对,结果显示二者基本一致),而健康枝干及双蒸
水对照均无特异性条带产生(图 8),表明引物 F7 /
R7 能特异性地检测到发病但未显症状组织中猕猴
桃溃疡病菌的存在,这对早期诊断具有潜伏侵染现
象的猕猴桃溃疡病具有重要的意义。
Fig. 7　 PCR profiles of all the strains amplified with designed specific primer F7 / R7
Lane M: 2 kb DNA ladder; Lane 1-14: Strains of P. syringae pathovars or similar strains
of Pseudomonas or other species listed in Table 1; Lane CK: ddH2O.
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　 5 期 邵宝林,等:猕猴桃溃疡病菌的分子检测技术研究
Fig. 8　 PCR profiles of different samples am-
plified with specific primer F7 / R7
Lane M: 2 kb DNA ladder; Lane 1: Genomic DNA of P. sy-
ringae pv. actinidiae; Lane 2: DNA of early days of artifi-
cial inoculation ( not show symptoms); Lane 3: DNA of
heavy period of artificial inoculation (has shown symptoms);
Lane 4: DNA of diseased kiwifruit tissues which collected
from orchard; Lane 5: Healthy trunk tissues; Lane CK:
ddH2O.
2. 7　 特异性引物的灵敏度检测
用特异性引物 F7 / R7 对 1 ng / μL、100 pg / μL、
10 pg / μL、1 pg / μL、100 fg / μL、10 fg / μL 的猕猴
桃溃疡病菌基因组 DNA 进行 PCR 扩增,结果表
明,该特异性引物能从质量浓度为 100 fg / μL 以上
的模板中扩增出 1 条约 950 bp 的特异性条带,而
未能在稀释至 10 fg / μL 及以下的模板 DNA 及对
照中扩增到特异性条带(图 9)。
Fig. 9　 Sensitivity of PCR with specific primer
F7 / R7 at different concentrations of
DNA
Lane M: 2 kb DNA ladder; Lane 1-6: Amplified products u-
sing DNA at concentration of 1 ng / μL, 100 pg / μL, 10 pg /
μL, 1 pg / μL, 100 fg / μL, 10 fg / μL, respectively; Lane
CK: ddH2O.
3　 结论与讨论
在本实验中,供试材料 DNA 的提取是后续试
验顺利进行的保证,因此 DNA 质量的好坏显得尤
为重要。 提取 DNA 传统上常用 CTAB 法[19]和
SDS法[20],但具体的对象不同,最佳提取 DNA 的
方法也不相同。 国内外众多学者对 DNA 提取方
法,尤其是植物基因组 DNA 提取方法做了较多研
究。 随着生物科技的发展,在实际操作中,利用生
物公司生产的基因组 DNA提取试剂盒提取 DNA,
不仅操作简便,而且避免操作过程中不必要的污
染,使获得的 DNA 质量相对而言更佳,且具有更
高的浓度,更有利于后续的 PCR 反应。 因此,本实
验选择试剂盒法提取各供试材料的基因组 DNA。
本研究通过 RAPD技术,从 120 个随机引物中
筛选得到的特异引物 P7 能够特异地仅从病原菌中
扩增出一条 1 300 bp的条带,从而达到从分子层面
对病原菌进行标记的目的。 但是由于 RAPD 技术
使用的随机引物长度较短且退火温度较低,致使该
技术的稳定性、可重复性较差;同时,利用随机引物
检测猕猴桃溃疡病菌产生的条带较多,经凝胶电泳
成像后判读特异片段时容易出错。 因此,本实验在
RAPD检测的基础上,将其产生的特异片段进行克
隆测序,根据特异片段的序列设计出对猕猴桃溃疡
病菌具有高度特异性的一对特异引物 F7 / R7,以此
将不稳定的 RAPD 标记转化为更为稳定的 SCAR
标记。 本研究获得的特异引物 F7 / R7 由一条正链
引物和一条反链引物组成,在进行 PCR 扩增时,引
物的作用是从病原菌基因组 DNA 中特异地扩增
出 2 条引物之间的序列,从而得到只属于该病原菌
的特异片段,即达到对病原菌进行标记的目的。 在
试验中,为保证 PCR 扩增的稳定性,试验前期对
PCR扩增体系中的退火温度、引物及模板浓度作
了一定的优化,以此提高 PCR 产物产量和检测的
灵敏度。 应用该特异引物不仅能从众多菌种中检
测出病原菌的存在,还能在病害潜伏期或发生期从
植物组织中检测到病原菌的存在,这对诊断具有潜
伏侵染现象的猕猴桃溃疡病具有重要意义。 而特
异引物的检测灵敏度在 100 fg / μL水平,说明该特
异引物在病原菌浓度较低时也能检测到它的存在。
利用特异引物 F7 / R7 可在较短时间内完成对
猕猴桃溃疡病菌的检测,较之传统病害检测方法大
大缩短了诊断时间。 同时与前人的传统检测方法
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植物病理学报 43 卷
以及应用通用引物逐步筛选进行检测的方法相比,
该方法具有更高的准确度和灵敏度,填补了国内猕
猴桃溃疡病菌分子检测方面的空白。 此外,该方法
操作简便灵活,中间程序少,避免了不必要的外界
干扰,还能大大节省检测时间和成本,并且可检测
到处于潜育期枝干中的病原物,因此,可将其应用
于国内疫区与非疫区间植物和植物产品的检验检
疫,以此控制猕猴桃溃疡病在我国的进一步蔓延。
该特异引物的提出可以快速准确地检测病害,
同时对猕猴桃溃疡病的早期诊断,特别是处于潜育
期未显症状的病害诊断以及日后的病害防治工作
均具有重要意义。 因此,以该特异引物为基础再辅
以其他技术(例如杂交探针技术)必定可以建立一
套完善的猕猴桃溃疡病的快速分子检测方法。 此
外,该体系的建立,也为其他病原菌的检测提供了
技术指导和理论依据。
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责任编辑:张宗英
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