全 文 :作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(11): 18641869 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn
本研究由国家自然科学基金项目(30671311)和国家高技术研究发展计划(863计划)项目(2006AA10A115, 2006AA10A114)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 廖伯寿, E-mail: lboshou@hotmail.com
第一作者联系方式: E-mail: leiyong120401@yahoo.com.cn
Received(收稿日期): 2010-04-14; Accepted(接受日期): 2010-06-27.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01864
ahFAD2A 等位基因在中国花生小核心种质中的分布及其与种子油酸
含量的相关性分析
雷 永 姜慧芳 文奇根 黄家权 晏立英 廖伯寿*
中国农业科学院油料作物研究所 / 农业部油料作物生物学重点开放实验室, 湖北武汉 430062
摘 要: 在中国小核心花生种质中发掘出油酰 PC 脱氢酶的 2 个等位基因(ahFAD2A-wt 和 ahFAD2A-m)。研究结果表
明: (1)突变型等位基因(ahFAD2A-m)与野生型等位基因(ahFAD2A-wt)在编码区 442 bp的 SNP(448 bp G>A)可导致编码
氨基酸的替换(D150N); (2) 突变型基因 ahFAD2A-m 在中国花生小核心种质中广泛存在, 出现的频率为 53.1%, 野生
型基因 ahFAD2A-wt出现的频率为 46.9%; (3) 突变型基因 ahFAD2A-m在密枝亚种(普通型和龙生型变种)中出现的频
率(82.8%)显著高于其在疏枝亚种(珍珠豆型和多粒型变种)材料中出现的频率(15.4%), 卡方测验结果表明, 核心种质
的油酸含量与其携带的等位基因类型密切相关(χ2=98.71, χ20.01,3=11.34, P<0.01), 携带突变型基因(ahFAD2A-m)材料的
油酸平均值显著高于野生型基因的材料(t =18.48>t0.01=2.62, P < 0.01); (4) ahFAD2A等位基因的存在与种子油酸含量
密切相关。
关键词: 花生; 小核心种质; ahFAD2A; 等位基因; 油酸含量
Frequencies of ahFAD2A Alleles in Chinese Peanut Mini Core Collection and
Its Correlation with Oleic Acid Content
LEI Yong, JIANG Hui-Fang, Wen Qi-Gen, HUANG Jia-Quan, YAN Li-Ying, and LIAO Bo-Shou*
Oil Crops Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences / Key Laboratory of Oil Crop Biology, Ministry of Agriculture, Wuhan
430062, China
Abstract: Oleic acid content of cultivated peanut (Arachis hypogaea L.) seeds is controlled by the activity of oleoyl-PC desatu-
rase that is encoded by two homologous genes (ahFAD2A and ahFAD2B). High content of oleic acid results from the both muta-
tion at ahFAD2A and ahFAD2B, loci. Two alleles of ahFAD2A, ahFAD2A-wt (wild type) and ahFAD2A-m (mutation type) exist
in normal oleic accessions, whereas the ahFAD2A-m allele only exists in the high oleic accessions. Allele ahFAD2A-m is a spon-
taneous of ahFAD2A-wt (G-to-A at site 448 bp leading to the substitution from D to N at 150 amino acid position), which results
in a dysfunctional desaturase. A pair of specific PCR primers for the ahFAD2A was developed for PCR amplification. According
to the sequencing result of PCR productions of ahFAD2A-wt and ahFAD2A-m, accounted for 53.1% of the total accessions from
the Chinese mini-core collection carried ahFAD2A-m, and this allele was frequently found in A. hypogaea subsp. hypogaea , but
often absent from A. hypogaea subsp. fastigiat. A highly positive correlation was observed between the presence of ahFAD2A-m
and the higher content of oleic acid in peanut seeds. A new SNP was found (T/C) at site 417 bp in the open reading frame resulted
in no changes of amino acid alignment. This SNP had no correlation with oleic content. These results are helpful for selecting
peanut parents with high oleic acid in breeding programs.
