全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#""")*"!$
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#
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$
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,/001,#""")*"!$,!"#$,#",#&$
!!
收稿日期$
!"#$)")"#
&修改稿收到日期$
!"#$)"+)"!
!!
基金项目$江苏省教育厅青蓝工程(科技创新团队项目"
!"#*)!*
#&江苏省教育厅青蓝工程(中青年学术带头人项目"
!"#!)!*
#&苏州市
科技支撑计划"
234!"#!"&
#
!!
作者简介$田松青"
#&-*(
#!女!硕士!副教授!高级工程师!主要从事观赏植物资源与环境修复等方面的研究)
5)67/8
$
9/710:1
;<
/1
;!
#!,=:6
!!"
通信作者$朱旭东!博士!教授!主要从事花卉育种和产业化研究)
5)67/8
$
#%+!#%"$!$
!
#%,=:6
路易斯安那鸢尾
1-230$
基因克隆和表达分析
田松青#!!朱旭东#!%"!赵沿海%!原海燕!!顾春笋!!黄苏珍!
"
#
苏州农业职业技术学院!江苏苏州
!#$""+
&
!
中国科学院 植物研究所南京中山植物园!南京
!#""#*
&
%,
南京农业大学!南京
!#""&$
#
摘
!
要$通过对路易斯安那鸢尾转录组进行分析!获得路易斯安那鸢尾络合素合酶基因"
!"#$%#
#的中间片段!利
用
>?@5
技术分别克隆到其全长!并对该基因进行生物信息学分析)结果表明!该基因全长
#+%A
B
!预测编码
$"#77
!含有半胱氨酸"
@
C
0
#*组氨酸"
D/0
#和天冬氨酸"
?0
B
#
%
个必需氨基酸活性位点和重金属离子传感器基序
"
@
%+
@
%&
>EF@
%-%
G>@
%-
#!与猴面花等植物同源
#$%
的相似位点达
&#,H
)表达分析结果表明!
!"#$%#
基因在
内花瓣表达量最高!与其他组织差异显著!雄蕊*叶和茎的表达量基本在同一水平!外花瓣*根和雌蕊表达较低!雌
蕊最低&随着铅处理时间增加!
"#$%#
基因表达量在根系和叶片中表现先升高后下降的趋势!在铅处理
%I
达到
最大并且差异显著)
关键词$路易斯安那鸢尾&
JA
胁迫&
#$%
&基因克隆&生物信息学分析&实时荧光定量
J@>
中图分类号$
K-+$
&
K-+
!!!
文献标志码$
?
%&"#
(
)!
*
+%,-)&
.
/#/"01-230$12203"45"6#/#))73#/
FL?32:1
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#
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!
MDNOPQ:1
;
#
!
%
"
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MD?RS71I7/
%
!
SN?3D7/
C
71
!
!
4N@IP10P1
!
!
DN?342PTIU1
!
"
#2PTI:PJ:8
C
9U=I1/=78L109/9P9U:V?
;
W/=P89PWU
!
2PTI:P
!
X/71
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0P!#$""+
!
@I/17
&
!L109/9P9U:VY:971
C
!
X/71
;
0PJW:Z/1=U71Q9IU
@I/1U0U?=7QU6
C
:V2=/U1=U
!
371
.
/1
;
!#""#*
!
@I/17
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%371
.
/1
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;
W/=P89PW78N1/ZUW0/9
C
!
371
.
/1
;
!#""&$
!
@I/17
#
-8/93):9
$
[:P/0/717/W/0/07\/1Q:VI/
;
I:W176U1978Z78PU:V
B
UWU11/78
B
87190
!
V:P1Q9:AU9:8UW71971Q7==P)
6P879/:1:VIU7Z
C
6U978JA,D:]UZUW
!
WU0U7W=I:19IU6:8U=P87W6U=I71/06:V[:P/0/717/W/0/08/6/9UQ,
/^9I9IU/1V:W679/:1:V!"#$%#/P9UW6UQ/79UVW7
;
6U19V:W69W710=W/
B
9:6U:V

JW:VU00:W3U/8
(
71QP0/1
;
>?@59U=I1:8:
;C
!
