全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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#
#(!#%%("%
收稿日期$
!"#$("%(!+
%修改稿收到日期$
!"#$(",(!*
基金项目$国家自然科学基金"
$#$"%*,
#%中央高校基本科研业务费专项资金资助"
-.!"#$("
#
作者简介$张平冬"
#,%&
#!男!副教授!主要从事林木细胞遗传学与多倍体育种方面的研究&
/(0123
$
4516
78
9
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胡杨小孢子发生及微管骨架变化与异常研究
张平冬!康向阳
"林木育种国家工程实验室!林木花卉遗传育种教育部重点实验室北京林业大学!北京
#"""+$
#
摘
!
要$利用压片法和间接免疫荧光结合
ABCD
"
)E
!
%(92102926F(!(
8
5?6
G
3269F3?
#染色法!对胡杨小孢子母细胞减数
分裂过程中微管骨架变化和染色体行为进行观察研究&结果表明$"
#
#胡杨小胞子母细胞减数分裂进程中染色体
行为正常!其中$偶线期可观察到单价体!中期
"
会出现落后染色体!末期
"
和末期
#
的核仁呈现动态变化&"
!
#胡
杨小孢子发生过程中细胞内微管骨架呈动态变化过程!其中$中期
#
形成平行纺锤体以及三极纺锤体%末期
#
未观
察到典型的成膜体结构!同时型胞质分裂受子核间辐射微管系统调节!通过胞质向心收缩而发生!胞质分裂后形成
四边形和四面体型四分体&"
$
#胡杨小孢子母细胞减数分裂过程中还存在各种异常细胞学现象!其中$中期
#
平行
纺锤体发生融合%中期
#
和后期
#
孢母细胞两个纺锤体间的胞质会出现裂沟%四分体时期存在三分体和二分体!并
产生天然
!6
花粉和连体花粉&
关键词$胡杨%小孢子%微管骨架%减数分裂%免疫荧光
中图分类号$
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I
)
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H!)*
文献标志码$
B
!"
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%
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!!
小孢子发生发育是植物有性生殖的重要过程!
也是生殖生物学研究领域的热点(#(!)&小孢子母细
胞经过减数分裂形成大量具有活力的花粉!并参与
植物有性生殖过程&有研究表明!植物减数分裂的
正常进行与细胞骨架的有序分布和变化密切相
关($)!微管骨架在植物小孢子减数分裂过程中参与
纺锤体())和成膜体(*)的形成!以及核周和胞质微管
网络的构建(%()!从而决定同源染色体以及姊妹染色
单体的分离(+)*细胞质的正常分裂(,(#")&植物小孢
子母细胞减数分裂过程中!中期
#
纺锤体微管主要
有平行和垂直两种类型!进而形成四边形和四面体
型四分体(##)&胞质分裂存在连续型和同时型&连
续型胞质分裂的植物在减数分裂
"
和减数分裂
#
后
都形成典型的成膜体结构(+!#!(#))&而在胞质分裂同
时型植物中!细胞质的分裂仅发生在减数分裂
#
后!
一般不形成成膜体结构(#!!#*)&
L2@F
等(#%)认为!胞
质分裂同时型植物减数分裂末期
#
以后!在子核胞
质区域会形成辐射状微管系统"
P1921302@PFO=:=3?
1PP1
G
U
!
^WBU
#!调节胞质向心收缩而发生分裂&
胡杨是中国西部干旱荒漠地区的高大乔木树
种!具有耐盐碱水湿*抗干旱*抵御风沙*涵养水源等
优良特性!具有较高的育种利用价值&由于其扦插
繁殖生根困难!限制了胡杨遗传改良研究的进
程(#)!基本处于野生状态&
!"
世纪
+"
年代!李文钿
等(#+)利用醋酸洋红压片法对胡杨的减数分裂过程
进行了研究&由于植物减数分裂过程中的染色体行
为与微管骨架变化密切相关!因此!本试验利用免疫
荧光法和醋酸洋红压片法就胡杨小孢子母细胞减数
分裂过程中的染色体行为与微管骨架活动及其异常
情况进行了研究&该研究有助于理解杨属派间减数
分裂行为差异和特异现象!从而推动胡杨生殖生物
学相关研究!为遗传改良策略的制定提供理论指导&
#
!
材料和方法
:>:
!
植物材料
胡杨雄花枝采自内蒙古额济纳旗东河乌兰图格
地区天然胡杨林!塑料布包裹后运回北京林业大学&
:>;
!
试验方法
胡杨雄花枝移入温室水培后!每隔
$
$
)5
采集
雄花芽!去除鳞片后用卡诺固定液进行固定!用醋酸
洋红压片法!实时观察小孢子母细胞减数分裂进程&
微管蛋白免疫荧光标记!根据
SPF[6
等(%)的方法进
行!摘取胡杨减数分裂各时期的花药!用
C/W
"
*"
00F3

