全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$)##)"#
基金项目$国家
1(%
(项目"
!"##22#"2#"*
#&教育部博士点基金"
!"##"!"*#!""#$
#&杨凌示范区自然基金"
!"#*34)#&
#&西北农林科技大
学唐仲英育种基金
作者简介$刘
!
璐"
#&1&
#!女!在读硕士研究生!主要从事油菜生物技术及育种研究)
5)67.8
$
%1#"%((1#
!99
+:;6
"
通信作者$徐爱遐!教授!博士生导师!主要从事油菜遗传育种研究)
5)67.8
$
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!
#(%+:;6
芥菜型油菜黄籽基因分子标记的开发
刘
!
璐!黄
!
镇!卢
!
虹!郎丽娜!赵
!
娜!徐爱遐"
"西北农林科技大学 农学院!陕西杨陵
,#!#""
#
摘
!
要$该研究在前期对*吴旗黄芥+黄籽性状遗传图谱研究的基础上!利用白菜及拟南芥基因组信息!在芸薹属白
菜
2
基因组
>2?
克隆
@>AB#"$C#$
上设计了
$
对
D?2E
引物!在拟南芥第
%
染色体黄籽基因的同源区域
2F%
G
#*#!"
与
2F%
G
!&(#$
附近设计了
(
对
CH
引物!
##
对引物分别扩增
I
!
群体"*吴旗黄芥+
J
*武功褐芥+#的
#!#!
个单株!开发与*吴旗黄芥+黄籽基因更近的分子标记)结果表明$来自于白菜
2
基因组
>2?
克隆
@>AB#"$C#$
上
的
4#!
"
4#!
为共显性标记#!以及来自于拟南芥第
%
染色体同源区域
2F%
G
!*#1"
的
CH)(
表现与*吴旗黄芥+黄籽基
因紧密连锁!其遗传距离分别为
"+!
和
"+#:K
!较之前最近的标记距离分别缩短
"+%
和
"+!:K
)这
!
个标记的开
发对开展*吴旗黄芥+黄籽基因的克隆奠定了基础)
关键词$芥菜型油菜&黄籽基因&标记开发
中图分类号$
L,1&
文献标志码$
2
$%&%"
(
)%*+",-"%./01-012%134#*2%!+"+5%6%"7
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2
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BN23OPQR0
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G
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PB2S37
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G
R;U2
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G
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G
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G
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Y
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G
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!
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G
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G
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G
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Y
R8;V/RRZ:;8;A
G
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[
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[
A.6RA/VRAR=/RZF;76
[
8.U
Y
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!
[
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[
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G
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*
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9
.
Y
R8;V)/RRZRZ
+
70Z
*
=^
G
;0
G
\A;V0)/RRZRZ
+
6=/F7AZ+2/7AR/=8F
!
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2F%
G
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Y
R8;V/RRZ:;8;A
G
R0RF.
G
QF8
Y
!
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FV;67A_RA/VRAR8;:7FRZ;0R.FQRA/.ZR;UFQRF7A
G
RF
G
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G
R0RF.:Z./)
F70:R/VRAR/Q;AFR0RZY
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!
AR/
[
R:F.XR8
Y
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[
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[
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[
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8
Y
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[
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G
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G
FQR
Y
R8;V/RRZ:;8;A
G
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Y
R8;V)/RRZRZ6=/F7AZ+
>%
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7"1!3
$
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-
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&
Y
R8;V/RRZ:;8;A
G
R0R
&
67A_RA/ZRXR8;
[
6R0F
!!
油菜种子成熟时种皮有黄,褐,红褐,黑等颜色!
研究表明相同遗传背景下黄籽油菜比褐籽油菜有种
皮薄,纤维含量低,含油量高,蛋白质含量高,油清澈
透明,品质良好等优点-#)!.!因此受到育种家的广泛
关注)*吴旗黄芥+是广泛分布于陕北高原的黄籽芥
菜型油菜地方品种!由于特殊的地理环境以及气候
特点!形成了该地区植物资源遗传的独立性-%.)*吴
旗黄芥+不仅耐瘠薄,抗旱,抗裂荚!而且具有黄色和
褐色两种分类较为清楚的种皮颜色)在先期对吴旗
黄芥的研究表明该类型的黄籽性状仅受
#
对主效基
因控制!褐籽相对黄籽表现显性-*.)