]U=8:1UQ!"#$%#V:W9IU
;
U1UA/:/1V:W679/=0
B
WUQ/=9/:171Q7178
C
0/0,FIU9:9788U1
;
9I
:V9IU
;
U1U]70#+%A
B
!
B
WUQ/=9/ZU=:Q/1
;B
W:9U/1=:197/1UQ$"#77,FIU
B
W:9U/1=:197/1UQ9IWUU7=9/ZUU0)
0U19/7876/1:7=/Q00/9U0
!
@
C
0
!
D/071Q?0
B
!
71QA70U0U
<
PU1=U:VIU7Z
C
6U978/:10U10:W
!
@
%+
@
%&
>EF@
%-%
G>@
%-
,FIU=:10UWZ79/ZU7178
C
0/0]/9I:9IUWI:6:8:
;
:P0#$%V:P1Q9I790/6/87W8:=/]70&#,H,FIU
I/
;
IU09U_
B
WU00/:1:V!"#$%#]70V:P1Q/1/19UW
B
U9780:V[:P/0/717/W/0
!
71Q0/
;
1/V/=719Q/VVUWU1=U0]/9I
:9IUW:W
;
710,FIU076UU_
B
WU00/:18UZU8]70V:P1Q/10976U10
!
8U7ZU071Q09U60,FIUU_
B
WU00/:1/1:P9UW
B
U9780
!
W::9071Q
B
/09/80]UWU8:]UW
!
71Q9IUU_
B
WU00/:1/1
B
/09/8]709IU8:]U09,
;2
.
<"3!/
$
[:P/0/717/W/0
&
JA09WU00
&
#$%
&
=8:1/1
;
&
A/:/1V:W679/=07178
C
0/0
&
>U78)9/6U>F)J@>
!!
植物络合素"
B
I
C
9:=IU879/1
!
J@0
#是以谷胱甘肽
"
42D
#为底物通过植物络合素合酶"
B
I
C
9:=IU879/1
0
C
19I70U
!
J@2
!包括
J@!
*
J@%
等#催化而成+#,!能与
重金属结合成复合体而对重金属解毒起着重要作
用+!)*,)目前植物络合素合酶基因"
#$%
#已在拟南
芥+$,*小麦+#,*芥菜+,*大蒜+-,*生菜+,*百脉根+&,*豆
梨+#",*蕃茄+##,*毛白杨+#!,和湖北海棠+#%,等植物中
分离得到!已分离
#$%
的功能验证初步证明其在植
物重金属铅螯合解毒过程起重要作用)过表达小麦
络合素合酶基因"
&#$%#
#的木立烟草"
(")*+",
-
./)>,4W7I76
#植株大大增加铅"
JA
#耐受性!比
野生型植物幼苗根长
#"H
&生长在矿区土壤中的
转基因植株的
JA
浓度达
#$-!6
;
%
;
!是野生型的
!
倍+#*,)
[:6A/
等+#$,证明与
J@0
合成和络合相关
的螯合
JA
能增加耐
JA
植物的耐性)
JA
超富集植
物水生蕨类
%.0","1","1
体内
J@0
的合成量与
JA
积累量有着直接关系!推论植物螯合肽络合作用
是耐
JA
机 制 之 一+#,)香 根 草 "
23+"034"5"6
5,"*"738
#在添加外源
J@0
的条件下!体内形成
J@0)JA
复合物!根和地上部可以累积到
#&+""
和
%%$"6
;
%
;
+
#-
,
)在矿区实地试验中发现!表达
&#$%#
的欧美杂种山杨 "
#*
9
/./8+431/.`
+431/.*"738
#品种
59WU
B
:8U
(转基因株系的总生物
量及
JA
积累量显著高于对照植株+#+,)但是!不同
物种植物螯合肽所起的作用差异较大!如
J@0
在蚕
豆
JA
耐性中所起作用很小+#&,!
