全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(3): 435−441 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家重点基础研究发展计划(973计划)项目(2006CB101600)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 官春云, E-mail: guancy2000@yahoo.com.cn
第一作者联系方式: E-mail: sanjian123@yeah.net; Tel: 0731-4617941
Received(收稿日期): 2009-06-30; Accepted(接受日期): 2009-12-08.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00435
六个甘蓝型油菜油酸脱氢酶(FAD2)假基因的克隆和分析
肖 钢 1,2 张振乾 1 邬贤梦 1 谭太龙 1,2 官春云 1,*
1 湖南农业大学油料作物研究所 / 国家油料作物改良中心湖南分中心, 2 作物种质创新与资源利用国家重点实验室培育基地, 湖南长
沙 410128
摘 要: 以甘蓝型油菜湘油 15为材料, 采用 PCR方法克隆并分析了 56个 FAD2基因克隆和 47个 FAD2基因 cDNA
克隆, 从中发现 6个新的 FAD2拷贝。它们与公布的甘蓝型油菜 FAD2基因(AY577313)具有 87.0%以上的同源性, 没
有内含子, 在开放阅读框中存在 1~12 个终止密码子, 其中有 2 个拷贝具有转录功能。将这 6 个 FAD2 拷贝在酿酒酵
母中进行体内表达实验, 通过气相色谱检测脂肪酸组成证明其不具备油酸脱氢酶功能, 与对照相比, 也没有改变酵
母体内脂肪酸组成。由此推测这 6个 FAD2拷贝为假基因。
关键词: 甘蓝型油菜; 油酸脱氢酶; FAD2; 基因表达; 酿酒酵母
Cloning and Characterization of Six Oleic Acid Desaturase Pseudogenes of
Brassica napus
XIAO Gang1,2, ZHANG Zhen-Qian1, WU Xian-Meng1, TAN Tai-Long1,2, and GUAN Chun-Yun1,*
1 Oil Crops Institute / National Oil Crops Improvement Center, Hunau Agricultural University; 2 Pre-State Key Laboratory for Germplasm Innovation
and Resource Utilization of Crops, Changsha 410128, China
Abstract: The phenomenon of multi-copy genes is common in plants. Pseudogene is defined as an inactive gene, which can not
synthesize functional proteins but share the similar DNA sequences with normal functional genes. In this study, 56 FAD2 DNA
clones and 47 FAD2 seed cDNA clones of Brassica napus cv. Xiangyou 15 were investigated, and six new copies of FAD2 were
detected, designated as FAD2P1-6 respectively. This sequence length of six copies ranged from 1 141–1 157 bp and there were no
introns in their open reading frames (ORF). These six copies share 96.1% identity in nucleotides from one another, and share more
than 87% nucleotides identity with AY577313. Deduced amino acid sequences revealed that 1–12 stop codons occurred in the
coding region of six copies which will prevent them from coding for a functional protein. These six copies were investigated in
vivo in Saccharomyces cerevisiae through being cloned into yeast expression vector pYES2.0, and the 16:2 and 18:2 fatty acids
were determined by gas chromatographic analysis. The results revealed that the products of the six copies were not able to synthe-
size 16:2 and 18:2 fatty acids, suggesting that they are pseudogenes of FAD2. These multiple pseudogenes of FAD2 within the B.
napus genome might result from the duplication of large chromosomal segments simultaneously following mutation. Because of
the existence of multiple pseudogenes for FAD2 in B. napus genome, we should be careful in genetic research to identify true and
false, to avoid wrong conclusions.
Keywords: Brassica napus; FAD2; Oleic acid desaturase; Gene expression; Saccharomyces cerevisiae
假基因存在于大多数植物基因组中, 目前已从
拟南芥、水稻、小麦等植物中发现了大量假基因。
假基因(pseudogene)被定义为核苷酸序列与相应正
常功能基因相似, 但不能合成功能蛋白质的失活基
因。FAD2基因编码位于内质网上的油酸脱氢酶, 是
控制植物种子油酸(18:1)含量的关键基因。在脂肪酸
生物合成中, 油酸脱氢酶在脂肪酸链上引入第二个
双键, 是催化多不饱和脂肪酸生物合成的第一步反
应 [1-2]。甘蓝型油菜(Brassica napus)是异源四倍体,
是白菜(Brassica rapa, A 基因组)与甘蓝(Brassica
oleracea, C基因组)通过自然杂交和染色体组自然加
倍后形成的 [3], 其染色体组型为 AACC。Scheffler
436 作 物 学 报 第 36卷

