全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(1): 10-17(2011)
收稿日期: 2010-03-08; 修回日期: 2010-10-30
基金项目: 上海出入境检验检疫局科研项目(HK069-2010); 上海市科委项目(09DZ0580201)
通讯作者: 易建平,研究员,主要研究方向为腥黑粉菌和细菌类检疫性有害生物的检测; Tel: 021-38620575, Fax: 021-68546481,
E-mail: yijp@shciq. gov. cn
第一作者: 周国梁(1965 - ),男,江苏人,高级农艺师,主要从事植物检疫管理工作; E-mail: zhougl@shciq. gov. cn。
油菜茎基溃疡病菌的实时荧光 PCR检测
周国梁1, 尚琳琳2, 林 泓1, 印丽萍1, 徐殿胜2, 易建平1*
( 1上海出入境检验检疫局, 上海 200135; 2华东理工大学生物工程学院, 上海 200237)
摘要: 根据油菜茎基溃疡病菌 Leptosphaeria maculans与其近似种 ITS序列的差异,设计了检测 L. maculans的引物 Lmb3 /
R2和探针 Probe-M,建立了 L. maculans的实时荧光 PCR检测方法。 试验结果表明,来自加拿大、澳大利亚和乌克兰等国
的 22 株 L. maculans菌株都能得到阳性扩增,而供试的 30 株 L. biglobosa菌株和 6 株其他菌株以及空白对照没有荧光信
号的增加。 该检测方法的灵敏度达到 4 pg菌丝 DNA,整个检测过程控制在 4 h内,其快速、特异和灵敏的特点可以满足进
境油菜籽样品的快速初检以及病菌分离物的快速鉴定。
关键词: 油菜茎基溃疡病菌; 实时荧光 PCR
Detection of Leptosphaeria maculans by real-time PCR 　 ZHOU Guo-liang1, SHANG
Lin-lin2, LIN Hong1, YIN Li-ping1, XU Dian-sheng2, YI Jian-ping1 　 ( 1Shanghai Entry-Exit Inspection and
Quarantine Bureau, Shanghai 200135, China; 2East China University of Science and Technology, Shanghai 200237, China)
Abstract: Real-time PCR was used for detection of Leptosphaeria maculans, the causative agent of oilseed
phoma stem canker. Specific primers Lmb3 / R2 and a TaqMan-MGB probe (Probe-M) specific to L. macu-
lans were designed from the differentiation of ITS sequences between L. maculans and related species in the
GenBank database. The results showed that all 22 isolates of L. maculans from oilseed samples from Austra-
lia, Ukraine and Canada could get positive amplification with the limit of 4 pg DNA, and negative results for
30 isolates of L. biglobosa and the other 6 isolates of related species from oilseed samples. Real-time PCR
could be especially useful for mass screening of oilseed sample and diagnosis of suspected isolate.
Key words: Leptosphaeria maculans; real-time PCR
中图分类号: S41-31;S435. 654　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2011)01-0010-08
　 　 油菜黑胫病(Phoma stem canker)又称“油菜
黑腿病”,是世界范围内油菜最严重的真菌病害之
一,其病原菌为小球腔菌属,主要包括 2 个种:油菜
黑胫病菌 Leptosphaeria biglobosa和油菜茎基溃疡
病菌 L. maculans,这 2 种病原菌的形态特征相近,
但引起油菜茎部感染和基部溃疡的能力不同[1 ~ 3]。
前者致病力较弱,一般引起茎中上部为害[4],造成
的损失小,包括中国在内的一些油菜生产国均有分
布[5]。 后者致病力强,引起茎基部发病,是导致油
菜黒胫病严重流行和油菜产量损失的主要因
素[6,7],在澳大利亚、加拿大、美国、欧洲等油菜主
产国有分布,而在我国未见报道。 我国油菜产区气
候与欧、美、澳三大洲相似,且中国目前的油菜主要
栽培品种高度感病[6]。 另外,随着贸易全球化,病
菌传入的风险加剧。 2009 年 8 月以来,上海口岸
已经从澳大利亚、乌克兰和加拿大等国进境油菜籽
样品中多次截获油菜茎基溃疡病菌 L. maculans。