JA
富集植物矿山生
态型东南景天"
%37/1.
:
437""
#在
JA
胁迫下没有
诱导
J@0
合成+!",)在
JA
胁迫下金鱼藻"
$34+*6
9
;
<
../1731348/1[,
#体内的
42D
*
@
C
0
有所增加
和诱导
J@!
*
J@%
螯合肽合成+!#,)
4P
B
97
等+!,报道
42D
"
J@0
的合成前体#在东南景天
JA
解毒的作
用!虽然这一过程没有任何诱导
J@0
!这说明
42D
在没有
J@0
产生的条件下也能担任重要的解毒
功能)
路易斯安那鸢尾"
[:P/0/717/W/0
#是一类观赏价
值很高的宿根植物!具有一定的吸收和忍耐重金属
JA
的能力+!!,!目前相关路易斯安那鸢尾
#$%
基因
的研究尚未见报道!且该基因在重金属
JA
螯合解
毒等中的研究非常有限)本研究测定
JA
处理前后
根系*根状茎和叶片中
JA
含量变化!探讨路易斯安
那鸢尾吸收和忍耐重金属
JA
的能力)并利用在转
录组序列分析和
>3?)2U
<
技术检测初步筛选出差
异表达的易斯安那鸢尾
!"#$%#
基因片段!通过
>?@5
技术克隆获得全长!荧光定量
>F)J@>
技术
分析其不同时间
JA
处理和组织特异性表达!进一
步验证其富集铅生长*结构+!!,和生理生化+!%,特性!
为探讨路易斯安那鸢尾品种
JA
富集耐性的分子机
理机制奠定基础)
#
!
材料与方法
$,$
!
材
!
料
试验材料为路易斯安那鸢尾品种
JW:VU00:W
3U/8
(!由美国引进)试验于
!"#%
年
&
月在南京中
山植物园温室进行)
$,=
!
方
!
法
$,=,$
!
铅含量测定
!
选择生长一致的路易斯安那
鸢尾分株苗!置于
$"H D:7
;
871Q
营养液培养!
%"Q
后生根达
%=6
以上长度后!移栽于
![
塑料盆!换
成
#"H D:7
;
871Q
营养液)
JA
以
JA
"
3R
%
#
!
形式
加入!浓度分别为
"
*
!""
*
""
及
""6
;
%
[
!重复
%
次!每周换
#
次处理液)处理后
#
个月取样!用
D3R
%
)D@8R
*
消化法和电感耦合等离子体原子发
射光谱法"
L@J
!
JUW\/1)586UW%%""aG
#测定植株体
内各部分
JA
含量)采用
5_=U8!"#"
和
2J22#&
软
件对试验数据进行统计和方差分析!用邓肯多重
比较)
$>=>=
!
路易斯安那鸢尾
1-230$
基因克隆
!
!
#
"总
>3?
提取
!
路易斯安那鸢尾幼苗用
#
%
!D:7
;
871Q
营养液水培预培养
%"Q
!采集新鲜叶片和根系)根
据
FW/T:8
B
8P0
试剂说明书!用新鲜叶片和根系提取
总
>3?
)
!"克隆
!"#$%#
基因中间序列
!
从路易斯安
那鸢尾转录组数据中筛选出
!"#$%#
基因相关序列
片段信息"
=:6
B
#$!##
-
="
-
0U
<
$
#!根据
4U1Y71中已登录的
#$%
同源基因的核苷酸和氨基酸序列!
利用
@8P0978^
软件在线比对其序列同源性和分析
保守区域&利用
JW/6UW$
和
R8/
;
:-
软件根据转录
组中的信息和网上保守区序列设计中间产物引物
"表
#
#)使用逆转录酶合成
a3?
第
#
条链!即
=a)
3?
)再以
=a3?
经
J@>
反应扩增中间片段!扩增
程序为 $
&*b
预变性
$6/1
&
*b
变性
*"0
*
$"b
退火
*"0
*
-!b
延伸
$"0
!共
%!