等[4]通过 Southern 杂交方法证明甘蓝型油菜基因组
中存在 8~12 个 FAD2 拷贝, 分别位于连锁群 N1、
N5、N11 和 N15 上, 其多拷贝的原因是 FAD2 基因
在进化过程中发生了基因的加倍。这往往伴随着突
变事件的发生, 可能导致其原有功能的丧失而成为
假基因[5]。目前的研究显示, 假基因并非完全没有功
能 , 由假基因转录的 RNA 可以与其他的 RNA、
DNA、蛋白质甚至小分子化学物质发生作用, 直接
影响生理机能[6]。另外, Frank等[7]研究表明, 有些假
基因包含着许多重复多次的DNA序列, 该序列能够
激发某种反应, 阻止特定的基因被打开, 干预细胞
的基因沉默过程。
本研究通过 PCR方法克隆到 6个 FAD2新拷贝
(GQ233444-9), 经序列比对和酵母体内表达证明它
们为 FAD2 假基因。由于假基因与其相应的功能基
因有高度的序列相似性, 这将会干扰 RT-PCR 和原
位杂交试验结果。另外在分析突变体时, 也不容易
将假基因和发生突变的功能基因区分开来。因此分
析研究 FAD2 假基因对油酸形成的机理和利用分子
手段培育高油酸油菜具有一定的指导意义。
1 材料与方法
1.1 试验材料
甘蓝型油菜品种湘油 15由湖南农业大学油料
作物研究所提供 , 将其种植在温室中。酿酒酵母
(Saccharomyces cerevisiae)营养缺陷型 INVSc1及大
肠杆菌 /酿酒酵母穿梭表达载体 pYES2.0 购自
Invitrogen公司 ; 大肠杆菌(Escherichia coli) DH5α
为本室保存。Pfu DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、
限制酶 BamH I、Not I 购自宝生物工程有限公司;
DNA 片段快速纯化/回收试剂盒购自北京鼎国生物
技术有限责任公司; 脂肪酸标准样品购自 OMEGA
公司。pGM-T平末端 DNA片段加 A克隆载体购自
天根生化科技(北京)有限公司; Plant Total RNA试剂
盒购自安比奥公司; cDNA Synthesis 试剂盒购自东
洋纺公司; 其他常规试剂均为国产分析纯。
1.2 DNA、RNA的提取及 cDNA的合成
采用 CTAB法 [8], 稍作修改 , 提取发芽湘油 15
小苗总 DNA, 参照 Plant total RNA试剂盒说明书提
取总 RNA, 用普通琼脂糖电泳检测所提 DNA 和
RNA, 核酸蛋白分析仪测定其浓度。参照 cDNA
Synthesis试剂盒说明书, 取 600 ng RNA进行 cDNA
的合成。
1.3 FAD2基因拷贝的克隆
参考公布的甘蓝型油菜 FAD2基因 mRNA序列
(AY577313), 及酿酒酵母表达载体 pYES2.0 的多克
隆位点, 分别在引物的 5′端引入 BamH I, Not I的酶
切位点设计 FAD2 基因特异引物, 其 P1 为 5′-GCG
GCCGCATGGGTGCAGGTGGAAGAATGCAAG-3′,
P2为 5′-GGATCCACTTATTGTTGTACCAGAACAC
ACC-3′。反应体系为 cDNA模板 5 μL或 DNA模板
1 μL; 引物 0.2 mmol L−1; pfu酶 2 U, 总体积 50 μL。
反应条件为 94℃ 4 min; 94℃ 40 s, 57℃ 40 s, 72℃
2 min, 28个循环。PCR产物经纯化后与 pGM-T平
末端DNA片段加A克隆载体连接, 转化大肠杆菌菌
株 DH5α。鉴定后随机挑选阳性克隆包括 56个基因
组 FAD2和 47个 FAD2 cDNA送上海英骏生物技术
公司和上海博亚生物技术公司进行双向测序, 每个
克隆进行 2次重复测序。
通过 DNASTAR 软件拼接测序结果 , 并用
DNAMAN6.0 软件对其进行比对分析 , 同时通过
http://us.expasy.org/tools/dna.html 的 DNA 序列翻译
工具, 将这些拷贝的核苷酸序列翻译成氨基酸序列
进行分析。
1.4 表达载体的构建及转化
FAD2 基因相应的 cDNA 经限制性内切酶 Not
I/BamH I 消化后与同样经 Not I/BamH I 消化后的
pYES2.0 连接 , 分别构建成酵母表达载体 pYES/
FAD2P1-6。另外以本实验室已有的具有油酸脱氢酶
功能的酵母表达载体 pYES/FAD2 I-3 为阳性对照,
以 pYES2.0空载体为阴性对照, 将连接产物及阳性、
阴性对照载体用醋酸锂法转化酵母菌 INVScI[9], 在
SC-Ura培养基上筛选得到转化子。
1.5 酿酒酵母的培养及脂肪酸分析
将阴性、阳性对照菌株及工程菌株 pYES/
FAD2p1-6接种到 250 mL三角瓶内的 15 mL SC-Ura
液体培养基中, 在 30℃和 120 r min−1条件下过夜培
养, 将过夜培养菌株接种到 250 mL 三角瓶内的 50
mL含 2%半乳糖的 SC-Ura培养基中, 参考 Invitrogen
公司操作手册所示方法使 OD600达到 0.4。30℃和 120
r min−1条件下诱导培养 72 h后, 以 2 000×g离心 10
min, 弃去上清液, 用去离子水洗涤两次, 接着用石
油醚-乙醚(1∶1)洗涤 2 次以除去菌体上粘附的脂肪
酸。将细胞冻干后加入 1 mol L−1甲醇盐酸, 在 80°C
反应 3 h后加入等体积的石油醚-乙醚(1∶1)。
采用HP 6890N分析脂肪酸 , 毛细管色谱柱为
第 3期 肖 钢等: 六个甘蓝型油菜油酸脱氢酶(FAD2)假基因的克隆和分析 437


