全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(６): ６３４￣６４０(２０１４)
收稿日期: ２０１４￣０１￣１２ꎻ 修回日期: ２０１４￣０８￣１４
基金项目: 国家甘薯产业技术体系建设项目(ＣＡＲＳ￣１１￣Ｂ￣０７)ꎻ河南省农业科学院财政预算项目资助
通讯作者: 张振臣ꎬ研究员ꎬ主要从事植物病毒学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｚｈａｎｇｚｈｅｎｃｈｅｎ＠１２６.ｃｏｍ
第一作者: 乔 奇ꎬ男ꎬ河南宁陵人ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事植物病理学与生物技术研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｑｉａｏｑ２００５＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０６.０１０
甘薯褪绿斑病毒外壳蛋白的
分子变异及其特异抗血清制备
乔 奇ꎬ 秦艳红ꎬ 张德胜ꎬ 田雨婷ꎬ 王 爽ꎬ 王永江ꎬ 张振臣∗
(河南省农业科学院植物保护研究所ꎬ郑州 ４５０００２ꎻ 河南省农作物病虫害防治重点实验室ꎬ郑州 ４５０００２ꎻ
农业部华北南部作物有害生物综合治理重点实验室ꎬ 郑州 ４５０００２)
摘要:甘薯褪绿斑病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓꎬＳＰＣＦＶ)是侵染甘薯的主要病毒之一ꎮ 本研究利用 ＲＴ￣ＰＣＲ方法克
隆了 ＳＰＣＦＶ中国 ４个分离物的外壳蛋白(ＣＰ)基因ꎮ 序列分析表明ꎬｃｐ基因全长 ９００ ｂｐꎬ编码 ２９９ 个氨基酸残基ꎮ ４ 个分
离物 ｃｐ基因的核苷酸序列一致性为 ７８.３％~８９.９％ꎬ推导的氨基酸序列一致性为 ９１.３％~９５.７％ꎬ存在较大的分子变异ꎮ 不
同分离物 ＣＰ氨基酸序列 Ｎ末端的第 ３－３２位氨基酸为多变区ꎮ 将四川分离物的 ｃｐ基因克隆到原核表达载体 ｐＥＴ￣２８ａ(＋)
上ꎬＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析表明ꎬ经 ＩＰＴＧ诱导ꎬｃｐ基因在大肠杆菌 ＢＬ２１(ＤＥ３)中得到了高效表达ꎮ 以表达的蛋白为抗原免疫家
兔ꎬ制备了 ＳＰＣＦＶ ＣＰ的特异性抗血清ꎮ ＡＣＰ￣ＥＬＩＳＡ检测结果表明ꎬ制备的抗血清效价达 １ ∶ １２８ ０００ꎬ可用于田间甘薯样
品的检测ꎮ
关键词:甘薯褪绿斑病毒ꎻ 外壳蛋白ꎻ 分子变异ꎻ 原核表达ꎻ 抗血清制备
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ ａｎｄ
ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ａｇａｉｎｓｔ ＣＰ ＱＩＡＯ Ｑｉꎬ ＱＩＮ Ｙａｎ￣ｈｏｎｇꎬ ＺＨＡＮＧ Ｄｅ￣ｓｈｅｎｇꎬ
ＴＩＡＮ Ｙｕ￣ｔｉｎｇꎬ ＷＡＮＧ Ｓｈｕａｎｇꎬ ＷＡＮＧ Ｙｏｎｇ￣ｊｉａｎｇꎬ ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎ￣ｃｈｅｎ ( Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ Ｈｅｎａｎ
Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ Ｈｅｎａｎ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｃｒｏｐ Ｐｅｓｔ Ｃｏｎｔｒｏｌꎬ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２ꎬ