Keywords: Peanut (Arachis hypogae L.); Mini core collection; ahFAD2A; Alleles; Oleic acid content
花生是国产植物油的重要来源。油酸和亚油酸
是花生油的主要脂肪酸, 油酸含量及油酸/亚油酸比
值(油亚比, O/L)决定了油脂的氧化稳定性和营养价
值[1-2], 是影响花生油品质的重要指标。油酸比亚油
酸具有更高的化学稳定性, 并且还具有选择性地降
低有害胆固醇(低密度脂蛋白)并保持有益胆固醇(高
第 11期 雷 永等: ahFAD2A等位基因在中国花生小核心种质中的分布及其与种子油酸含量的相关性分析 1865
密度脂蛋白)的作用, 可有效预防冠心病等心脑血管
疾病的发生, 营养价值优于亚油酸[3]。因此, 油酸是
平衡油脂营养及化学稳定性矛盾的首选脂肪酸, 培
育高油酸的花生品种已成为花生遗传改良的重要目
标。
目前, 国内花生主要推广品种的油酸含量普遍
在 55%以下 , 栽培种花生资源材料的油酸含量在
36%~70%之间, 尚未发掘出油酸含量在 70%以上的
高油酸材料。美国科学家通过对大量的资源筛选获
得了油酸含量超过 80% (亚油酸低于 2%)的高油酸
材料 F435, 并利用该突变体为杂交亲本培育出了高
油酸花生品种 [4-6]。油酰-PC 脱氢酶(oleoyl-PC de-
saturase, FAD2)基因结构和表达水平的变化被认为
是导致花生高油酸性状产生的分子机制。FAD2是负
责向油酸中引入第二个双键生成亚油酸的关键酶 ,
决定油籽中油酸和亚油酸的比例[7]。编码花生 FAD2
的为 2 个同源非等位基因(ahFAD2A 和 ahFAD2B),
这 2 个基因在编码区的 DNA 序列高度相似(99%),
分别来源于花生区组的 A 基因组和 B 基因组[8-9]。
Moore 等[10]研究结果表明花生高油酸性状受 2 对隐
性基因控制, Jung等[11-12]研究证实, 控制高油酸性状
的 ol1位点和 ol2位点分别编码花生的 ahFAD2A 和
ahFAD2B 基因, 花生高油酸性状的产生是 ahFAD2A
和 ahFAD2B基因的同时突变, 导致其编码的酶蛋白
活性降低或功能丧失所致。Chu 等[13]的研究结果表
明 , 栽培种花生材料的基因组中天然存在 2 个
ahFAD2A 等位基因, 分别被命名为 ahFAD2A-wt 和
ahFAD2A-m, 这 2 个等位基因在编码序列的 448 bp
处存在一个 SNP, 导致 150位编码氨基酸的替换, 这
也是普通油酸花生和高油酸突变体杂交产生 3∶1
和 15∶1 两种遗传分离模式, 分别显示 1 对或 2 对
隐性基因控制高油酸性状的分子机制。
中国栽培种花生可根据分枝习性而分为密枝亚
种(包括龙生型和普通型变种)和疏枝亚种(包括多粒
型和珍珠豆型变种)。在前期的研究中, 无论中国花
生种质资源的基础收集品、核心种质和小核心种质
中均发现密枝亚种的油酸含量和油亚比明显高于疏
枝亚种[14-15], 由于油酸含量及油亚比受到 ahFAD2A
和 ahFAD2B基因的共同调控, 而且在花生资源材料
中天然存在 ahFAD2A-wt 和 ahFAD2A-m 等位基因
(448 bp G>A, D150N)的分离[16], 因此, 利用核心种
质广泛代表性和遗传多样性, 分析 ahFAD2A等位基
因在我国栽培花生中的出现频率及其分布规律, 研
究等位基因与油酸含量的相关性, 有助于深入了解
花生高油酸性状产生的分子机制, 明确 ahFAD2A基
因在调控油酸合成中的作用机制, 并在高油酸育种
研究中有针对性地选择杂交亲本, 提高花生高油酸
育种的效率。
1 材料与方法
1.1 试验材料
从中国花生种质资源数据库的 298 份小核心种
质中选择有代表性的材料 177 份[17], 为保证选材的
代表性和可靠性, 确定如下选取原则: (1)首先分析
不同变种在核心种质中所占比例, 并按照比例确定
龙生型 (ssp. hypogaea, var. hirsuta)、普通型 (ssp.