QCDC/]
!
*00F3

Q/MRB
!
#00F3

QW
7
]V
)
!
8
K%>+
#缓冲液配制的
)_
多聚甲醛固定
)*026
后在
含有
#"_AW]V
"
920?O5
G
3U=3#的
C/W
缓冲液
中处理
$"026
!并用
#_ RP2OF6(#""
"
C/W
配制#抽提
#*026
!
CS]
"
#$00F3

QL1Z3
!
!>00F3

QNZ3
!
+
00F3

QL1
!
KCV
)
!
#>*00F3

QNK
!
CV
)
!
8
K>)
#缓
冲液冲洗
$
次!每次
*026
&花药处理完成后!用小镊
子夹碎花药并转移到经
">#_
多聚赖氨酸"
]2
7
01
C#!)
#处理的载玻片上!滴加一抗"
]2
7
01R,"!%
!
CS]
稀释
!""
倍#于湿盒中!
$a
下温育
#5
&取出载玻
片!用
CS]
冲洗
$
次!每次
*026
后滴加
TDRZ
标记
的二抗"
]2
7
01T"!#,
!
CS]
稀释
*"
倍#于湿盒中!
$
a
下温育
#5
&二抗反应结束后!用
CS]
冲洗
$
次!
每次
*026
!随即用
ABCD
"
)
!
%(92102926F(!(
8
5?6
G
(
3269F3?
#对细胞核进行染色!
CS]
充分冲洗后!用抗
荧光淬灭封片液"
D6Y2OPF
7
?6C$%,$)
#封片!用激光
共聚焦扫描显微镜观察照相&
!
!
结果与分析
;>:
!
胡杨减数分裂染色体行为特征
在胡杨小孢子母细胞减数分裂过程中!其染色
体行为正常&当减数分裂进入细线期!染色体呈细
丝状!凝聚成团!偏在核仁一旁"图版
"
!
1
#%偶线期!
同源染色体开始配对!缩短变粗!散乱分布于细胞核
中"图版
"
!
:
#%粗线期!同源染色体完全配对形成
联会复合体!并相互缠绕!染色体明显变粗!清晰可
见"图版
"
!
@
#%进入双线期后!联会的同源染色体局
部分开!进一步缩短变粗"图版
"
!
9
#!单价体清晰可
见"图版
"
!
?
#%至终变期!染色体缩短成颗粒状!形
态清晰!易于记数!核仁变小并逐渐消失"图版
"
!
<
#&随后!联会成对的同源染色体开始相互排斥!中
期
"
整齐地排列在赤道板上"图版
"
!
7
#!偶尔可见
落后染色体"图版
"
!
5
#%后期
"
!同源染色体在纺
锤体的牵引下分开!分别移向细胞两极"图版
"
!
2
#%
当相互分离的同源染色体达到两极后!减数分裂进
入末期
"
"图版
"
!
;
#!染色体开始解螺旋!核仁重新
出现!每子核最多可见
+
个小核仁"图版
"
!
#!小核
仁融合成较大的核仁!此时染色体难以染色观察到!
标志着胡杨小孢子母细胞减数分裂
"
结束&
当多个小核仁融合成一个大核仁后!染色体再
一次螺旋缩短变粗!减数分裂进入前期
#
"图版
"
!
3
#%至中期
#
!染色体成一定角度定向于赤道板!核
仁消失!形成纺锤体"图版
"
!
0
#%在纺锤体的牵引
下!后期
#
的姊妹染色单体分离!开始移向子细胞的
两极"图版
"
!
6
#%姊妹染色单体达到两极后!减数
分裂进入末期
#
!此时姊妹染色体单体开始解螺旋!
核仁重新出现"图版
"
!
F
#!与末期
"
相类似!也可以
观察到多核仁现象"图版
"
!
8
#!每子核内最多能观
察到
)
个核仁&小孢子母细胞经减数分裂后!一般
%#!
##
期
!!!!!!!!!!!!
张平冬!等$胡杨小孢子发生及微管骨架变化与异常研究
形成
)
个子细胞!即四分体"图版
"
!
b
#&但由于减
数分裂
#
后的胞质分裂异常!偶尔也可观察到三分
体和二分体的存在"图版
"
!
P
#&
;>;
!
胡杨减数分裂和胞质分裂过程中微管骨架特
征与异常
利用间接免疫荧光和
ABCD
染色法!对胡杨小孢
子母细胞减数分裂和胞质分裂过程中的微管骨架动