Aginent DB-23。参数为进样口温度 250℃; 进样口
压强 0.167 MPa; 柱流速 2 cm s−1; 柱压强 0.167 MPa;
柱流量 1.5 mL min−1; 氢气流量 30 mL min−1; 空气
流量 300 mL min−1; 氮气流量 30 mL min−1; 进样量
2 μL; 总流量 65.7 mL min−1; 检测器温度 260℃。采
用程序性升温, 初始柱温 190℃, 以 2.75℃ min−1升
至 210℃, 运行 6 min。
2 结果与分析
2.1 油酸脱氢酶假基因的克隆及其序列分析
对基因组中 56个FAD2克隆的测序结果比对分析
得到 6个 FAD2新拷贝, 将其命名为 FAD2P1− 6 (图 1),
这 6个拷贝序列长度为 1 141~1 157 bp, 它们之间的序
列同源性为 96.1%, 没有内含子, 与NCBI上公布的甘
蓝型油菜 FAD2 序列(AY577313)的同源性均在 87.0%
以上。对 47个 FAD2 cDNA克隆的测序结果分析得到
了与 FAD2P1 和 FAD2P3 具有 100%同源性的 2个
cDNA序列, 说明 FAD2P1和 FAD2P3具有转录功能且
没有内含子。与 AY577313 相比较, 这 6 个拷贝存在
174个变异位点(表 1和图 1), 这导致在它们的氨基酸
序列中出现大量的翻译提前终止点, 可以初步判断它
们丧失了油酸脱氢酶功能而成为假基因(图 2)。

