全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
%##"#"0&
#&兵团博士基金"
!"#!11""&
#&石河子大学高层次人才项目"
2345!"#""+
#
作者简介$赵彦朋"
#06+
#!男!硕士!主要从事棉花分子育种研究
7(89-:
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+"0+#++$6
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*<=8
"
通信作者$刘
!
峰!博士!主要从事作物生理与分子生物学研究
7(89-:
$
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A!
.BC>*@D>*同步抑制
1!2$
与
1$#%
基因提高烟草
种子油酸组分含量的研究
赵彦朋#!!刘
!
峰#"!李艳军#!朱华国#!张新宇#!孙
!
杰#
"
#
石河子大学 农学院!新疆石河子
6%!"""
&
!
中国农业大学 农学与生物技术学院!北京
#""#0%
#
摘
!
要$该研究以烟草品系
E360
的无菌苗叶片为受体材料!采用前期构建的能同步抑制种子中
!"#!
"
"
#!(
油酸
去饱和酶基因#与
!$%&
"酰基转移酶基因#表达的
2EF-
载体!通过农杆菌介导转化获得了转基因烟草植株!分析转
基因植株种子中的脂肪酸组分结果显示$与对照相比!转基因植株种子中
!"#!
和
!$%&
基因的表达水平分别降
低了
!%G
和
##G
&转基因植株种子的脂肪酸组分中!饱和脂肪酸棕榈酸和硬脂酸平均含量分别为
6*"!G
和
&*&$G
!多不饱和脂肪酸亚油酸平均含量为
)+*6!G
!较对照分别降低了
!*0#G
(
0*0!G
和
%*&)G
&而转基因植株
种子中单不饱和脂肪酸油酸含量高达
)*&6G
!比对照提高
&+*%6G
研究表明!同步抑制
!"#!
和
!$%&
基因的表
达能够显著提高烟草种子中油酸组分的含量!为进一步改良油料作物品质奠定了基础
关键词$
!"#!
&
!$%&
&油酸&
2EF-
&烟草
中图分类号$
H)60
文献标志码$
F
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5
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5
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&
!$%&
&
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&
2EF-
&
V=X9<<=
!!
植物油是食用油的重要来源!其脂肪酸组分的
营养功能一直受到人们的重视饱和脂肪酸会增加
人体心血管疾病的发病几率)#(!*&多不饱和脂肪酸易
氧化不稳定!在一般贮藏条件下易酸败产生异味!在
加热过程中易形成自由基加速细胞老化!还易通过
氢化作用生成反式脂肪酸!增加人体心血管疾病发
病率)%(&*单不饱和脂肪酸的油酸稳定性高!能降低
有害胆固醇"
M\M
#!维持有益胆固醇"
I\M
#的水
平&此外!富含油酸的食用油可长时间保存和高温烹
调而不易氧化变质)$()*因此!高油酸含量的植物油
不仅有益于人们的身体健康!也可有效延长产品的
保质期和货架期提高油酸的相对含量!已成为目
前油料作物品质改良的重要内容)6(#!*
在植物种子脂肪酸合成代谢过程中!油酸在
"
#!(
油酸去饱和酶"
PF\!
#的作用下生成亚油酸&
同时棕榈酸等饱和脂肪酸又可在脂肪酸转运体的酰
基转移酶
1
"
P9V1
#的作用下转运到胞质中酰基转
移酶"
P9V1
#和
"
#!(
油酸去饱和酶"
PF\!
#的活性高
低对作物种子油中饱和与不饱和脂肪酸的含量起着
重要作用)#%(#&*在种子发育过程中!这些酶的编码
基因分别是种子中高效表达的
!"#!
与
!$%&
基
因目前
!"#!
与
!$%&
基因已在大豆"
01/$2
#(
棉花"
013-(4.%./
#(玉米"
51/$
6
4
#(花生"
"13
6
7
8
)

$,$
#(油葵"
91$::..4
#(油菜"
&1:$
8
.4
#和橄榄
"
;1,.()
8
$,$
#等多种植物中分离得到)#$(#0*由于
2EF
干扰"
2EF-
#技术的高效(特异性等!应用
2EF-
技术对作物种子的
!"#!
基因进行调控!已
先后获得多不饱和脂肪酸含量低!油酸含量高的转
基因大豆(花生(油菜等)!"(!!*另外!抑制
!$%&
基
因的表达水平!也获得低饱和脂肪酸含量的转基因
芥花油)!%*如果同时降低种子油中多不饱和脂肪
酸与饱和脂肪酸的含量!从而提高油酸组分的含量!