油菜茎基溃疡病菌正严重威胁着我国油菜产业的
　
　 1 期 周国梁,等:油菜茎基溃疡病菌的实时荧光 PCR检测
生产安全,高效快速检测技术成为预防油菜茎基溃
疡病传入我国的关键措施之一。
目前,油菜茎基溃疡病菌的检测技术包括滤纸
培养法和 PCR方法,PCR检测方法以其快速、准确
和灵敏的特点受到广泛应用[8 ~ 10]。 SYBR Green
实时荧光 PCR技术已经用于油菜茎基溃疡病菌的
定量检测[11,12]。 本研究根据 ITS 区序列设计特异
引物和 TaqMan-MGB 探针将实时荧光 PCR 技术
应用于 L. maculans的检测,现将结果报道如下。
1　 材料与方法
1. 1　 供试菌株
试验用 L. maculans和 L. biglobosa部分菌株
由本实验室从加拿大、澳大利亚和乌克兰等国进境
油菜籽样品中分离,另一部分菌株由深圳、江苏和
宁波出入境检验检疫局技术中心提供,国内
L. biglobosa 菌株由安徽省农业科学研究院李强
生副研究员提供,菌株编号和来源见表 1。
1. 2　 供试引物及探针
供试引物 Lmb3 (5′-caccaattggatccccta-3′) / R2
(5′-ggcgcaaaatgtgctgcgct-3′)和探针 Probe-M (5′-
FAM-cacttgggactcgc-MGB-3′)均来源于 GenBank
中 L. maculans的核糖体 ITS序列。 引物和探针由
上海基康公司合成。
1. 3　 菌丝收集及 DNA提取
供试菌株用 PDA 培养基繁殖后收集菌丝,液
氮研磨后取 0. 1 g菌丝粉,用植物基因组提取试剂
盒( TIANGEN BIOTECH 公司, DP305-02 ) 提取
DNA。
Table 1　 Isolates used in the test
Isolate Code Origin Year
Leptosphaeria maculans 8129-5 Australia 2009
8129-17 Australia 2009
8129-25 Australia 2009
6382-1 Australia 2009
6382-2 Australia 2009
6382-3 Australia 2009
8080-1 Ukraine 2009
333-13 Ukraine 2009
333-15 Ukraine 2009
420-3 Ukraine 2009
434-1 Ukraine 2009
895-1 Canada 2009
3-4 Canada 2009
3-9 Canada 2009
3-20 Canada 2009
15-2 Canada 2009
15-3 Canada 2009
15-5 Canada 2009
17-2 Canada 2009
17-3 Canada 2009
J-4a Canada 2009
J-11a Canada 2009
11
　
植物病理学报 41 卷
Table 1　 Isolates used in the test (continued)
Isolate Code Origin Year
L. biglobosa 6382-53 Australia 2009
6382-54 Australia 2009
7873-1 Ukraine 2009
7873-2 Ukraine 2009
6555-1 Ukraine 2009
6555-2 Ukraine 2009
1602-1 Ukraine 2009
1602-2 Ukraine 2009
333-10 Ukraine 2009
333-14 Ukraine 2009
337-2 Ukraine 2009
337-3 Ukraine 2009
420-1 Ukraine 2009
17-1 Canada 2009
17-4 Canada 2009
17-11 Canada 2009
15-4 Canada 2009
15-16 Canada 2009
3-2 Canada 2009
3-12 Canada 2009
895-3 Canada 2009
895-4 Canada 2009
9268-39b Canada 2009
9268-46b Canada 2009
726-2c Japan 2009
Gs5-5d Guizhou,China 2008
Gj2-2d Guizhou,China 2008
Ah9-4d Anhui,China 2008
Ah12-2d Anhui,China 2008
Ah19-3d Anhui,China 2008
Alternaria sp. 8129-84 Australia 2009
3-3 Canada 2009
A. alternaria 333-3 Ukraine 2009
A. brassicae 333-11 Ukraine 2009
333-18 Ukraine 2009
Phoma sp. 8129-92 Australia 2009
a: Wu Cuiping, Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau; b: Cheng Yinghui, Shenzhen Entry-Exit Inspec-
tion and Quarantine Bureau; c: Zhang Jiancheng, Ningbo Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau; d: Li Qiang-
sheng, Academy of Agri-Science Anhui Province.