表 1 6 个 FAD2 假基因碱基突变分析
Table 1 Statistical analysis of mutation of six FAD2 pseudogenes
拷贝名
Name
序列长度
Length (bp)
缺失
Deletion
插入
Inserion
碱基替换
Base subtitution
终止密码子
Stop codon
与 AY577313同源性
Homology to AY577313 (%)
FAD2P1 1155 – – 36 1 96.89
FAD2P2 1156 – – 120 6 89.62
FAD2P3 1155 1 – 81 12 92.82
FAD2P4 1157 – – 115 5 89.63
FAD2P5 1141 15 1 128 11 87.62
FAD2P6 1141 9 2 129 7 87.47



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图 1 6 个 FAD2 假基因与 AY577313 序列差异比较
Fig. 1 Sequence variations of 6 FAD2 pseudogenes and AY577313

图 2 6 个 FAD2 假基因推断的氨基酸序列比较
Fig. 2 Comparison of the deduced amino acid sequences of six FAD2 pseudogenes
圆点表示该处氨基酸残基缺失; 序列中存在的多个翻译终止点, 以“Z”表示; 黑色区域氨基酸残基完全一致。
Dots mean absences of residual. Stopping translation points are represented by “Z”. Identical and similar residues are in a black background.

第 3期 肖 钢等: 六个甘蓝型油菜油酸脱氢酶(FAD2)假基因的克隆和分析 439


2.2 重组表达载体 pYES/FAD2P1-6 的构建和酶
切鉴定
重组质粒经 Not I/BamH I双酶切产生 1 150 bp
左右的片段 , 表明外源片段已经插入表达载体
pYES2.0中(图 3)。

图 3 重组表达载体 pYES/FAD2p1-6 检测结果
Fig. 3 Analysis of recombinant vectors pYES/FAD2p1-6
1: pYES2.0经 BamH I/Not I双酶切; 2~7: pYES/FAD2P1-6经
BamH I/Not I双酶切; M: DNA分子量梯度。pYES/FAD2P1-6经
BamH I/Not I双酶切后在电泳图上出现预计大小的片段, 说明载
体构建成功。
1: pYES2.0 double digested by BamH I/Not I; 2–7:
pYES/FAD2P1-6 double digested by BamH I/Not I; M: DNA ladder.
The expected size of the fragments appeared on the agarose gel
electrophoresis after double digestion of pYES/FAD2P1-6 by
BamH I/Not I, indicating the recombinant vect.

2.3 油酸脱氢酶基因在酵母中的表达
图 4-A为 16:2和 18:2脂肪酸标准品的气相色谱
图, 其特征值保留时间分别为 3.015 min 和 4.115
min。在阳性对照 pYES/FAD2I-3转化子的脂肪酸色
谱图(图 4-C)上有 16:2 和 18:2 的特异脂肪酸峰; 而
阴性对照 pYES2.0转化子和 pYS/FAD2P1-6转化子
的色谱图(图 4-B~D)则没有这两个特异的脂肪酸
峰。说明这 6个 FAD2拷贝不具备油酸脱氢酶功能,
进一步证明它们是假基因。表 2是 pYES2.0转化子、
pYES/FAD2I-3转化子和 pYS/FAD2P1-6转化子具体
的脂肪酸组成数据。
3 讨论
酿酒酵母细胞由于没有油酸脱氢酶基因而不
能转化油酸(18:1)形成亚油酸(18:2), 具有大肠杆菌
等原核生物繁殖快、易培养的优点, 最早发展成为
基因表达系统的优良宿主菌。至今已广泛用于表达
各种外源基因 [10-11], 因此本文选择酿酒酵母营养
缺陷型 INVSc1 为受体菌来检测 FAD2 拷贝的表达
情况。
FAD2 基因是控制植物种子油酸含量的关键基
因, 目前更多的研究显示植物种子中油酸的遗传具
有多基因遗传特点, 控制油酸的基因除了 1个主基
因外, 还存在 3个或更多的微效多基因[12]。除 FAD2
功能基因外, 本研究发现在甘蓝型油菜基因组中存
在多个不具有油酸脱氢酶功能的 FAD2 拷贝, 初步
认为这些拷贝为 FAD2 假基因。这些拷贝可能是复
制或重组过程中染色体片段发生重复, 导致 FAD2
基因加倍, 在长期进化选择过程中因随机突变积累
丧失功能而成为假基因。
假基因常位于基因家族中, 是序列上与功能基
因相似但不能合成功能蛋白质的失活基因。假基因
的概念最初由 Jacq等[13]提出, 至今人们已在线虫、
果蝇、酵母基因组、人类基因组以及拟南芥、水稻
等植物基因组中发现大量假基因存在。大多数假基
因本身存在多种遗传缺陷。这些遗传缺陷包括可读
框中的无义突变; 非 3 的整数倍的核苷酸插入或缺
失导致阅读框移码和控制基因转录或剪接的调控区
的缺失突变。这些缺陷在转录水平或翻译水平引起
基因功能的损失[14]。假基因主要有下面几种类型: (1)
没有内含子、原来基因内的蛋白转译区含有一个或
数个蛋白转译终止码的基因; (2) 没有内含子的基
因, 其最后一个外显子含有 PolyA, 基因前无可信
度高、具有功能的启动子; (3) 虽然含有数个外显子,
但其基因前无具有功能的启动子, 或是原来基因内
的蛋白转译区含一个或数个蛋白转译终止码, 或缺
少可信的基因外显子的基因[15]。这 6 个 FAD2 假基
因是属于第一种类型。
目前的研究显示假基因并非完全没有功能, 对
于那些可转录的假基因, 可能具有潜在性新基因的
DNA序列, 或者具有调控其他基因表达的功能[16]。
本研究发现的 6 个 FAD2 假基因中有 2 个属于可转
录的假基因。为进一步确认这 6 个假基因是否具有
功能, 笔者在酿酒酵母中对其进行功能分析, 发现
这 6个拷贝不具有油酸脱氢酶功能, 对酵母细胞脂
肪酸组成也没有产生影响, 但其是否具有其他的调
节功能还需进一步研究验证。
440 作 物 学 报 第 36卷