hypogaea, var. hypogaea)、珍珠豆型(ssp. fastigiata,
var. vulgaris)、多粒型(ssp. fastigiata, var. fastigiata) 4
个变种的种质份数; (2)以农家品种和地方品种为主,
不选择变种间杂交获得的遗传尚未完全稳定的育种
材料及中间型材料; 所选材料由中国农业科学院油
料作物研究所花生品种资源课题组提供(表 1)。
1.2 基因组 DNA的提取
177份参试材料被统一种植在田间, 每个材料 3
行(60 粒), 待种子萌发出苗后每个材料取未展开的
小叶 10片(随机从 3行材料中选取 10株, 每株 1片),
表 1 试验材料油酸含量统计
Table 1 Statistics of the oleic acid content of the mini core accessions
参试材料 Accessions tested 小核心种质 Mini core collection 亚种
Subspecies
类型
Botanical type 份数及比例
Number (%)
油酸含量
Oleic (%)
油亚比
O/L
份数及比例
Number (%)
油酸含量
Oleic (%)
油亚比
O/L
龙生型 var. hirsuta 14 (7.91) 56.4(44.4–61.3) 2.33 21 (7.05) 53.6 2.01 密枝亚种
ssp. hypogaea 普通型 var. hypogaea 85 (48.02) 55.0(41.0–66.8) 2.14 110 (36.91) 51.6 1.79
多粒型 var. fastigiata 14 (7.91) 44.9(37.4–60.4) 1.24 29 (9.73) 43.4 1.21
珍珠豆型 var. vulgaris 64 (36.16) 46.2(38.3–62.6) 1.38 119 (39.93) 44.8 1.30
疏枝亚种
ssp. fastigiata
中间型 Intermediate type 0 (0) — — 19 (6.38) 45.4 1.34
总计 Total 177 51.13 1.64 298 48.0 1.51
O/L: ratio of oleic/linoleic.
1866 作 物 学 报 第 36卷
采用常规 SDS-酚/氯仿法提取花生叶片 DNA, 紫外
分光光度计测定其浓度和纯度, 1.0%琼脂糖凝胶电
泳检测 DNA 质量, 最后统一调整 DNA 浓度至 100
ng μL1。
1.3 花生种子脂肪酸组分的测定
选择健康、饱满、成熟一致的花生种子 10粒, 研
磨成粉状后取 20 mg, 置 10 mL离心管中, 加石油醚
2 mL, 40℃超声萃取 2 h后, 再加 0.4 mol L–1 KOH-
甲醇溶液 1 mL, 充分混匀, 于 40℃超声 1 h进行甲
脂化反应, 冷却至室温后加入内标十七碳饱和脂肪
酸甲脂及 2 mL蒸馏水, 剧烈震荡后离心, 取上清液
1 mL装入样品瓶, 用于气相色谱分析。采用 Agilent-
Technologies 6890N 气相色谱分析仪程序升温法 ,
柱温 210~230℃, 升温速率 10℃ min1, 进样口温度
260℃, 入口压强 25 Pa, 高纯氮气 25 mL min1, 氢
气 40 mL min1, 空气 400 mL min–1。各种脂肪酸的
相对量 (%)以色谱峰面积占总的峰面积比例表示
(Ai% = Ai/ ∑Ai100), 其中 Ai为第 i种脂肪酸组分的
峰面积。
1.4 PCR反应和测序