21
　
　 1 期 周国梁,等:油菜茎基溃疡病菌的实时荧光 PCR检测
1. 4　 样品和分离物 DNA提取
进境加拿大油菜籽样品(样品编号 3)混匀后
取 1 kg用作试验样品,用孔径 2. 5 mm和 1. 5 mm
的网筛过筛,取筛上物和筛下物各 1 ~ 2 g,液氮研
磨后各取样 0. 1 ~ 0. 2 g,分别按 1. 3 方法提取
DNA。 油菜籽样品中 L. biglobosa 分离物 3-6 和
L. maculans分离物 3-21 的菌丝液氮研磨后各取
样 0. 1 ~ 0. 2 g,按 1. 3 方法提取 DNA。
1. 5　 实时荧光 PCR检测
PCR试剂均购自宝生物工程(大连)有限公司
(TaKaRa)。 反应体系为 25 μL,包括 12. 5 μL 2 ×
Premix Ex Taq、上下游引物(5 μmol / L)和探针(5
μmol / L)各 1 μL、1 μL 模板 DNA、0. 5 μL 50 ×
ROX Reference DyeⅡ,加无菌水补至 25 μL。
实时荧光 PCR 检测使用仪器为 Applied Bio-
systems的 7500 Fast Real-time PCR System,反应程
序为:95℃ 预变性 10 s,然后以 95℃ 15 s,60℃
1 min 进行 40 个循环。
2　 结果
2. 1　 特异性检测
对供试的 22 个 L. maculans菌株的菌丝 DNA
进行实时荧光 PCR 检测,探针 Probe-M 对供试的
22 个 L. maculans菌株都有荧光信号的增加,表现
为阳性扩增(图 1),而供试的 30 个 L. biglobosa菌
株、5 株 Alternaria spp. 菌株、1 株 Phoma sp. 菌株
和空白对照都没有检测到荧光信号的增加,表现为
阴性(图 2)。 试验结果表明,引物 Lmb3 / R2 和探
针 Probe-M可以特异性检测 L. maculans。
Fig. 1　 Amplification of Leptosphaeria maculans DNA by real-time PCR
1-22: 8129-5, 8129-17, 8129-25, 6382-1, 6382-2, 6382-3, 8080-1, 333-13, 333-15,
420-3, 434-1, 895-1, 3-4, 3-9, 3-20, 15-2, 15-3, 15-5, 17-2, 17-3, J-4,
J-11, respectively; 23: 6382-53; 24: No DNA template.
31
　
植物病理学报 41 卷
Fig. 2　 Amplification of Leptosphaeria biglobosa and related species DNA by real-time PCR
1-36: 6382-53, 6382-54, 7873-1, 7873-2, 6555-1, 6555-2, 1602-1, 1602-2, 333-10,
333-14, 337-2, 337-3, 420-1, 17-1, 17-4, 17-11, 15-4, 15-16, 3-2, 3-12, 895-3,
895-4, 9268-39, 9268-46, 726-2, Gs5-5, Gj2-2, Ah9-4, Ah12-2, Ah19-3,
8129-84, 3-3, 333-3, 333-11, 333-18, 8129-92, respectively;
37: 8129-5; 38: No DNA template.
2. 2　 灵敏度检测
L. maculans 菌株 8129-5 的菌丝 DNA 测定
DNA浓度后系列稀释为不同浓度,分别取 4 ng、
400 pg、40 pg、4 pg、400 fg和 40 fg的菌丝 DNA用
于实时荧光 PCR 检测,PCR 扩增后 4 ng、400 pg、
40 pg和 4 pg的菌丝 DNA都检测到荧光信号的增
加,表现为阳性扩增,400 fg 和 40 fg 的菌丝 DNA
无扩增(图 3),试验结果表明引物 Lmb3 / R2 和探
针 Probe-M的检测灵敏度为 4 pg的菌丝 DNA。
2. 3　 样品和分离物 DNA的检测
进境油菜样品 3 的筛上物和筛下物 DNA 以
及样品中 L. biglobosa 分离物 3-6 和 L. maculans
分离物 3-21 的 DNA 分别进行实时荧光 PCR 检
测,筛上物 DNA、筛下物 DNA、分离物 3-21 的
DNA和阳性对照都出现荧光信号的增加,分离物
3-6 的 DNA、阴性对照和空白对照表现为阴性扩增
(图 4),试验结果表明,引物 Lmb3 / R2 和探针
Probe-M可以特异性检测油菜样品中的 L. macu-
lans,也可用于病菌分离物的鉴定。
41
　
　 1 期 周国梁,等:油菜茎基溃疡病菌的实时荧光 PCR检测
Fig. 3　 Detection sensitivity of real-time PCR for DNA of Leptosphaeria maculans
1-6: 4 ng, 400 pg, 40 pg, 4 pg, 400 fg, 40 fg DNA of 8129-5, respectively.