Ｃｈｉｎａꎻ ＩＰＭ Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｉｎ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｐａｒｔ ｏｆ Ｎｏｒｔｈ Ｃｈｉｎａ ｆｏｒ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｚｈｅｎｇｚｈｏｕ ４５０００２ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ (ＳＰＣＦＶ) ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｍａｊｏｒ ｖｉｒｕｓｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ. Ｔｈｅ ｃｏａｔ
ｐｒｏｔｅｉｎ (ＣＰ) ｇｅｎｅ ｏｆ ＳＰＣＦＶ ｆｒｏｍ ｆｏｕｒ Ｃｈｉｎｅｓｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｃｌｏｎｅｄ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ｔｈｅ ｆｕｌｌ￣ｌｅｎｇｔｈ ｃｐ ｇｅｎｅ ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ ９００ ｎｔ ａｎｄ ｅｎｃｏｄｅｄ ２９９ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｒｅｓｉｄｕｅｓ. Ｔｈｅ ｃｐ ｏｆ ｔｈｅ ｆｏｕｒ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｓｈａｒｅｄ
７８.３％~８９.９％ ａｎｄ ９１.３％~９５.７％ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ａｔ ｔｈｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｌｅｖｅｌ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｔｈｉｒｄ ｔｏ ３２ｎｄ
ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ＣＰ ｆｒｏｍ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗｅｒｅ ｍｏｒｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｃｏｍｐａｒｅｄ ｗｉｔｈ ｏｔｈｅｒ ｒｅｇｉｏｎｓ. Ｔｈｅ ｃｐ ｏｆ Ｓｉｃｈｕａｎ
ｉｓｏｌａｔｅ ｗａｓ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＥＴ￣２８ａ (＋) ｆｏｒ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｃｅｌｌｓ. Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔ ｏｆ
ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ａ ３６. ５ ｋＤａ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｒｏｄｕｃｅｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧ. Ｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ａｎｄ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ａｇａｉｎｓｔ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｒａｉｓｅｄ ｉｎ ｒａｂｂｉｔ. Ｔｈｅ