态变化和异常行为研究结果表明!减数分裂前期
"
!
微管呈网状!环绕于细胞核周围!从核膜向周质辐射
"图版
#
!
#1
#!细胞核位于孢母细胞的中央"图版
#
!
#:
#&终变期!核膜四周的微管开始向染色体区域
移动"图版
#
!
1
#!染色体散布于核区"图版
#
!
:
#&
至中期
"
时!细胞核内的微管聚集形成着丝粒微管
和极丝微管(#,)!共同组成纺锤体微管"图版
#
!
$1
#!
着丝粒微管在赤道区与染色体相连"图版
#
!
$:
#&
后期
"
!随着着丝粒微管的延伸!将同源染色体推向
对面(!")"图版
#
!
)1
#!同源染色体离开赤道板移向
细胞两极"图版
#
!
):
#&同源染色体达到两极后!
进入减数分裂末期
"
!极性的纺锤体微管解聚!核周
辐射状微管重新出现"图版
#
!
*1
#!围绕
!
个子核!
布满于整个细胞质!核仁出现"图版
#
!
*:
#&
小孢子减数分裂
"
完成后并不发生胞质分裂!
直接进入减数分裂前期
#
&此时!微管呈点状分布
于核内并与染色体结合"图版
#
!
%1
#!两子核中的染
色体重新可见"图版
#
!
%:
#&中期
#
!两个子核内
微管聚集!形成粗短的着丝粒微管与染色体相连!细
长的极丝微管不与染色体结合"图版
#
!
1
#!共同支
撑
!
个子核的染色定位于各自的赤道板上"图版
#
!
:
#&后期
#
!在着丝粒微管的推动下"图版
#
!
+1
#!
!
个子核内的姊妹染色单体分别移向两极"图版
#
!
+:
#&姊妹染色单体达到两极后!进入末期
#
&此
时!纺锤体微管再一次解聚"图版
#
!
,1
#!彼此分开
的姊妹染色单体与非姊妹染色单体形成
)
个新的子
核"图版
#
!
,:
#!从
)
个子核核周发出的辐射状微管
正在建立微管骨架系统&研究还发现!胡杨小孢子
母细胞减数第二次分裂过程中存在各种异常现象!
其中中期
#
出现三极纺锤体微管"图版
#
!
#"1
*
#":
#!牵引两组姊妹染色单体向三个方向分离%中
期
#
平行纺锤体微管发生融合!形成巨大的类似中
期
"
的纺锤体微管"图版
#
!
##1
*
##:
#%减数分裂
#
还存在不同步性!一组微管和染色体已呈现后期
#
的特征!另一组则停留在中期
#
"图版
#
!
#!1
*
#!:
#&
末期
#
完成以后!紧接着进行胞质分裂&胡杨
小胞子母细胞的胞质分裂属于同时型&在胞质分裂
过程中!微管骨架需要进一步发育!不形成成膜体结
构"图版
#
!
#$1
#&
)
个单倍体子核四周放射出辐射
状微管!调控着胞质向心收缩而发生分裂!进而形成
四分体"图版
#
!
#$:
#&由于胡杨小孢子母细胞减
数分裂中期
#
具有平行*三极以及融合三种类型的
纺锤体!因此胞质发生同时型分裂后!相应地形成两
侧对称的四边形四分体"图版
#
!
#$1
*
#$:
#*三分体
"图版
#
!
#)1
*
#):
#以及二分体"图版
#
!
#*1
*
#*:
#&
偶尔还可以看到四面体型四分体"图版
#
!
#%1
*
#%:
#&甚至还可以看到一个方向胞质已明显分裂!
另一方向胞质分裂失败!仅存一个很窄的微管带"图
版
#
!
#1
*
#:
#&
$
!
结论与讨论
<>:
!
小孢子形成过程中的微管骨架变化
植物微管骨架对小孢子母细胞减数分裂纺锤体
和胞质分裂成膜体的形成*同源染色体分离以及核
周与胞质内微管网络的构建有重要作用(*(+!#")&减
数分裂过程中!随着同源染色体和姊妹染色单体的
分离*细胞质的分裂!细胞内的微管骨架系统亦会发
生相应变化(%!+!#")&在高等植物中!小孢子母细胞胞
质分裂可分为连续型和同时型两类&一般来说!连
续型胞质分裂类型往往会在即将分裂的子核之间形
成成膜体结构!胞质分裂始于成膜体微管中央区域!
离心扩展而发生&同时型胞质分裂类型则不形成成