Fig. 4　 Amplification of oilseed samples and isolate by real-time PCR
1: Screen overflow (d =2. 5 cm) DNA of sample 3; 2: Screen underflow (d =1. 5 cm) DNA of sample 3;
3: DNA of isolate 3-21; 4: DNA of isolate 3-6; 5: 8129-5; 6: 6382-53; 7: No DNA template.
51
　
植物病理学报 41 卷
3　 讨论
目前认为油菜茎基溃疡病菌 L. maculans 种
下包括 2 个亚种或组,即 L. maculans subsp. bras-
sicae和 L. maculans subsp. lepidii,前者寄主为栽
培芸薹属 Brassica spp. ,后者寄主为独行菜属 Lepi-
dium spp. 。 试验所用 L. maculans 菌株均从加拿
大、乌克兰和澳大利亚等国进境油菜籽样品中分
离,经形态特征和序列分析,其 ITS序列和 L. macu-
lans subsp. brassicae 的序列相似性大于或等于
99. 8% 。 因此,供试 L. maculans 菌株均为 L.
maculans subsp. brassicae。 试验所用引物和探针
是针对 L. maculans subsp. brassicae 的序列设计,
理论上仅对 L. maculans subsp. brassicae 菌株表
现为阳性扩增,试验中缺少 L. maculans subsp. le-
pidii菌株进行验证。 试验所用 L. biglobosa 菌株
包含 L. biglobosa subsp. brassicae、 L. biglobosa
subsp. canadensis 和 L. biglobosa subsp. aus-
traliensis等 3 个亚种。 试验中没有收集到 L. big-
lobosa subsp. thlaspii、L. biglobosa subsp. erysimii
和 L. biglobosa subsp. occiaustralensis等 3 个亚种
菌株进行验证。
本试验实时荧光 PCR 的检测灵敏度达到了
4 pg 菌丝 DNA,比常规 PCR的检测灵敏度提高了
10 ~ 100 倍。 在检测灵敏度提高的同时,检测时间
缩短至 1. 5 h。 从样品前处理、DNA提取到实时荧
光 PCR扩增,整个检测时间控制在 4 h以内。
油菜籽中油菜茎基溃疡病菌的感染率很少高
于 1% ~ 2% ,籽粒的带菌量处于比较低的水平,而
用于 DNA提取的油菜籽样品仅为 0. 1 ~ 0. 2 g,约
为 30 ~ 60 粒,PCR直接检测油菜籽种子样品的阳
性率很低,试验中常规 PCR检测 30 余个加拿大进
境油菜籽样品,阳性率仅为 10%左右。 试验中通
过对油菜籽样品进行过筛处理,检测样品筛上物和
筛下物,阳性率超过 60% ,因此通过样品前处理大
大提高了阳性检出率,达到了快速检测以满足口岸
快验放行的要求。 同时,实时荧光 PCR 检测还可
以进行定量分析,在油菜茎基溃疡病菌监测和防控
中具有十分广泛的应用前景。
致谢:江苏出入境检验检疫局吴翠萍高级农艺师、
深圳出入境检验检疫局程颖慧高级农艺师和
宁波出入境检验检疫局张建成高级农艺师提
供菌株材料;安徽省农业科学院作物研究所
李强生副研究员提供菌株材料和技术帮助;
内蒙古农业大学李子钦研究员和中国农业科
学院油料作物研究所刘胜毅研究员提供技术
支持。
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