花生 ahFAD2A 特异性 PCR 扩增引物 aF19: 上
游引物 5-GATTACTGATTATTGACTT-3, R3: 下游
引物 5-CCCTGGTGGATTGTTCA-3, PCR产物 607
bp (包含 88 bp的 5UTR区和 519 bp的编码区), 以
花生基因组 DNA 为扩增模板, 反应总体积 20 μL,
含 buffer 2 μL、引物(各 50 ng)、Taq酶 1 U、dNTPs
(各 4 pmol)、模板 DNA 5 μL, PCR循环参数为 94℃
1.5 min, 30循环(94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 60 s),
72℃ 5 min。PCR产物经琼脂糖胶纯化后采用直接
测序和克隆测序 2种方法测定序列, 其中 PCR产物
直接测序法以下游引物 R3为测序引物。克隆测序的
步骤是先将 PCR 产物与克隆载体 pMD18-T 连接后
转化大肠杆菌 DH5α 感受态细胞, 重组子经鉴定后
送华大基因公司测序。
1.5 数据统计分析
以直接计数法计算等位基因在核心种质中出现
的频率。用 χ2检验单因素分析比较等位基因在不同
亚种间的频率, P<0.05 为差异具有统计学意义。利
用卡方(χ2)测验进行突变型基因与油酸含量的相关
性分析。在确认突变型基因与种子油酸含量相关的
基础上, 以 t 测验检验突变基因组和野生基因组的
油酸含量差异, P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果与分析
2.1 ahFAD2A基因的 SNP分析
利用 aF19/R3 特异性 PCR 引物扩增 ahFAD2A
基因片段, 预期扩增片段大小 607 bp, 通过琼脂糖
凝胶电泳, 以 100 bp标准分子量估计 PCR产物大小,
选择目标片段切胶纯化(图 1), 然后分别通过 PCR
产物直接测序和克隆测序对 177个材料的 ahFAD2A
基因片段进行了序列比对和分析, 排除测序错误后,
共发掘出 2个 SNP位点 , 分别位于起始密码子后
417 bp 和 448 bp, 其中位于 417 bp 的 SNP 是 T/C
(CGT/CGC)变异, 177 个材料中有 63 个以 417(T)碱
基的形式存在, 417 bp位的 SNP位点处在密码子的
第 3位, 并未导致编码氨基酸(精氨酸)的改变。第二
个 SNP位于起始密码子后 448 bp的 G/A替换(GAC/
AAC)处 , 导致编码蛋白的氨基酸从野生型基因的
天门冬氨酸到天门冬酰胺(D/N)的替换, 还发现 417
bp的碱基 T有与 448 bp的 A碱基共同变化的趋势,
但并不存在绝对的对应关系。
图 1 ahFAD2A 基因片段 PCR 扩增产物电泳图
Fig. 1 Electrophoretogram of the amplification product of the
ahFAD2A
P: DNA marker DL2000.
图 2 ahFAD2A-m 和 ahFAD2A-wt 等位基因 PCR 产物测序图
Fig. 2 Diagram of DNA sequencing of ahFAD2A alleles
左: ahFAD2A-m基因型(ol1ol1); 右: ahFAD2A-wt基因型(Ol1Ol1)。
Left: ahFAD2B-m with 448–450 bp (AAC) codon;
right: ahFAD2A-wt with 448–450 bp (GAC) codon.