个循环&
-!b
延伸
#"6/1
)
J@>
扩增得到
!"#$%#
基因中间产物并
进行电泳切胶回收!然后连接到载体上!转化后对阳
性克隆进行测序)
!
%
"
!"#$%#
基因
%c
端序列的克隆
!
利用
JW/6UW$
和
R8/
;
:-
软件!根据测序获得的中间序
列设计
%c
端特异
J@>
引物"表
#
#)采用
@8:19U=I
公司的
2E?>FUW
FE
>?@5=a3? ?6
B
8/V/=79/:1
d/9
试剂盒获得该基因的
%c
端序列)
!
*
"
!"#$%#
基因
$c
端序列的克隆
!
利用
JW/6UW$
和
R8/
;
:-
软件!根据测序获得的中间序
-$&#
#"
期 田松青!等$路易斯安那鸢尾
!"#$%#
基因克隆和表达分析
表
$
!
基因克隆和
*
,?@+%,
所用引物序列
F7A8U#
!
JW/6UW0P0UQV:W
;
U1U=8:1/1
;
71Q
<
>F)J@>
引物用途
JW/6UWUVVU=9
引物名称
JW/6UW176U
引物序列
JW/6UW0U
<
PU1=U
"
$c
#
%c
#
中间片段
L19UW6UQ/79UVW7
;
6U19
?"-&e @F4??44??F@?@?FF@44@
?"-&> @FF4?4????F44?4FF4F@4
$c)>?@5
"
42J#
#
?"-&)# @@@??F4?44?44?F?4@4
"
42J!
#
?"-&)! @?4@?F4?F??@@?@@4?FF44
"
42J%
#
?"-&)% 4@?@?4F4?4@@??4@?F4@4@
%c)>?@5
"
42J#
#
%
(
--)# @@@44@??44??F@?F4F@FF??@?
"
42J!
#
%
(
--)! F@@@4?F4F?@FF@?44?44?44FF@
<
>F)J@>
#$-)e 44@44FFF4@4F?FF44
#$-)> F@FF@@@F4@4FF?F@@@F
内参基因
NY@>UVUWU1=U
;
U1UNY@
#$-)NY@)e F@F@4@FF4F@@44FFF4F4
#$-)NY@)> ?@@FF444F44@FF4??F44
列设计
$c
端正向
J@>
引物和反向特异
J@>
引物
"表
#
#)采用
L1Z/9W:
;
U1
公司的
$c>?@52
C
09U6
V:W>7
B
/Q ?6
B
8/V/=79/:1:V=a3? 51Q0
!
GUW0/:1
!,"
试剂盒获得
!"#$%#
基因的
$c
端序列)
!
$
"序列拼接
!
采用
a3?E?3
软件对克隆得
到的
$c
端*
%c
端和中间序列进行首尾拼接!得到
!"#$%#
基因的全序列)
$>=>A
!
1-230$
编码蛋白和生物信息学分析
!
使用
R8/
;
:-
软件分析该基因编码的氨基酸序列)从
3@YL
数据库中选取与
!"#$%#
基因编码的氨基酸
序列
A8709
B
相似度大于
+"H
的植物同源氨基酸序
列!通过
@8P0978^
软件分析
!"#$%#
基因编码的
氨基酸序列的保守性!并基于此基因编码的氨基酸
序列*利用
E54?
软件中的泊松分布模式构建相
似植物的系统树)采用
2RJE?
软件在线分析
!"#$%#
基因编码的蛋白质的二级结构!并通过
FEDEE!,"
软件在线分析该蛋白质的跨膜结构
域)将克隆到的
!"#$%#
基因序列采用
E54?
软
件比对其亲缘关系)
[/J@2#
蛋白保守结构域通过
B
V76
"
I99
B
$%%
B
V76,_V76,:W
;
#在线分析完成)蛋
白质三维结构预测在
I99
B
$%%
0]/006:QU8,U_
B
70
C
,
:W
;
上进行!并通过
I99
B
$%%
]]],UA/,7=,P%
L19UW)
JW:2=71
寻找该类蛋白在不同物种中的分布)
$>=>B
!