图 4 酿酒酵母总脂肪酸气相色谱分析图
Fig. 4 Gas chromatographic analysis of fatty acid methyl esters extracted from yeast transformants and control
using flame ionization detection (FID)
A: 16:2和 18:2脂肪酸标准品; B: 阴性对照, 空载体 pYES2转化子; C: 阳性对照, pYES/FAD2I-3转化子; D: pYES/FAD2P1转化子。
pYES/FAD2P2, pYES/FAD2P3, pYES/FAD2P4, pYES/FAD2P5和 pYES/FAD2P6转化子的气相色谱分析结果与 pYES/FAD2P1转化子(图
4-D)类似, 因此未一一列出。
A: standard of 16:2 and 18:2 fatty acids; B: negative control, S. cerevisiae transformant with pYES2 empty vector; C: positive control, S.
cerevisiae transformant with pYES/FAD2I-3; D: S. cerevisiae transformant with pYES/FAD2I-1.
The gas chromatography analysis results of transfomants pYES/FAD2P2, pYES/FAD2P3, pYES/FAD2P4, pYES/FAD2P5, and pYES/FAD2P6
similar to that of pYES/FAD2P1 (Fig. 4-D) were not listed.

表 2 酿酒酵母转化子脂肪酸组成分析
Table 2 Composition of the major fatty acids of pYES2.0 and pYS/FAD2P1-6 yeast transformants by gas chromatographic analysis
相对的脂肪酸组分 Relative fatty acid composition (% W/W) 转化子
Transformant 16:0 16:1 16:2 18:0 18:1 18:2
pYES2.0 18.6 36.3 – 14.1 31.0 –
pYS/FAD2I-1 18.0 36.6 1.5 10.0 28.4 5.5
pYES/FAD2P1 17.9 36.0 – 15.1 31.0 –
pYES/FAD2P2 18.2 35.9 – 15.1 30.8 –
pYES/FAD2P3 19.0 36.6 – 13.8 30.6 –
pYES/FAD2P4 19.2 35.4 – 14.5 30.9 –
pYES/FAD2P5 17.3 34.6 – 14.9 33.2 –
pYES/FAD2P6 18.4 35.7 – 15.3 30.6 –
pYS/FAD2P1-6 转化子的脂肪酸酸组成与 pYES2.0转化子一致, 说明这 6个拷贝对脂肪酸代谢无影响。
The fatty acid composition of transformants pYS/FAD2P1-6 similar to that of transformant pYES2.0 suggested that the six FAD2 cop-
ies had no effect on fatty acid metabolism.