T=
等-$.成功开
发黄籽
2IMH
标记构建了吴旗黄芥黄籽基因的连
锁图谱!
B=70
G
等-(.利用该图谱将基因定位到芸薹
属基因组
2"&
上!其同源区域位于拟南芥的第
%
染
色体上!并且绘制了由
!%
个标记排序定位褐籽基因
的连锁图谱!其中两侧最近的分子标记和黄籽基因
的距离分别为
"+$
和
"+%:K
)班元元等-,.将*吴旗
黄芥+黄籽基因最近的分子标记
52"!K?"1
的序列
采用
V78_.0
G
技术进行了延长!确定该标记的侧翼
序列位于芸薹属
2
基因组
>2?
克隆
@>AB#"$C#$
上)但是基础的定位对于黄籽基因的克隆还是不够
的!需要开发更多的分子标记精细定位该基因)
内含子是广泛存在于真核生物基因组中的非编
码序列!通常认为它的变异程度高于编码序列!因此
可以利用内含子的多态性开发标记-1.!内含子多态
性主要包括内含子长度多态性"
.0FA;08R0
G
FQ
[
;8
Y
)
6;A
[
Q./6
!
CMH
#和内含子单核苷酸多态性"
.0FA;0
/.0
G
8R
[
;8
Y
6;A
[
Q./6
!
CD3H
#两种类型!在内含子两
侧的外显子上设计引物!将内含子扩增出来进行检
验其多态性-&.)
CH
标记简单易操作!多态性高!结
果稳定可靠!最重要的是
CH
标记是基因内标记!因
为
CH
标记只分布于基因组中存在基因的区域!用
CH
标记构建的分子遗传图谱可以直接反映基因的
连锁关系)
CH
标记保守性强!在不同的物种间建立
起对应关系!使不同物种的分子遗传图谱可以相互
比较-#")#%.)谢彦周等-#*.利用拟南芥与油菜共线性
设计了
#!!
对
CH
引物!获得了
!%
对与目标基因紧
密连锁的
CH
标记!最终实现了目标基因的精细定
位&李霞等-#$.利用拟南芥
11
基因开发的
CH
标记
克隆了白菜型油菜种皮色泽基因
!"111
)因此!这
些成功的研究都表明
CH
标记对芥菜型油菜黄籽基
因的克隆是有效的)
大量研究表明油菜与拟南芥,白菜基因组之间
存在很好的线性关系-#()#,.!许多位点在这些物种中
都是保守的)拟南芥及白菜
2
基因组的序列已经
公布!所以利用拟南芥及白菜
2
基因组的序列开发
更近的分子标记成为可能)本研究的目的是在前期
定位的基础上!借助拟南芥及白菜
2
基因组已公布
的序列信息开发与*吴旗黄芥+黄籽基因连锁的
CH
以及
D?2E
标记!缩小*吴旗黄芥+黄籽基因所处的
区域)利用
B=70
G
等-(.公布的*吴旗黄芥+黄籽基
因在拟 南芥 上的同源区 域位 于
2F%
G
#*#!"
到
2F%
G
!&(#$
之间!在此区域附近随机选取位点!根据
所选基因的外显子序列设计引物!开发
CH
标记)利
用班元元等-,.公布的分子标记
52"!K?"1
的侧翼
序列 位 于 芸 薹 属 白 菜
2
基 因 组
>2?
克 隆
@>AB#"$C#$
上!开发
D?2E
标记)通过以上途径
开发的标记!将会加密黄籽基因的遗传连锁图谱!基
因所处的遗传距离缩小至
"+#:K
时可初步获得黄
籽的候选基因)
#
!
材料和方法
@+@
!
试验材料及群体构建
本试验的供试材料为*吴旗黄芥+"
!"#$$%&#
-
./&0#M+
#和*武功褐芥+"
!"#$$%&#
-
./&0#M+
#杂交
构建的
I
!
群体)由西北农林科技大学油菜研究中
心资源品质课题组提供)
*吴旗黄芥+和*武功褐芥+均连续自交
(
代以
上!粒色性状稳定)于
!"#!
年
&
月大田中播种由上
一年亲本杂交"*吴旗黄芥+
#
J
*武功褐芥+
$
#获得
的
I
#
代种子!