2.2 ahFAD2A等位基因突变的频率及其分布
在所选的 177个材料中有 94个表现为突变型基
因(ahFAD2A-m), 83个为野生型基因(ahFAD2A-wt),
第 11期 雷 永等: ahFAD2A等位基因在中国花生小核心种质中的分布及其与种子油酸含量的相关性分析 1867
突变型基因所占频率为 53.1%。突变型基因主要存
在于密枝亚种中, 占整个突变基因的 87.2%(82/94),
其中包括普通型变种材料 70个, 龙生型变种材料 12
个。野生型基因主要存在于疏枝亚种中, 占整个野
生型基因的 84.6%(66/78), 其中包括珍珠豆型材料
53个, 多粒型材料 13个。
密枝亚种材料中 ahFAD2A-m 等位基因出现的
频率为 82.8%, 其中龙生型和普通型材料 ahFAD2A-m
出现的频率分别为 85.7%和 82.4%, 而疏枝亚种材
料中突变型等位基因出现的频率仅为 15.4%, 其中
多粒型变种突变型等位基因出现的频率为 7.1%,
珍珠豆型变种中突变型基因出现的频率亦较低 ,
约 17.2%。密枝亚种中突变型等位基因出现的频率
明显高于疏枝亚种中出现的频率 , 亚种间突变型
基因频率的差异具有统计学意义(χ2=8.99, P < 0.01)
(表 2)。
表 2 ahFAD2A 等位基因在中国花生小核心试验材料中的分布
Table 2 Frequency of ahFAD2A alleles in the mini-core collection from China
密枝亚种 ssp. hypogaea 疏枝亚种 ssp. fastigiata 基因类型
Gene type 龙生型
var. hirsuta
普通型
var. hypogaea
多粒型
var. fastigiata
珍珠豆型
var. vulgari
合计
Total
ahFAD2A-wt 2 15 13 53 83
ahFAD2A-m 12 70 1 11 94
14 85 14 64 177
突变比率 Mutant ratio (%) 85.7 82.4 7.1 17.2 53.1
82.8%A (82/99) 15.4%B (12/78)
A和 B表示密枝亚种和疏枝亚种材料中 ahFAD2A-m等位基因出现的频率存在极显著差异。
A and B show the significant difference at P≤0.01 between the frequencies of ahFAD2A-m in the ssp. hypogaea and ssp. fastigiata.
2.3 ahFAD2A 等位基因与花生油酸含量的相关
性分析
在整个 177 份实验材料中 , 平均油酸含量
51.3%, 其中 83份携带 ahFAD2A-wt基因的花生材料
中, 油酸含量平均为 45.1%, 亚油酸含量 35.6%, 油
亚比 1.27, 并且油酸含量多集中在 40%~50%区间内,
其中油酸含量低于 40%的有 7 份, 没有油酸含量高
于 60%的材料。在 94 份携带 ahFAD2A-m 突变型基
因的材料中, 油酸含量平均 56.5%, 亚油酸含量平
均 23.7%, 油亚比 2.38, 其中没有油酸含量小于 40%
的材料, 而有多达 65 份材料的油酸含量在 50%~
60%之间, 有高达 21 份材料的油酸含量大于 60%
(图 3和表 4)。卡方测验结果表明, 实验材料的油酸
含量与其携带的等位基因类型密切相关(χ2=98.71,
χ20.01,3=11.34, P<0.01), 携带突变型基因(ahFAD2A-m)
材料的油酸含量平均值显著高于野生型基因的材料
(t =18.48>t0.01=2.62, P<0.01) (表 3), 中国花生小核心
种质材料中 ahFAD2A 突变型基因(ahFAD2A-m)的存
在与其花生种仁中相对较高的油酸含量密切相关。
图 3 试验材料植物学分类、油酸含量与 ahFAD2A 等位基因突
变相关性
Fig. 3 Correlation of ahFAD2A allele with material type and
oleic content
表 3 ahFAD2A 等位基因与油酸含量的相关性分析
Table 3 Correlation between the ahFAD2A alleles and the oleic acid content
不同油酸含量的材料数
Number of accessions in different levels of oleic content等位基因
Allele
平均油酸含量
Average oleic content
(%) <40% 40%–50% 50%–60% >60%
合计
Total
卡方测验
χ2
ahFAD2A-wt 45.1 A 7 65 11 0 83
ahFAD2A-m 56.5 B 0 12 61 21 94
合计 Total 7 77 72 21 177
χ2=98.71,
χ20.01,3=11.34
P<0.01
A和 B表示携带两种等位基因材料的油酸含量存在显著差异(P<0.01)。
A and B indicate significant difference (P<0.01) of oleic acid content between accessions with different alleles.