ＥＬＩＳＡ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｗａｓ １ ∶ １２８ ０００ ｉｎ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｌｅａｖｅｓ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ. Ｔｈｅ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｗａｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｐｅｃｉｆｉｃ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＰＣＦＶ ｆｒｏｍ ｆｉｅｌｄ ｓａｍｐｌｅｓ ｏｆ ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｂｙ ＡＣＰ￣ＥＬＩＳＡ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓꎻ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙꎻ ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎꎻ
ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３２.４１ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０６￣０６３４￣０７
６期 乔 奇ꎬ等:甘薯褪绿斑病毒外壳蛋白的分子变异及其特异抗血清制备
甘薯褪绿斑病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｆｌｅｃｋ
ｖｉｒｕｓꎬ ＳＰＣＦＶ)是侵染甘薯( Ｉｐｏｍｏｅａ ｂａｔａｔａｓ)的主
要病毒之一ꎮ 国际病毒分类委员会( ＩＣＴＶ)第九次
报告将 ＳＰＣＦＶ划为线性病毒科(Ｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ)香石
竹潜隐病毒属(Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ)病毒[１]ꎮ １９９２ 年国际
马铃薯中心( Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｏｔａｔｏ ＣｅｎｔｅｒꎬＣＩＰ)从 １
份叶片表现褪绿斑的甘薯种质资源中检测到该病
毒ꎬ随后多个国家和地区相继报道了此病毒的发生
与危害[２~７]ꎮ 虽然 ＳＰＣＦＶ单独侵染甘薯时症状轻
微ꎬ但该病毒与甘薯褪绿矮化病毒( Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ
ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｓｔｕｎｔ ｖｉｒｕｓꎬ ＳＰＣＳＶ)共侵染甘薯时可形成
协生病害ꎬ导致甘薯产生严重的症状[８]ꎮ 目前已
报道的 ＳＰＣＦＶ ｃｐ 基因序列不多ꎬ基于 ｃｐ 基因序
列的进化树分析ꎬＳＰＣＦＶ分为 ２ 个类群ꎬ东非分离
物和 ＣＩＰ分离物组成了其中的一个主要类群[９]ꎮ
血清学研究表明ꎬＳＰＣＦＶ与甘薯上的常见病毒ꎬ例
如ꎬ马铃薯 Ｙ 病毒属(Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ)的甘薯羽状斑驳
病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｆｅａｔｈｅｒｙ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓꎬＳＰＦＭＶ)、
甘薯潜隐病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓꎬＳＰＬＶ)、甘
薯 Ｇ 病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｖｉｒｕｓ ＧꎬＳＰＶＧ)和甘薯病