"#%
年
*
月花期对每一个单株进行
套袋自交!并且对每一个单株进行编号!作为作图群
体!同年
(
月收获
I
!
代种子&同年
&
月播种
I
!
代种
子!将每一个单株收获的种子播种
#
行"每行约
#"
株#!于
!"#*
年
*
月花期自交!同年
(
月将每一行的
种子进行混收!获得
I
%
代!
I
%
种子的表现型对
I
!
代单株基因型进行鉴定!于
!"#*
年
&
月播种
I
%
代!
每一个编号的种子种
!
行"每行约
#"
株#!于
!"#$
年
(
月混同一编号的
!
行种子"
I
*
种子#!观察种皮
颜色是否为单一颜色!以此确定
I
%
代褐籽群体中纯
合基因型和杂合基因型)
本研究所有田间试验在陕西杨陵西北农林科技
大学试验田完成)
@;A
!
B
A
群体取样及各代种子种皮考察
!"#%
年
&
月播种
I
!
代群体!待油菜植株长至
*
"
$
叶期对所有单株进行挂牌取样!于次年
*
月对
所有挂牌的单株进行套袋自交!
(
月分单株收获!记
录每一个单株的种皮颜色!分为黄"包括暗黄,亮黄#
和褐"深褐,红褐#两大类型"图
#
#)
@;C
!
$D<
提取
对
*
"
$
叶期
I
!
单株进行取样!进行全基因组
3`2
的提取!取
#
G
左右的新鲜叶片采用
?]2>
法
!&#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
提取!参考
;`
Y
8R
等-#1.的方法!对
3`2
质量进行检
测及浓度测定!最终将样品的
3`2
浓度稀释至
$"
0
G
%
#
M
使用)
@;E
!
FG
和
89标记的引物设计
在
3?>C
中 搜 索 拟 南 芥
2F%
G
#*#!"
到
2F%
G
!&(#$
之间的序列!随机选取
*
个基因的外显
子序列!设计
(
对引物!保证所设计的引物序列落在
外显子上&将黄籽基因和芸薹属
2
基因组
>2?
克
隆
@>AB#"$C#$
进行比对!从白菜
2
基因组
>2?
克隆数据库中下载目标基因!在此基因上不同位置
随机设计
$
对引物!共计
##
对引物"表
#
#)用
HA.6RAHAR6.RA$+"
软件设计引物!由上海生工生
物工程有限公司合成引物)
图
#
!
I
!
代群体种皮颜色分类
2+
暗黄&
>+
亮黄&
?+
深褐&
`+
红褐
I.
G
+#
!
?87//.U.:7F.;0;U/RRZ:;7F:;8;A.0
7/=\/RF;UFQRI
![
;
[
=87F.;0/
2+`7A_)
Y
R8;V
&
>+>A.
G
QF)
Y
R8;V
&
?+`7A_)\A;V0
&
`+ERZ)\A;V0
@;I
!
FG
及
89标记的开发
将上述
(
对
CH
引物和
$
对
D?2E
引物分别扩
增一个来源于
I
!
群体的
#!
个黄籽"
YY
#与
#!
个纯
合褐籽"
44
#所组成的小群体!检测这些引物在此小
群体中是否具有多态性)经小群体检测具有多态
性!产物条带单一且清晰的引物序列用做大群体的
筛选!以确定标记和基因的关系)
H?E
反应体系为$
3`2
模板$
!
#
M
"
$"6
G
%
M
#!
正向和反向特异引物"上海生工合成#
"+*
#
M
"
#"
#
6;8
%
M
#!
Z3]H"+!
#
M
"
#"66;8
%
M
#!
K
G
?8
!
#+!
#
M
"
!$
#
6;8
%
M
#!
#"JH?E\=UURA#+$
#
M
!
3`2
聚
合酶"
K>CIRA6R0F7/
#
"+#$
#
M
"
$N
#!
ZZB
!
S&+$$
#
M
!总体积
#$
#
M
)
H?E
反应程序为$
&*a
预变性
*6.0
&
*a
变性
#6.0
!
$,+1a
退火
%"/
!
,!a
延
伸
#6.0
!共
%$
个循环)对于扩增产物不理想的引
物!将退火温度提高
#
到
!a
!提高扩增产物的特异
性)
H?E
产物利用
(b
聚丙烯酰胺凝胶电泳检测!