1868 作 物 学 报 第 36卷
3 讨论
花生高油酸性状由 ol1 和 ol2 两对隐性基因(分
别编码 ahFAD2A 和 ahFAD2B)控制, ahFAD2A 和
ahFAD2B 基因的同时突变将导致种子高油酸(油酸
含量 80%)性状的产生。在普通油酸含量(油酸 70%
以下)的花生资源材料中仅存在 ahFAD2B 的野生型
基因(ahFAD2B-wt), 但同时存在 ahFAD2A 基因的野
生型或突变型(ahFAD2A-wt和 ahFAD2A-m)等位基因
的分离, 并且 ahFAD2A突变型等位基因主要存在于
密枝亚种材料, 而野生型基因主要存在于疏枝亚种
材料中, 这一结果与 Chu 等[17]利用美国花生资源材
料的研究结果类似。
本文研究发现, 在普通油酸含量的小核心种质
资源材料中, ahFAD2A-m 突变基因的存在总是伴随
着油酸含量的相对提高, 表现为所谓中等油酸含量
(55%~70%)的性状。目前已有证据证实 ahFAD2A和
ahFAD2B基因的协同表达调控着花生种子的油酸含
量, 至于这 2个基因在调控油酸含量中的相对贡献
大小目前尚无定论, Jung 等[11-12]认为花生材料中存
在野生型 2A或 2B基因之一即可保证种子中油酸到
亚油酸的正常转化, 表现为普通油酸性状。本研究
结果表明在中国花生小核心种质中, ahFAD2A 突变
基因的单独存在亦会影响花生种子的油酸含量 ,
ahFAD2A 和 ahFAD2B 基因对于花生种子油酸含量
的调控表现为加性效应。
目前发现的高油酸花生突变体材料普遍存在株
体分散、荚果小、抗病性差等不良农艺性状, 通过
杂交转育或诱变筛选, 培育出农艺性状优良、适合
当地种植的高油酸花生品种是目前迫切需要解决的
问题, 由于花生高油酸性状受 ahFAD2A和 ahFAD2B
两对基因控制, 而在普通油酸含量的花生材料中存
在 ahFAD2A-m 和 ahFAD2A-wt 等位基因, 因此在选
择杂交亲本或者诱变亲本材料时, 应优先选择携带
ahFAD2A-m 型的材料(普通型变种), 以提高杂交后
代或诱变后代材料中高油酸个体出现的频率。另外,
我国花生种质资源材料中存在大量具有优良品质、
抗性和农艺性状的花生材料, 小核心种质以其广泛
的代表性为育种家选择亲本材料提供了便利 , ah-
FAD2A等位基因在花生小核心种质的分布及其与油
酸含量的相关性研究为开展高油酸杂交育种提供了
理论指导和基础材料信息。
4 结论
花生 ahFAD2A 突变型基因 ahFAD2A-m 主要分
布在密枝亚种(普通型和龙生型变种)材料中, 而野
生型基因 ahFAD2A-wt 主要分布在疏枝亚种(珍珠豆
型和多粒型变种)材料中。核心种质中密枝亚种材料
种子的油酸含量显著高于疏枝亚种与其普遍携带突
变型基因 ahFAD2A-m密切相关。
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compared with ICRISAT mini core collection. Acta Agron Sin
(作物学报), 2008, 34(1): 2530 (in Chinese with English ab-
stract)
科学出版社生物分社新书推介
《苜蓿生理生态研究》
贾志宽 等著
978-7-03-029065-6 ¥86.00 2010年 9月出版
本书是依托国家科技项目,在苜蓿生理生态多年研究工作的基础上,对
研究工作的系统性和阶段性总结,内容主要反映了作者近十年苜蓿研究中独
具特色的部分。内容包括:苜蓿生长发育与气象条件的关系、苜蓿抗逆性研
究、不同苜蓿品种光合特性研究、不同苜蓿品种根系形态及吸水规律研究、
断根对紫花苜蓿生理生态效应的影响、不同生长年限苜蓿生产性能及对土壤
的环境效应,以及苜蓿草田轮作土壤环境效应研究等方面。本书可为从事牧
草研究及教学的科教人员提供参考。
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