毒属( Ｉｐｏｍｏｖｉｒｕｓ)的甘薯轻斑驳病毒(Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ
ｍｉｌｄ ｍｏｔｔｌｅ ｖｉｒｕｓꎬ ＳＰＭＭＶ)以及毛形病毒属(Ｃｒｉ￣
ｎｉｖｉｒｕｓ)的甘薯褪绿矮化病毒(ＳＰＣＳＶ)等无血清学
关系[１０]ꎮ
２００９~ ２０１０ 年ꎬＱｉａｏ 等利用血清学方法对采
自我国的 １７６ 份甘薯样品进行检测ꎬ结果发现ꎬ有
５.７％的样品感染了 ＳＰＣＦＶ[７]ꎮ Ａｒｉｔｕａ 等克隆了
ＳＰＣＦＶ中国分离物的 ｃｐ 基因序列ꎬ包括广州分离
物( Ｇｗａｎｇｚｈｕ １) 和台湾分离物 ( ＴＮ３４０) 各 １
个[２]ꎮ 目前ꎬ国内外关于 ＳＰＣＦＶ病毒基因的克隆、
表达以及抗体制备等相关研究还很薄弱ꎮ 本研究
利用ＲＴ￣ＰＣＲ方法ꎬ从采自四川、广东、江西和广西
的甘薯样品中克隆获得 ＳＰＣＦＶ完整 ｃｐ基因序列ꎬ
通过序列分析明确了 ｃｐ基因的分子变异情况ꎮ 此
外ꎬ还构建了四川分离物 ｃｐ基因的原核表达载体ꎬ
在大肠杆菌中进行了高效表达ꎬ并制备了特异性抗
体ꎬ为该病毒的进一步研究奠定了基础ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 植物材料
２０１０~２０１１ 年ꎬ从广东、四川、广西、江西采集
表现病毒病症状的甘薯样品 １００份ꎬ种植于防虫温
室内ꎮ 样品成活后嫁接健康巴西牵牛 ( Ｉｐｏｍｏｅａ
ｓｅｔｏｓａ)上ꎬ取甘薯叶片或嫁接发病的巴西牵牛叶
片用于本研究ꎮ 甘薯脱毒茎尖试管苗为河南省农
作物病虫害防治重点实验室 /农业部华北南部作物
有害生物综合治理重点实验室保存ꎮ
１.２ 试剂盒与试剂
ＳＰＣＦＶ ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ 检测试剂盒购自国际马
铃薯中心(ＣＩＰ)ꎻＵＮＩＱ￣１０ 柱式总 ＲＮＡ 抽提试剂
盒(产品编号:ＳＫ１３６２)为上海生工生物工程公司
产品ꎬＡｘｙＰｒｅｐ ＤＮＡ胶回收试剂盒(产品型号:ＡＰ￣
ＧＸ￣５０)和质粒小量制备试剂盒 (产品目录号:
ＤＰ１００２)分别购自杭州爱思进生物技术有限公司
和北京百泰克生物技术公司ꎻＡＭＶ 反转录酶、
ＥｘＴａｑ ＤＮＡ聚合酶和 ｐＭＤ１９￣Ｔ载体购自 ＴａＫａＲａ
公司ꎬ碱性磷酸酶标记的羊抗兔 ＩｇＧ购自北京中杉
金桥生物技术有限公司ꎻ其他常用试剂为国产或进
口分析纯试剂ꎮ
１.３ 引物
根据 ＧｅｎＢａｎｋ中 ＳＰＣＦＶ的核苷酸序列(登录
号: ＥＵ３７５９０１、 ＥＵ３７５９０５、 ＥＵ３７５９０７、 ＥＵ３７５９０８、
ＥＵ３７５９１０ 和 ＡＹ４６１４２１)ꎬ设计扩增 ＳＰＣＦＶ ｃｐ 基
因的 引 物ꎬ 正 向 引 物 ＳＰＣＰ１９ 的 序 列 为 ５′￣
ＧＡＡＧＡＧＴＡＧＣＹＣＴＧＡＲＧＴＲＡＡＲＧ￣３′ꎬ 位 于 ｃｐ
基因上游与编码 ＴＧＢｐ３( ｔｒｉｐｌｅ ｇｅｎｅ ｂｌｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎ
３)基因的间隔区ꎻ反向引物 ＳＰＣＰ２０ 的序列为
５′￣ＡＧＡＡＡＴＣＲＹＡＡＧＡＣＡＡＣＲＲＴＣＣＣ￣３′ꎬ位于 ｃｐ
基因下游核酸结合蛋白(ＮａＢＰ)基因区域ꎮ 根据
获得的 ＳＰＣＦＶ四川分离物的 ｃｐ 基因序列设计正
向 引 物 ＣＦＶＢＰ１ ( ５′￣ＣＧＧＡＡＴＴＣＡＴＧ￣
ＧＣＡＧＣＧＡＡＧＧＡＧＧ￣３′)和反向引物 ＣＦＶＢＰ２(５′￣
ＣＣＧＣＴＣＧＡＧＴＣＡＣＴＴＧＣＡＣＴＴＣＣＣＡ￣３′)ꎬ 用 于
ｃｐ基因原核表达载体的构建ꎬＣＦＶＢＰ１ 引物对应
于该分离物 ｃｐ 基因编码区１~１６ ｎｔꎬ并在其中引入
一个 ＥｃｏＲ Ｉ 位点ꎬＣＦＶＢＰ２ 引物与 ｃｐ 基因终止密
码子附近序列互补ꎬ并在终止密码子的下游引入一
个 Ｘｈｏ Ｉ位点ꎮ 此外ꎬ设计正向引物 ＣＦＶＪＣＰ１(５′￣
ＡＡＴＧＡＲＣＣＣＣＣＤＴＣＷＧＧＲＴＧＧＣＡ￣３′)和反向引