4 结论
发现甘蓝型油菜基因组中 FAD2 基因的 6 个假
基因, 其中 2个具有转录功能, 为可转录的假基因。
可能是基因组在复制或重组过程中染色体片段发生
重复, 导致 FAD2 基因加倍, 在长期进化选择过程
第 3期 肖 钢等: 六个甘蓝型油菜油酸脱氢酶(FAD2)假基因的克隆和分析 441


中因随机突变积累丧失功能而成为假基因。由此 ,
提示在进行遗传研究时应该仔细辨别真假, 避免得
出错误的结论。
References
[1] Okuley J, Lightner J, Feldmann K, Yadav N, Lark E, Browse J.
Arabidopsis FAD2 gene encodes the enzyme that is essential for
polyunsaturated lipid synthesis. Plant Cell, 1996, 6: 147−158
[2] Ohlrogge J, Jaworski J G. Regulation of fatty acid synthesis.
Plant Mol Biol, 1997, 48: 109−136
[3] Nagahara U. Genome-analysis in Brassica with special reference
to the experiments formation of B. napus and peculiar mode of
fertilization. Jpn J Bot, 1935, 7: 389−452
[4] Scheffler J A, Sharpe A G, Schmidt H, Sperling P, Parkin I A P,
Lühs W, Lydiate D J, Heinz E. Desaturase multigene families of
Brassica napus arose through genome duplication. Theor Appl
Genet, 1997, 94: 583−591
[5] Lynch M, Conery J S. The evolutionary fate and conse-
quences of duplicate genes. Science, 2000, 290: 1151−1155
[6] Hirotsune S J, Yoshida N, Chen A, Garrett L, Sugiyama F, Taka-
hashi S, Yagami K, Wynshaw-Boris A, Yoshiki A. An expressed
pseudogene regulates the messenger-RNA stability of its ho-
mologous coding gene. Nature, 2003, 423: 91−96
[7] Frank A C, Amiri H, Andersson S G. Genome deterioration:
Loss of repeated sequences and accumulation of junk DNA.
Genetica, 2002 115: 1−12
[8] Wang G-L(王关林), Fang H-J(方宏筠). Plant Gene Engineering,
2nd edn (植物基因工程·第 2版). Beijing: China Science Press,
2002. pp 744−745 (in Chinese)
[9] Wei D S, Li M C, Zhang X X, Ren Y, Xing L J. Identification
and characterization of a novel Δ12-fatty acid desaturase gene
from Rhizopus arrhizus. FEBS Lett, 2004, 573: 45−50
[10] Romanos M A, Scorer C A, Clare J J. Foreign gene expression in
yeast: A review. Yeast, 1992, 8: 423−488
[11] Niu B, Ye H X, Xu Y, Wang S H, Chen P, Peng S M, Ou Y C,
Tang L, Chen F. Cloning and characterization of a novel Δ12-fatty
acid desaturase gene from the tree Sapium sebiferum. Biotechnol
Lett, 2007, 29: 959−964
[12] Guan C-Y(官春云). Advance of high oleic acid in oil seed
breeding. Crop Res (作物研究), 2006, 20(1): 1−8 (in Chinese)
[13] Jacq C, Miller J R, Brownlee G G. A pseudogene structure in 5S
DNA of Xenopus laevis. Cell, 1977, 13: 109−120
[14] Zhang Z L, Harrison P M, Liu Y, Gerstein M. Millions of years of
evolution preserved: A comprehensive catalog of the processed
pseudogenes in the human genome. Genome Res, 2003, 13:
2541−2558
[15] Lynch M, Conery J S. The evolutionary fate and consequences of
duplicate genes. Science, 2000, 290: 1151−1155
[16] Balakirev E S, Ayala F J. Pseudogenes: are they “junk” or “func-
tional” DNA. Annu Rev Genet, 2003, 37: 123−151