其具体方法!银染程序参考陆光远等-#&.)
@+J
!
标记连锁分析
记录在
!*
个单株的小群体中能扩增出多态性
的引物!用这些引物扩增*吴旗黄芥+和*武功褐芥+
杂交所获得的
#!#!
个群体!有带记为
#
(!无带记
为
"
()用
K7
[
K7A_RA%+"
软件对标记在
I
!
群体
中扩增所获得的数据进行分析!确定基因与标记间
的连锁关系!并利用
K7
[
ZA7V
软件绘制遗传连锁
图-!".)
!
!
结果与分析
A+@
!
*吴旗黄芥+黄籽基因的遗传验证
在本研究中!对来自"*吴旗黄芥+
#
J
*武功褐
芥+
$
#的
#!#!
个
I
!
单株!通过
I
%
和
I
*
代种皮色
表
@
!
引物序列设计
]7\8R#
!
R`/.
G
0RZ
[
A.6RA/
标记来源
K7A_RA/;=A:R
编号
?;ZR
序列
DR
9
=R0:R
"
$c
%
%c
#
7F%
G
!"#"" CH)# 22O??2O2O2OO]]]?]22O
%
]O22?2O2O2O2]]??22O?
7F%
G
!!"%" CH)! ]O]?O]OO]O2?]?]]2
%
O]?2]2??2]2]2?2]]??]?
7F%
G
!1#"" CH)% ?2?]]??]??2?]22O]]]?]
%
??]2]O]2O?]]O]O2]?2?2
7F%
G
!%"$" CH)* ?2O?]??]]]2?]2]OOO]2
%
]?]]]O]??]?O]2O?]]OO
7F%
G
!,"*" CH)$ ??]?]O?22?22]?]]O2O]
%
O]]?2?]]OOO]O2]]22O2
7F%
G
!*#1" CH)( O???2]]O?2]]????2]2]
%
O2]OOO222O]OO2]2O2O2?
@>AB#"$C#$ 4## O?]?2???]2]O]?]?2?]]
%
?]??]]?]]?OOOOO?]]??
@>AB#"$C#$ 4#! ?22????2]?2]2?2]OO2?
%
]2O2]O?]?]O???2]2O]O
@>AB#"$C#$ 4#% 2O222?O22O2?22?222?O
%
?O2]]]2]OO]OO]]2O]??
@>AB#"$C#$ 4#* ]??2O?22]O]22???
%
]?]2O]O?]2]]22?O]O??
@>AB#"$C#$ 4#$ O2?O2?]2]?]222?]]??O
%
O?22O2?]2OO]22]22???
%&#!
##
期
!!!!!!!!!!!!!!
刘
!
璐!等$芥菜型油菜黄籽基因分子标记的开发
表型鉴定出黄籽
!&(
株!纯合褐籽
%"*
株!杂合型褐
籽
(#!
株"表
!
#)卡方测验表明!该黄籽性状的遗
传符合
#d!d#
"
$
!
e"+!!
!
2
&
"+"$
#!属于
#
对主
效基因控制)
表
A
!
*吴旗黄芥+各代种子粒色统计结果
]7\8R!
!
DF7F./F.:78AR/=8F;U/RRZ:;8;A.0X7A.;=/
G
R0RA7F.;0/;U
Y
R8;V6=/F7AZ
年份
4R7A
子代
OR0RA7F.;0
种皮颜色
DRRZ:;8;A
数量
L=70F.F
Y
!"#!
I
#
黄色
4R8;V
!"#% I
!
褐色
>A;V0 #!#!
!"#*
I
%
褐色
>A;V0
黄色
4R8;V
&#(
!&(
!"#$ I
*
褐色
>A;V0
黄色
f
褐色
4R8;Vf\A;V0
黄色
4R8;V
%"*
(#!
!&(
A;A
!
黄籽基因连锁的
FG
以及
89标记
利用
(
对
CH
引物和
$
对
D?2E
引物扩增
!*
个
单株"
#!
黄籽对
#!
褐籽#的
I
!
小群体!结果显示来
自于
2F%
G
!*#1"
的
CH)(
!以 及 来 自
>2?
克 隆
@>AB#"$C#$
的
4#!
引物能够显示多态性!其中
CH)
(
表现为黄籽有带!褐籽无带"图
!