物 ＣＦＶＪＣＰ２ ( ５′￣ＴＴＲＡＴＴＴＣＲＣＡＷＧＣＹＴＧＣＴ￣
ＧＣＣ￣３′)扩增 ＳＰＣＦＶ ｃｐ基因片段(目的片段大小
为 ２５４ ｂｐ)ꎬ用于甘薯样品 ＳＰＣＦＶ病毒的 ＲＴ￣ＰＣＲ
检测ꎮ 上述引物均由上海生工生物工程技术服务
５３６
植物病理学报 ４４卷
有限公司合成ꎮ
１.４ 甘薯样品的 ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ检测
按照 ＣＩＰ 的 ＳＰＣＦＶ ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ 检测试剂盒
操作说明ꎬ对甘薯样品进行 ＳＰＣＦＶ检测ꎬ取血清学
阳性样品开展后续试验ꎮ
１.５ 植物总 ＲＮＡ提取和 ＲＴ￣ＰＣＲ
首先利用 ＵＮＩＱ￣１０ 柱式总 ＲＮＡ 抽提试剂盒ꎬ
分别提取经 ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ 检测 ＳＰＣＦＶ 呈阳性的样
品叶片总 ＲＮＡꎬ利用反向引物 ＳＰＣＰ２０ 反转录合成
ｃＤＮＡ第一链ꎬ再进行 ＰＣＲ扩增目的基因ꎮ ＰＣＲ反
应体系为: ｃＤＮＡ ２ μＬ、 １０ × ＥｘＴａｑ Ｂｕｆｆｅｒ (含
ＭｇＣｌ２) ２.５ μＬ、 ２.５ ｍｍｏｌ / Ｌ ｄＮＴＰ混合物 ２ μＬꎬ正
向引物 ＳＰＣＰ１９和反向引物 ＳＰＣＰ２０各 ２ μＬꎬＥｘＴａｑ
ＤＮＡ聚合酶 (５ Ｕ / μＬ) ０.２ μＬꎬ补充 ｄｄＨ２Ｏ至总体
积 ２５ μＬꎮ ＰＣＲ 反应条件为:９４℃ １ ｍｉｎꎬ５５℃ １
ｍｉｎꎬ７２℃ １ ｍｉｎꎬ３５个循环ꎻ７２℃延伸 １０ ｍｉｎꎮ
１.６ ｃｐ基因的克隆和序列分析
利用 ＤＮＡ胶回收试剂盒回收纯化目的片段ꎬ
然后与 ｐＭＤ１９￣Ｔ载体连接ꎬ连接产物转化大肠杆
菌 ＪＭ１０９ꎬ经蓝白斑筛选和 ＰＣＲ 鉴定后获得阳性
克隆ꎮ 核苷酸序列测定由宝生物工程(大连)有限
公司完成ꎮ 利用 ＤＮＡＭＡＮ和 ＢＬＡＳＴ软件对所测
序列进行比较分析ꎬ利用 ＭＥＧＡ４.０ 软件的邻近聚
类算法(Ｎｅｉｇｈｂｏｒ￣Ｊｏｉｎｉｎｇꎬ ＮＪ)构建系统进化树ꎮ
１.７ ＳＰＣＦＶ四川分离物 ｃｐ基因原核表达载体的
构建及诱导表达
利用引物 ＣＦＶＢＰ１ 和 ＣＦＶＢＰ２ꎬ以获得的
ＳＰＣＦＶ四川分离物 ｃｐ 基因的重组质粒为模板进
行 ＰＣＲ扩增ꎬ并将扩增产物克隆至 ｐＭＤ１９￣Ｔ 载体
中ꎬ获得重组质粒 ｐＭＤ￣ＣＦＶＣＰꎮ 质粒 ｐＭＤ￣
ＣＦＶＣＰ经 ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｘｈｏ Ｉ 双酶切处理ꎬ回收目的
片段并将目的片段与经同样酶切处理的 ｐＥＴ￣２８ａ
(＋)载体连接ꎬ连接产物转化大肠杆菌 Ｊｍ１０９ꎬ经
ＰＣＲ 筛选阳性克隆并测序验证ꎬ获得重组质粒
ｐＥＴ￣ＣＦＶＣＰꎮ 将 ｐＥＴ￣ＣＦＶＣＰ 质粒转化大肠杆菌
ＢＬ２１(ＤＥ３)进行诱导表达和 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ分析[１１]ꎮ
１.８ ＳＰＣＦＶ抗血清的制备和效价测定
原核表达产物经 １２.５％的 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 电泳分
离后ꎬ将凝胶用预冷的 ０.２５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＣｌ溶液浸泡
５ ｍｉｎꎬ重蒸水冲洗后ꎬ切下含目的条带的凝胶ꎬ按
１ ∶ １ (ｗ / ｖ) 比例加入 ＰＢＳ 缓冲液(０. １４ ｍｏｌ / Ｌ
ＮａＣｌ、２.７ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＣｌ、１.５ ｍｍｏｌ / Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、８.１
ｍｍｏｌ / Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４)ꎬ于冰浴中研磨ꎮ 用 ＰＢＳ 缓冲