1-230$
实时荧光定量
+%,
!
收集路易斯
安那鸢尾的根*茎*叶和花等不同组织的新鲜样品各
%
份!同时选取植株大小和长势一致的分株苗进行
不同时间长度"*
#
*
%
*

*
#!
和
!*I
#铅"浓度为
!""
6
;
%
[
#的处理!重复
%
次!处理后收集新鲜的根系和
叶片)收集的样品于液氮中速冻!之后保存于
(+"b
超低温冰箱备用)使用试剂盒提取上述样
品总
>3?
!用随机引物将
>3?
反转录成
=a3?
!采
用
2SY>4>553
染料法!以
NY@
为内参基因!根
据已克隆的基因序列用
JWU6/UW$,"
软件设计特异
性检测引物"表
#
#!做相对定量检测)将毛细管置
于定量
J@>
仪"
>:=IU
公司#中!设定荧光采集通道
以及读取荧光步骤!按照以下反应程序进行
J@>
反
应$
&*b
预变性
%"0
&
*b
变性
!"0
!
$$b
退火
!"
0
!
-!b
延伸
%"0
循环
*$
次!
-!b
单点检测信号&
最后加入溶解曲线程序$
&$b"0
!
"b#$0
!
&$b
"0
!连续检测信号)相对转录水平采用
!
(
$$
@9法进
行计算)数据处理同
#,!,#
)
!
!
结果与分析
=>$
!
路易斯安那鸢尾对
+8
的吸收
从图
#
可以看出!路易斯安那鸢尾根系*根状茎
和叶片
JA
含量随
JA
浓度的增加而增加!并以根系
JA
含量最大!叶片最小)根系在低浓度
!""6
;
%
[
JA
处理时积累量为
%%"$"6
;
%
;
!与对照差异显
著&而在
JA
浓度
*""
和
""6
;
%
[
时增加不显著!
""6
;
%
[
时达到最大值"
%!$$,+6
;
%
;
#)根状
茎在
!""6
;
%
[JA
处理时与对照差异显著!在
""
6
;
%
[
时达到最大"
#$6
;
%
;
#!各浓度处理都差
异显著)叶片与根状茎接近!低浓度时对
JA
积累
非常小!在
JA!""6
;
%
[
时仅为
*,6
;
%
;
!没有
显著差异&在高浓度
JA""6
;
%
[
时达到最大值
"
#!*&,+6
;
%
;
#!与对照差异显著)
=>=
!
1-230$
基因全长及生物学信息分析
=,=,$
!
基因全长及编码蛋白质
!
扩增到路易斯安
那鸢尾
!"#$%#
基因的中间片段
##$#A
B
"图
!
!
7
#)
根据获得的中间片段序列!设计特异引物!
%c)
>?@5
扩增得到
%*%A
B
片段"图
!
!
A
#)
$c)>?@5
扩增得到
%%$A
B
片段"图
!
!
=
#)用
a3?E?3
软
+$&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
件进行序列拼接后得到基因完整序列"图
%
#!其总
长
#+%A
B
!
4U1Y71登录号为
dF%*-"&%
!其开放
阅读框"
R>e
#为
#$"%A
B
!
$c
非编码区
-A
B
!
%c
非
编码区
#"$A
B
!预测编码蛋白质含
$"#77
"图
%
#)
与其他植物
#$%
基因类似!路易斯安那鸢尾
!"#$%#
基因编码产物由
3
端"
*
个氨基酸#*保守
区"
!"+
个氨基酸#和
@
端可变区"
!+&
个氨基酸#组
成!氨基端高度保守!共含
#+
个半胱氨酸"
@
C
0
#残
基!其中含有
@
C
0)$
*
D/0)#!
和
?0
B
)#+!