具有重要的实用价值然而!通过同时抑制多基因
的表达来改良种子油品质的研究目前还少有报道
烟草"
<-+)%-$:$%$*$+./ M*
#是遗传转化的模
式植物!其转化再生体系较为成熟为了研究同步
抑制脂肪酸合成关键酶基因
!"#!
与
!$%&
的表达
对种子脂肪酸组分的影响!本实验以烟草为转化材
料!利用前期构建的能同步抑制种子中
!"#!
与
!$%&
表达的
2EF-
载体)!&*!在农杆菌介导下进行
烟草遗传转化!对转化植株进行分子检测!同时测定
分析烟草种子中各脂肪酸组分的含量!为进一步改
良油料作物品质奠定基础
#
!
材料和方法
;*;
!
植物材料
烟草品系
E360
的无菌试管苗"新疆兵团绿洲
生态农业重点实验室提供#!以
]S
为基本培养基!
附加
%G
葡萄糖!
"*6G
琼脂!
L
I$*6
!于
!6^
光下
培养
;*$
!
农杆菌菌株(质粒和主要试剂
试验用根癌农杆菌菌株"
"

()*$+%,(-./%./,7
=
$+-,:4M1F&&"&
#!其含有棉籽脂肪酸合成关键酶
!"#!
与
!$%&
双基因融合片段的干扰载体
L
1NS_(
!"#!7!$%&
"图
#
#
)
!&
*
!为新疆兵团绿洲生态农业重
点实验室保存
>$
?
\EF
聚合酶(植物组织总
2EF
提取试剂
盒和反转录试剂盒
_U-8@SL
V
Z]
#.VSVU9/D<\EF
S
R
/VB@.-. -`V
等均购于大连宝生物"
Z9a9U9
#工程
有限公司
_32
的引物由北京六合华大基因科技
股份有限公司合成
\EF
分子量标准
]9Ua@U
购
自东盛生物"
\S1NJ
#科技有限公司&抗生素利福平
"
2-?
#(卡那霉素"
9`/9
#(链霉素"
SVU
#和头孢霉素
"
3@?
#为
S-
A
89
公司产品!其它试剂为进口或国产分
析纯和色谱纯
;*<
!
烟草的遗传转化
取
6" ^
冰箱内保存的含有
L
1NS_(!"#!7
!$%&
质粒的农杆菌
M1F&&"&
菌液!在加入抗生素
"
$"8
A
%
M 9`/9
!
$"8
A
%
M2-?
!
$"8
A
%
MSVU
#的
M1
固体培养基上划线!于
!6^
倒置暗培养
!D
!待平板
上长出菌落后!挑取单菌落于
!"8MM1
液体培养
基中!于
!6^
(
!!"U
%
8-/
震荡培养
!D
!离心!用
&"
8M]S
液体培养基中悬浮!加入终浓度为
#""
#
8=:
%
M
乙酰丁香酮"
FS
#!继续培养
!
$
%B
!用于
浸染
图
#
!
植物表达载体
L
1NS_(!"#!7!$%&
结构示意图
P-
A
*#
!
SVU>U@=?
L
:9/V@[
L
U@..-=/W@L
1NS_(!"#!7!$%&
+&!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
!!
烟草转化采用叶盘法)!$*将无菌烟草苗植株
的叶片剔除叶脉和叶缘部分后剪成小方块!大小为
#*"<8b#*"<8
的小块!浸入制备好的农杆菌菌液
中!浸染
#"8-/
取出叶盘后!用菌滤纸吸干菌液!
将叶盘背光面朝下平放在垫有滤纸的
]S
共培养基
上!置于
!"^
暗培养)!+*
!D
后转移至选择培养基
"
]Sc!8
A
%
M+(1Fc"*!8
A
%
MNFFc#""8
A
%
M
9`/9c&""8
A
%
M3@?
#!于
!$^
(
#&B
光照培养
约
&
周后!切下幼芽插入生根培养基"
]Sc+8
A
%
M
+(1Fc$"8
A
%
M 9`/9c!""8
A
%
M3@?
#!于
!$^
(
#&B
光照条件下诱导生根!获得抗性烟草植株洗
净根部培养基!清水炼苗后转移至培养土中种植
;=>
!