膜体结构!但在
)
个子核的胞质区域会形成辐射状
微管系统&在这种辐射状微管的调控下!通过胞质
向心收缩而发生(#%)&胡杨中期
#
的纺锤体微管系
统相互平行或成一定角度!末期
#
后发生同时型的
胞质分裂形成四边形或四面体型的四分体&在小孢
子母细胞减数分裂进入后期
#
以后!非姊妹染色单
体组间逐渐形成次级微管!与姊妹染色体组之间的
微管一起构成细胞
)
个子核之间相互联系的辐射状
微管系统!但末期
#
后不形成成膜体结构!其胞质分
裂通过胞质向心收缩而发生&
<=;
!
微管骨架变化异常与
;%
花粉以及连体花粉的
形成
天然
!6
花粉的发生是植物有性多倍体化的重
要途径!是物种进化的一种重要方式&在杨柳科植
物中!已经在毛白杨*小青杨*小叶杨*通辽杨以及响
叶杨等树种发现有天然
!6
花粉的产生(!#(!$)&有关
研究表明!天然
!6
花粉的产生与小孢子母细胞减数
分裂以及胞质分裂异常紧密相关(!$)&这些异常的
减数分裂和胞质分裂现象均受细胞内微管网络系统
+%#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
$$
卷
的影响(#%)&因此!研究小孢子母细胞减数分裂以及
胞质分裂过程中微管骨架的异常变化!可为阐明天
然
!6
花粉发生机制提供细胞学证据&张正海等(!$)
利用免疫荧光技术研究了毛白杨小孢子发生过程中
的微管动态变化!发现毛白杨减数分裂平行纺锤体
可导致
#
个或
!
个非姐妹染色体组的聚集!从而核
周辐射微管系统发生合并&这些合并的核周辐射微
管系统建立了
$
个或
!
个核质区域来控制胞质分裂
面的位置!进一步形成三分体或二分体!促使天然
!6
花粉的产生&王君(!#)对青杨派树种的减数分裂
免疫荧光分析结果表明!通辽杨小孢子母细胞减数
分裂末期
#
细胞成膜体缺失导致胞质分裂失败!细
胞内子核未能正常分离而共存于同一小孢子内!形
成三分体和二分体!进一步发育形成
!6
花粉&在
响叶杨小孢子母细胞减数分裂过程中!后期
#
可以
观察到纺锤体微管缺失导致姊妹染色单体不分离现
象!以及减数分裂末期
#
成膜体微管缺失导致胞质
分裂异常现象!是响叶杨
!6
花粉发生的细胞学机
制(!!)&在本研究中!胡杨减数分裂过程中可以看到
平行纺锤体*三极纺锤体以及融合纺锤体等!这些纺
锤体的异常现象与植物天然
!6
花粉的发生紧密相
关!已得到植物育种学家的公认(!$)&另外!胡杨小
孢子母细胞减数分裂后期
#
也可观察到纺锤体微管
缺失导致姊妹染色单体不分离现象"图版
#
!
#!1
#!
也可能与天然
!6
花粉"图版
#
!
#+1
#的产生有关&
连体花粉是植物小孢子发生过程中细胞质分裂
失败的另一种产物&它与
!6
花粉不同! 个花粉粒
共同拥有同一花粉壁!花粉粒内的遗传物质被花粉
壁隔开&连体花粉在植物界中广泛存在!已在松香
草*毛白杨*通辽杨*白杨异源三倍体等树种中发现
有一定比例的连体花粉存在(!#!)(!*)&但有关连体花
粉的发生机制至今还未见报道&植物减数分裂完成
后!小孢子分离常常伴随环绕小孢子的胼胝质壁降
解和初生花粉壁的形成!这预示着连体花粉的形成
可能与小孢子胼胝质降解的失败有关(!%(!)&在本研
究中!胡杨减数分裂结束后!在四分体的两个相互垂
直的分裂面上!其中一个分裂面胞质分裂正常!而另
一个分裂面细胞质分裂滞后!仅见一个狭窄的胞质
带!可能发育成两个小孢子的共同细胞壁!从而产生
连体花粉"图版
#
!
#+:
#&
参考文献!
(
#
)
!
WZZV^ WDZN]>W13?
7
10?OF
8
5
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8
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