等
%
个必
需的氨基酸活性位点!它们组成催化三联体来起活
性作用)
@
末端具有植物络合素合酶的重金属离子
传感器基序
@
%+
@
%&
>EF@
%-%
G>@
%-
"图
%
#)
=,=,=
!
蛋白结构分析
!
路易斯安那鸢尾
!"#$%#
基因编码蛋白
B
V76
比对结果显示!它具有
!
个典
图
#
!
JA
胁迫下路易斯安那鸢尾各器官中
JA
含量
小写字母表示处理间
","$
水平显著性
e/
;
,#
!
JA=:19U190/1Q/VVUWU19:W
;
710:V[:P/0/717
/W/0]/9IJA9WU796U19
FIU=:8P619I79QU1:9UQA
C
Q/VVUWU198U99UW06U710/
;
1/V/=719
Q/VVUWU1=U76:1
;
9WU796U19079","$8UZU87==:WQ/1
;
9:
:1U)]7
C
7178
C
0/0:VZ7W/71=U
型的植物络合素亚家族结构域!该结构域是
J@2
蛋
白的典型特征结构!表明了克隆的路易斯安那鸢尾
!"#$%#
所编码的蛋白为植物络合素合酶)通过
2RJE?
软件在线对路易斯安那鸢尾
!"#$%#
进行
分析!路易斯安那鸢尾
[/J@2#
蛋白是由
"
螺旋*延
伸链和不规则螺旋等结构元件组成!其中
"
螺旋占
*&,$"H
!延 伸 连 占
#!,#+H
!不 规 则 螺 旋 占
%+,%!H
)
FEDEE
软件在线分析
[/J@2#
蛋白质
不具有跨膜结构!不是膜蛋白)在
I99
B
$%%
0]/00)
6:QU8,U_
B
70
C
,:W
;
上利用
?P9:679/= E:QU8/1
;
E:QU
预测了路易斯安那鸢尾
[/J@2#
蛋白的三维
结构!同时与豆梨
J=J@2#
*拟南芥
?9J@2#
和百脉
根
[
.
J@2#
蛋白的三维结构+#",进行比较!认为这
*
个蛋白具备类似的空间构架)
=,=,A
!
蛋白质保守性及进化树分析
!
通过
3@YL
数据库直接搜索相关
J@2#
氨基酸序列及利用
!"#$%#
序列采用
A8709
B
的方法!共从数据库中筛
选出
#"
种同源氨基酸序列$油棕
=.3"8
-
/",33,8"8
"
OJ
-
"#"&%$&%,#
#*海枣
#;*3,">7)+
<
."
:
34
"
OJ
-
""++#"*!&,#
#*大蒜
?.."/18+"0/1
"
??R#%+"&,#
#*
葡萄
2"+"80","
:
34
"
OJ
-
""!!-!!%-,!
#*莲
(3./16
@*,/)"
:
34
"
3J
-
""#!+&---,#
#*蓖麻
A")",/8)*16
1/,"8
"
OJ
-
""!$!&+%$,#
#*小桐子
B+4*
9
;)/4)8
"
OJ
-
"#!"+$!-$,#
#*甜 橙
$"+4/8 8",3,8"8
"
daR"*!*,#
#*拟南芥
?4@"7*
9
8"8+;.",
"
3J
-
#&&!!",#
#和节节麦
?3
-
".*
9
8+/8);"
"
5EF!%##,#
#)
利用
@8P0978]
软件分析同源氨基酸序列!其氨基酸
相似位点占
+%,#H
"图
$
中所有彩色部分字母表示
氨基酸相似位点#!氨基酸完全相同位点占
%*,"H
"图
$
中黄色部分字母表示氨基酸完全相同位点#)
分析结果同时显示!
J@2#
蛋白
3)
端氨基酸保守性
强!应该是功能区域!
@)
端氨基酸序列变异性变化较
图
!
!
!"#$%#
基因
J@>
产物凝胶电泳
E,a[!"""
&
7,
中间片段&
A,%c)>?@5
&
=,$c)>?@5
e/
;
,!
!