转基因烟草的
?0@
检测
使用大连宝生物"
Z9a9U9
#工程有限公司的植物
基因组
\EF
提取试剂盒!提取对照与转化抗性烟
草植株的基因组
\EF
&以特异性引物
2EF-!(P
"
$d(
FFFZ333FFFZF33FQFQ(%d
#和
2EF-!(2
"
$d(
QFF3FFZ3ZZ333ZFZQ3(%d
#!
_32
扩增
!"#!7
#
与
!$%&
双基因融合片段的部分序列"
)"#X
L
#&检
测转基因植株
_32
扩增体系为
#"b7[>$
?
_32
缓冲液
!*$
#
M
!
DEZ_
混合物"
!*$88=:
%
M
#
!
#
M
!
2EF-!(P
"
#"
#
8=:
%
M
#与
2EF-!(2
"
#"
#
8=:
%
M
#各
#
#
M
!烟草基因组
\EF!
#
M
!
@2>$
?
"
$O
%
#
M
#!加
双蒸水至
!$
#
M
扩增条件为
0&^
预变性
$8-/
&
然后
0&^
变性
#8-/
!
$+^
退火
#8-/
!
)!^
延伸
#
8-/
!共
%$
个循环!
)!^
延伸
#"8-/

_32
产物经
过
#G
琼脂糖凝胶电泳!在紫外凝胶成像系统中观
测目的条带
;=A
!
烟草
1!2$
与
1$#%
的表达水平分析
将
_32
验证的阳性植株种植培养!收获
Z
"
代
烟草种子!用含有
#""8
A
%
M 9`/9
的
]S
培养基筛
选获得
Z
#
代转化植株将
Z
#
代转基因植株种植
到培养土中!在种子发育中后期!收获
Z
#
代种子!
采用植物组织总
2EF
提取试剂盒"
Z9a9U9
#!提取
烟草种子总
2EF
使用
Q@/@H>9/V
Z]
#%""
分光光
度计"
1-=#对提取的总
2EF
进行定量&利
用
_U-8@SL
V
Z]
#.VSVU9/D<\EF S
R
/VB@.-. -`V
"
Z9a9U9
#将
#
#
A
总
2EF
反转录成
<\EF
以反转录
<\EF
为模板!
;
2Z(_32
分别检测烟草种子
!"#!
与
!$%&
基因的
82EF
表达水平以烟草
A*-
?
.-%-:
基因做内参!内参引物为
OX-(P
"
$d(33QZ3Z33QZQ(
QZQQZFZQ(%d
#和
OX-(2
"
$d(QQ33QZ3ZZ3FF(
QZZQ3ZZ(%d
#&烟草
!"#!
与
!$%&
的检测引物分别
为
PF\(P
"
$d(QQFQZZ3ZZQQFQ3FQQZZ(%d
#和
PF\(2
"
$d(3QZZ3F3QFZZFQQFQQQ(%d
#&
P9V1(P
"
$d(QQQQ3Z3FFZQ3ZFFQFFQ(%d
#和
P9V1(2
"
$d(
33FZ33FZFF3Q33ZF33Z(%d
#反 应体系共
#"
#
M
!包含
SK12B(,/-2@2>$
?
Z]
%
"
!b
#
$
#
M
!上下
游引物"
#"
#
8=:
%
M
#各
"*$
#
M
!模板
#
#
M
!无菌水
%
#
M
每个样品设置
%
次重复反应条件
0$^
预变性
$8-/
!
0$^
变性
#$.
!
+"^
退火
#$.
!
)!^
延伸
#$.
!
&$
个循环
;*B
!
种子总油脂提取和脂肪酸组分测定
用液氮将种子研磨成粉!取
!"8
A
装入
#"8M
离心管中!在冰浴中用超声波细胞破裂仪破裂细胞
%"8-/
&在离心管中加入
+8M
氯仿
(
甲醇"体积比
!e#
#混合溶剂!在
&"^
(
!""U
%
8-/
摇床上处理
&
B
后!
+"""U
%
8-/
离心
#"8-/
!然后吸取下层油脂
相层于恒重的医用玻璃瓶中!在
%!^
水浴旋转蒸发
仪上蒸干
!$^
真空干燥箱中干燥
!B
"至恒重#!
称重!计算油脂含量将提取的总油脂置于
#"8M
具塞试管中!加入
!8M#8=:
%
M J`I(
甲醇溶液!