#!表明其为一个
与隐性的黄籽位点连锁的
CH
标记&
4#!
能够在黄籽
与纯合褐籽中扩增出两条多态性带!一条与黄籽位
点连锁!一条与褐籽位点连锁"图
%
#!表明其为一共
显性标记)
A+C
!
标记连锁分析
利用
CH)(
与
4#!
扫描整个
#!#!
个单株的
I
!
群体!
CH)(
在
I
!
群体中扩增出
$
个交换单株!其中
!&(
株黄籽中有
%
个交换单株!
%"*
株纯合型褐籽中
图
!
!
引物
CH)(
在
I
!
小群体"
#!
黄籽对
#!
褐籽#的扩增结果
#
"
#!+
纯合黄籽&
#%
"
!*+
纯合褐籽&
K#""[
67A_RA
I.
G
+!
!
26
[
8.U.:7F.;0;U67A_RACH)(.07/678
G
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![
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YG
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&
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图
%
!
引物
4#!
在小群体"
#!
黄籽对
#!
褐籽#的扩增结果
#
"
#!+
纯合黄籽&
#%
"
!*+
纯合褐籽&
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I.
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株杂合型褐籽中有
$
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为共显性标记!可将群体中
杂合褐籽区分出来"图
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#)结果表明这两个标记与
黄籽基因紧密连锁!分别位于基因的两侧!其遗传距
离分别为
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与
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讨
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论
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拟南芥及白菜基因组对芥菜型油菜黄籽基因
定位的作用
拟南芥是双子叶植物的模式植物!
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年已经
完成全基因组测序)芥菜型油菜
2
基因组和拟南
芥及白菜
2
基因组之间存在广泛的共线性-#!)#%.!因
此利用这些基因组的序列信息发展芥菜型油菜黄籽
基因连锁的分子标记具有可行性)在前期的研究
中!控制吴旗黄芥的黄籽基因的同源区域被定位到
了拟南芥第
%
染色体上!并且其中最近的一个分子
标记
52"!K?"1
位于一个已知序列的白菜
2
基因
组
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克隆上!因此本研究完全可以利用拟南芥与
白菜基因组的序列信息开发更近的分子标记)前人
也通过相似的方法开发了一些与目标基因连锁的分
子标记)俎峰等-!#.利用拟南芥与白菜基因组的信
息开发了
&
个与油菜雄性不育性状连锁的
CH
标记)
雷绍林等-!!.利用油菜基因组的部分序列信息开发
了
#
个与油菜雄性不育基因连锁的分子标记)本研
究在前期定位的基础上开发了
#
个
CH
标记与
#
个
D?2E
标记!使目标基因连锁的标记的遗传距离进
一步缩短!最近的标记
CH)(
与基因的距离仅为
"+#
:K
!这为黄籽基因的克隆奠定了良好的基础)
C+A
!
黄籽基因连锁的分子标记的应用
油菜黄籽育种目前受到了很多育种家的重视!
但是由于甘蓝型油菜黄籽资源十分稀缺!黄籽油菜
育种进程比较缓慢!急需将白菜型油菜与芥菜型油
菜中的黄籽基因导入到甘蓝型油菜中!培育甘蓝型
油菜黄籽品系)但是传统的回交转育的方法非常缓
慢!准确性很差!而油菜黄籽基因连锁的分子标记!
特别是共显性标记的出现!为黄籽回交转育工作提
供了极大的方便)本研究中所开发的
D?2E
标记
4#!
能够区分黄籽"
YY
#,杂合褐籽"
4
Y
#与纯合褐籽
"
44
#
%
种基因型!因此在回交转育的分离群体中很
容易筛选黄籽植株!大大提高黄籽选育的进度与准
确性)
另外本研究开发的分子标记
CH)(
与
4#!
位于
基因两侧!并且遗传距离很近!较之传统的
2IMH
,
E2H`
标记!其操作简单!仅需一次
H?E
!成本低!
条带少!易读带!因此!在黄籽性状的筛选中具有较
好的应用价值)目前本课题组正在利用这两个分子
标记在本实验室的油菜种质资源中筛选具有相同黄
籽位点的黄籽品系!为将来的油菜黄籽材料的遗传
改良提供材料)
参考文献!
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王汉中
+
油菜粒色的变异及其不稳定性的研究-
`
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+
武汉$华中农业大学!
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