J@>
;
U8U8U=9W:
B
I:WU0/0:V!"#$%#
E,a[!"""
&
7,J7W9/78VW7
;
6U19
&
A,%c)>?@5
&
=,$c)>?@5
&$&#
#"
期 田松青!等$路易斯安那鸢尾
!"#$%#
基因克隆和表达分析
图
%
!
!"#$%#
基因全长及编码氨基酸序列
圆圈标出半胱氨酸残基
e/
;
,%
!
FIUVP88U1
;
9I:V9IU!"#$%#
;
U1U71Q76/1:7=/Q0U
<
PU1=U
@
C
0WU0/QPU0I7ZUAUU167W\UQ]/9I=/W=8U0
大)
J@2
普遍存在于微生物*动植物等不同物种
中!表明不同物种共有
J@2
催化合成植物络合素的
这一生物途径)
利用
E54?
分析这
#"
种同源氨基酸序列同
[/J@2#
的进化关系"图
*
#!反映了
J@2#
在植物进
化方面有一定的亲缘关系一致性!如棕榈科"油棕和
海枣#)路易斯安那鸢尾
[/J@2#
与海枣和油棕关
系最近!与其他植物关系较远)
=>A
!
1-230$
不同组织表达特性分析
分别提取路易斯安那鸢尾根*茎*叶*外花瓣*内
花瓣*雄蕊和雌蕊的总
>3?
!
Ra
!"
%
Ra
!+"
在
#,&
#
!,"
间!表明
>3?
纯度较好!可进行后续试验)如
图

所示!
"#$%#
不同组织表达量为$内花瓣
%
雄
蕊
%
叶
%
茎
%
外花瓣
%
根
%
雌蕊!其中内花瓣最高!
与其他组织有显著差异!雄蕊*叶和茎在同一表达水
平!外花瓣*根和雌蕊表达较低!雌蕊最低)
=>B
!
1-230$
响应
+8
胁迫的表达特性分析
铅处理
"
*
#
*
%
*

*
#!
和
!*I
后!分别提取路易
图
*
!
[/J@2#
同其他物种
J@2#
蛋白的进化分析
标尺代表遗传距离&括号中内容为登录号
e/
;
,*
!
JI
C
8:
;
U1U9/=WU879/:10I/
B
0AU9]UU1[/J@2#
71Q:9IUW
B
8719J@2#0
FIU0=78UA7WWU
B
WU0U190
;
U1U9/=Q/0971=U
&
FIU7==U00/:13:,]UWU
;
/ZU1/1AW7=\U90
斯安那鸢尾的根系和叶片的总
>3?
后!进行荧光
定量分析)如图
-
所示!路易斯安那鸢尾
!"#$%#
基因在根系和叶片组织中的转录水平不同!在叶片
中表达普遍比在根系中表达高)随着铅处理时间增
"&#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
%$
卷
#&#
#"
期 田松青!等$路易斯安那鸢尾
!"#$%#
基因克隆和表达分析
图

!
!"#$%#
在路易斯安那鸢尾各组织中的表达
小写字母表示
","$
水平显著性
e/
;
,
!
a/VVUWU19U_
B
WU00/:1:V!"#$%#/1Z7W/:P0
9/00PU0:V[:P/0/717/W/0
FIU=:8P619I79QU1:9UQA
C
Q/VVUWU198U99UW06U710/
;
1/V/=719
Q/VVUWU1=U79","$8UZU87==:WQ/1
;
9::1U)]7
C
7178
C
0/0:VZ7W/71=U
图
-
!
路易斯安那鸢尾
!"#$%#
受不同时间
铅胁迫后的表达模式
小写字母表示
","$
水平显著性
e/
;
,-
!
a/VVUWU19U_
B
WU00/:1
B
799UW10:V!"#$%#/19IU
8U7ZU071QW::90:V[:P/0/717/W/07V9UWQ/VVUWU19
9/6U9WU796U190]/9IJA
FIU=:8P619I79QU1:9UQA
C
Q/VVUWU198U99UW06U710/
;
1/V/=719
Q/VVUWU1=U79","$8UZU87==:WQ/1
;
9::1U)]7
C
7178
C
0/0:VZ7W/71=U
加!