+"^
水浴皂化
%"8-/
!加入
&8M#8=:
%
M
盐酸
(
甲
醇溶液!
+"^
水浴甲酯化
%"8-/
!取出至室温加
入
!8M
正己烷!充分振摇!静置!吸取上层正己烷
甲酯相至
!8M
小离心管!用少量无水
E9
!
SJ
&
脱水
后!用气相色谱"
Q3(]S
#测定样品中主要脂肪酸组
分的相对含量
Q3(]S
分析条件为$色谱柱
I_(
$]S#0"0#S(&%+
"
+"8b!$"
#
8b"*!$
#
8
#&进样
量
#
#
M
!分流进样方式!分流比
$"e#
&进样口温度
!$"^
&载气
E@
!
$"8M
%
8-/
程序升温$
#$"^
下
保持
#8-/
&然后以
#"^
%
8-/
的速率升至
#6"^
!
保持
$8-/
&以
%^
%
8-/
的速率升至
!%"^
!保持
#$8-/
&再以
%^
%
8-/
的速率升至
!)"^
!保持
!"
8-/

!
!
结果与分析
$=;
!
烟草的遗传转化与植株的
?0@
检测
采用农杆菌介导的烟草遗传转化!在选择培养
#
周左右!叶片周围开始膨胀! 周左右开始出现胚
芽!
&
周左右开始长出幼芽将幼芽转移到生根培
养基上进行诱导生根培养! 周左右出现较丰富的
根系清水洗净根部培养基!在水中炼苗
!D
!然后
移栽至培养土中种植培养"图
!
#
经过
9`/9
抗性筛选!共获得
0
株抗性烟草植
株!提取烟草植株基因组
\EF
!以特异性引物进行
_32
扩增!检测获得
$
株阳性转基因植株"图
&
#
)&!
!
期
!!!!!!!!
赵彦朋!等$同步抑制
!"#!
与
!$%&
基因提高烟草种子油酸组分含量的研究
图
!
!
农杆菌介导的烟草遗传转化
F*
共培养&
1
(
3*
选择培养(分化出幼芽&
\*
生根培养&
7*
长出丰富根系&
P*
炼苗&
Q*
种入培养土中
P-
A
*!
!
Q@/@V-R
"

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1
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&
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A
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Q*ZB@a9/98
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<-/(U@.-.V9/V
L
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A
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图
%
!
Z
"
代烟草种子的
9`/9
筛选结果
F*`9/9
筛选
Z
"
代烟草种子&
1*
抗性植株幼苗
P-
A
*%
!
SA
U@.>:V.=?Z
"
.@@D
F*`9/98
R
<-/.@:@"
.@@D.
&
1*ZU9/.
L
:9/V.@@D:-/
A
.
图
&
!
烟草植株叶片
_32
检测双基因靶标片段
]*\M!"""
&
#*
阳性对照"
L
1NS_(!"#!7!$%&
质粒#&
!*
未转化对照植株&
%
$
##*
抗性植株
P-
A
*&
!
\@V@A
@V
A
@/@-/<=/VU=:9/D
VU9/.
A
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_32
]*\M!"""
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#*_=.-V-W@<=/VU=:
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!*O/VU9/.?=U8@D<=/VU=:
V=X9<<=
&
%##*ZB@a9/98
R
<-/(U@.-.V9/V
L
:9/V.
$=$
!
转基因烟草种子
C
@2D?0@
分析
收获
_32
检测阳性的转基因烟草
Z
"
代种子!
用
!"G
次氯酸钠消毒
#"8-/
!在
#""8
A
%
M 9`/9
选
择 培养基上筛选得到抗性幼苗"图
%
#将抗性苗移
图
$
!
Z
#
代烟草基因组
\EF
的
_32
验证结果
]*\M!"""
&
#*
野生型烟草&
!
$
0*Z
#
代抗性烟草植株
P-
A
*$
!
_32W9:-D9V-=/=?Z
#
VU9/.
A
@/-<
V=X9<<=
A
@/=8-<\EF
]*\M!"""
&
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烟草植株的基因组
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验证!结果显示
均为阳性转基因植株"图
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转基因烟草
Z
#
代植株及对照在开花后
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左
右!即烟草种子形成中后期!按照试剂盒说明书随机
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<\EF
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并进行
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2Z(_32
分析结果显示!转基因植株种
子中
!