"#$%#
基因在根系和叶片中表达量都表现出
先升高后下降的趋势!并均在铅处理
%I
达到最大
值!产生显著差异!在
!*I
时接近对照)
%
!
讨
!
论
在
JA
胁迫条件下!路易斯安那鸢尾
JW:VU00:W
3U/8
(的根*根状茎和叶片!
JA
最大吸收量分别达到
%!$$,+
*
#$,"
和
#!*&,+6
;
%
;
!符合铅富集植
物叶片或地上部"干重#含
JA
达到
#"""6
;
%
;
以
上的条件!说明路易斯安那鸢尾具有一定的吸收和
忍耐重金属铅的能力)路易斯安那鸢尾为成年分株
苗!生物量大!特别是具有粗状的根状茎!积累了一
定的营养!可能对植株逆境抗性等方面起着十分重
要的作用)
重金属胁迫可诱导植物产生
J@0
并与之结合
形成硫肽复合物!以降低对植物毒害)
J@0
的活性
和植物耐重金属能力与
J@0
中的
@
C
0
残基的位置
和排列方式关系密切+!*)!$,)本研究所克隆的路易斯
安 那 鸢 尾
[/J@2#
与
?9J@2#
+
$
,
*
[
.
J@2#
+
&
, 和
J=J@2#
+
#"
,等编码蛋白!都含有
@
C
0
$
*
D/0
#! 和
?0
B
#+!等
%
个必需的氨基酸活性位点!它们组成催
化三联体起活性作用)其次!
@
末端的
@@OOO)
@OO@
基序为植物络合素合酶的重金属离子传感
器+!,!也与螯合重金属离子有关)
?9J@2#
*
[
.
J@2#
和
J=J@2#
表达蛋白分别表现为
@
%$+
@
%$&
OOO@
%%
OO@
%
*
@
%+
@
%&
>5F@
%-%
Ed@
%-和
@
%&
@
%-"
K5F@
%-*
Gd@
%--
!路易斯安 那鸢 尾
[/J@2#
蛋 白基序与
!
C
#$%#
一致的!这
*
个蛋白在生物体内可能行使
类似的功能)
@
C
0
%$+
*
@
C
0
%$&
*
@
C
0
%%和
@
C
0
%点突变
后的
?9J@2#
蛋白!在
@Q
!f或
M1
!f存在条件下!植
物络合素合成能力下降+!,!从试验上证明了这一
可能)
D7
等+$,研究
?+#$%#
基因在拟南芥中的表达
规律时发现!无论
@Q
!f是否存在!
?+#$%#
在根部
的表达丰度均显著高于叶片组织)与此略有不同的
是!路易斯安那鸢尾
!"#$%#
在根中的表达丰度低
于成熟叶片!表明
#$%
基因在不同植物之间具有不
同的表达模式!叶片是路易斯安那鸢尾
!"#$%#
基
因的主要合成部位!在开花时!内花瓣和雄蕊表达特
别高)荧光定量
J@>
分析表明!路易斯安那鸢尾
!"#$%#
基因受重金属铅胁迫诱导上调表达!其中
在叶中的表达量显著增加!大于在根中的增加量!这
与豆梨
#)#$%#
+
#"
,
*萝卜
A8#$%
+
!-
,和
D,#$%#
+
!+
,
基因的表达特征一致!而与小麦
&#$%#
+
!+
,的结果
相反!这可能是因为路易斯安那鸢尾属多年生根茎
类水生植物!叶的生命周期只有一个生长季节!新叶
不断代替老叶!进而保持较高的活力)
以上结果表明!路易斯安那鸢尾
!"#$%#
在保
护其免受重金属铅毒害的过程中可能起到一定作
用!但基因上调的倍数较低!还需构建该基因的过表
达载体!转化拟南芥等植物对其功能进行验证)
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