个基因表达水平均受到一定程度抑制与对
照相比!转基因烟草种子中
!"#!
和
!$%&
的表达
水平分别降低了
!%G
和
##G
"图
)
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烟草种子脂肪酸组分及含量检测
分别提取对照和进行
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检测的
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图
+
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代烟草种子总
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(
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不同转基因烟草植株
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色谱测定烟草种子脂肪酸组分和含量!重复
%
次
结果显示"图
6
#!烟草种子中主要含有
&
种脂肪酸!
分别为棕榈酸"
3#+e"
#(硬脂酸"
3#6e"
#(油酸
"
3#6e#
#和亚油酸"
3#6e!
#
气相色谱测定表明!在转基因植株种子的脂肪
酸组分中!饱和脂肪酸棕榈酸"
3#+e"
#和硬脂酸
"
3#6e"
#含量分别为
6*"!G
和
&*&$G
!多不饱和
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3#6e!
#含量为
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!而对照种
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!
期
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赵彦朋!等$同步抑制
!"#!
与
!$%&
基因提高烟草种子油酸组分含量的研究
子的
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(
3#6e"
和
3#6e!
的平均含量分别为
6*!+G
(
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和
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程度的降低转基因植株中油酸"
3#6e#
#组分的
含量最高达
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!而对照种子种油酸含量为
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!比对照提高
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"图
0
#
%
!
讨
!
论
随着社会的发展!人们的生活水平有了很大提
高!也越来越提高了对健康的需求棉籽油是中国
第四大植物食用油棉籽油中饱和脂肪酸与多不饱
和脂肪酸含量偏高!因此改良棉籽油的营养品质!具
有重要的实用价值在植物种子脂肪酸合成代谢过
程中!
"
#!(
油酸去饱和酶基因"
!"#!
#是控制油酸
向亚油酸转化的关键酶基因!直接决定了植物中多
不饱和脂肪酸的含量与比例另外!植物脂肪酸合
成途径中!饱和脂肪酸又可在脂肪酸转运体酰基转
移酶
1
"
P9V1
#的作用下转运到胞质中抑制
!$%&
基因的表达!在一定程度上可以降低饱和脂肪酸的
含量!从而也有利于油酸的合成然而!同时降低油
料作物种子中多不饱和脂肪酸与饱和脂肪酸的含
量!进而提高油酸的含量的研究目前仍然报道较少
多元载体构建及其遗传转化技术是保证多个基
因代谢途径协调表达有效技术方案)!)(!6*在先前的
研究中!成功地构建了针对棉花
!
个靶标基因
!"#!
与
!$%&
的
2EF-
载体)!&*!为了研究同步抑
制
!"#!
与
!$%&
基因对棉籽油中脂肪酸各组分的
影响!本研究首先对模式植物烟草进行了遗传转化!
并对转基因烟草种子的脂肪酸组分进行了分析结
果表明!转基因烟草种子中饱和脂肪酸以及多不饱
和脂肪酸含量都有所降低!油酸含量有极显著的提
高"提高了
&+*%6G
#说明同步抑制
!"#!
和
!$%&
基因表达对烟草种子的脂肪酸组分的含量有
较大影响!这也为进一步研究同步抑制
!"#!
和
!$%&
基因的表达改良棉籽油的品质提供了理论和
实践基础
本研究结果也显示!在同步抑制了脂肪酸合成
关键酶基因表达后!烟草种子的脂肪酸各组分含量
出现不同程度的变化!但是与油菜等作物上的研究
报道相比)!%(!$*!油酸含量并没有出现倍数性的提高
而且多不饱和脂肪酸
3#6e!
的含量还处于较高水
平推测可能是由于棉花的
!"#!
与
!$%&
基因与
烟草的
!"#!
与
!$%&
基因的同源性所引起的在
本研究中! 个靶标基因片段均来自棉花!与烟草的
一致性低于
$"G
!较低的同源性降低了
2EF-
的效
果然而!本研究从另一方面也表明了
2EF-
技术
改良作物油份品质的可行性!说明通过调控植物中
脂肪酸的代谢途径来同时降低饱和脂肪酸与多不饱
和脂肪酸!进而提高油酸在种子中的含量具有很大
的发展前景本研究验证了同步抑制双基因表达对
烟草种子脂肪酸油分含量的影响!但对同步抑制
!"#!
与
!$%&
基因表达改良棉籽油等油料作物品
质还需要进一步研究
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