液适当稀释后ꎬ加入等体积的福氏不完全佐剂进行
乳化ꎮ 采用肌肉注射的方法免疫家兔ꎬ共免疫 ６
次ꎬ免疫家兔的工作由郑州博赛生物技术公司协助
完成ꎮ 以感病甘薯叶片的汁液作为抗原包被酶联
板ꎬ利用 ＡＣＰ￣ＥＬＩＳＡ[ １２ ]方法测定抗血清的效价ꎮ
１.９ ＳＰＣＦＶ抗血清检测应用
利用制备的抗血清对采自田间的甘薯病毒样
品进行检测ꎬ具体方法为:取甘薯叶片用 ＰＢＳ￣
Ｔｗｅｅｎ缓冲液按 １ ∶ １０(ｗ / ｖ)用量研磨ꎬ低速离心
后取上清进行 ＡＣＰ￣ＥＬＩＳＡ 检测[ １１ ]ꎬ用甘薯脱毒
茎尖试管苗叶片的汁液作为阴性对照ꎬ抗血清工作
浓度为１ ∶ １０ ０００倍ꎬＰ / Ｎ > ２.０ꎬ判定为阳性ꎮ 同
时利用 ＣＩＰ 的 ＳＰＣＦＶ ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ 试剂盒和 ＲＴ￣
ＰＣＲ 方法进行验证ꎮ ＲＴ￣ＰＣＲ 使用的引物为
ＣＦＶＪＣＰ１和 ＣＦＶＪＣＰ２ꎮ
２ 结果与分析
２.１ ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ的检测
ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ检测结果表明ꎬ四川南充、广东湛
江、江西余江和广西百色各有 １份样品表现 ＳＰＣＦＶ
阳性ꎬ样品编号分别为 Ｇ￣Ｓｉｃｈｕａｎ￣１０￣６０、Ｂ￣Ｇｕａｎｇ￣
ｄｏｎｇ￣１１￣５、Ｂ￣Ｊｉａｎｇｘｉ￣１１￣４和 Ｂ￣Ｇｕａｎｇｘｉ￣１１￣１ꎮ
２.２ ＳＰＣＦＶ ｃｐ的基因克隆和序列分析
ＲＴ￣ＰＣＲ 扩增上述 ４ 份阳性样品均得到了大
小约为 １.１ ｋｂ 的特异性片段ꎬ与预测大小一致ꎮ
将扩增出的特异性片段克隆到 ｐＭＤ１９￣Ｔ载体上进
行序列测定ꎬ序列分析结果表明ꎬ所克隆的片段全
长均为 １ １０９ ｂｐꎬ包括完整的 ｃｐ 基因以及部分编
码 ＴＧＢｐ３ 基因的间隔区和部分核酸结合蛋白
(ＮａＢＰ)基因的核苷酸序列ꎮ ４ 个分离物的 ｃｐ 基
因均由 ９００ 个核苷酸残基组成ꎬ编码 ２９９ 个氨基
酸ꎮ ４个分离物 ｃｐ 基因的核苷酸序列一致性为
７８.３％ ~ ８９. ９％ꎮ 其中ꎬ来自江西余江的分离物
Ｂ￣Ｊｉａｎｇｘｉ￣１１￣４与其他分离物的核苷酸序列一致性
较低ꎬ 仅为 ７８. ３％ ~ ７９. ４％ꎬ Ｇ￣Ｓｉｃｈｕａｎ￣１０￣６０、
Ｂ￣Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ￣１１￣５和 Ｂ￣Ｇｕａｎｇｘｉ￣１１￣１ ３ 个分离物
６３６
６期 乔 奇ꎬ等:甘薯褪绿斑病毒外壳蛋白的分子变异及其特异抗血清制备
之间的核苷酸序列一致性则较高ꎬ为 ８７. ６％ ~
８９.９％ꎻ４个分离物 ｃｐ基因推导的氨基酸序列一致
性为 ９１.３％ ~ ９５.７％ꎬ其中 Ｂ￣Ｊｉａｎｇｘｉ￣１１￣４ 与其他 ３
个分离物的一致性为 ９１.３％ ~ ９２.０％ꎬ其他 ３ 个分
离物之间的一致性为 ９４.３％ ~ ９５.７％ꎮ ４ 个分离物
与已报道的其他 １５个分离物(表 １)ｃｐ基因的核苷
酸序列和推导的氨基酸序列的一致性分别为
７５.９％~９０.７％和 ８９.６％ ~ ９７.０％ꎮ 其中ꎬＢ￣Ｊｉａｎｇｘｉ￣
１１￣４分离物与 ００７ＶＩＩＭＳ 和中国台湾的 ＴＮ３４０ ２
个分离物的序列一致性较高ꎬ氨基酸序列的一致性
分别为 ９５.７％和 ９５.３％ꎬ与其他 １３ 个分离物的氨
基酸序列一致性为 ８９.６％ ~ ９２.３％ꎮ Ｇ￣Ｓｉｃｈｕａｎ￣１０￣
６０、Ｂ￣Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ￣１１￣５和 Ｂ￣Ｇｕａｎｇｘｉ￣１１￣１分离物与
其他 １３个分离物的序列一致性则较高ꎬ核苷酸序
列和推导的氨基酸序列的一致性分别为 ８５.１％ ~
９０.７％和 ９１.６~９７.０％ꎮ 上述结果说明我国 ＳＰＣＦＶ
不同分离物的 ｃｐ基因存在较大的分子变异ꎮ
基于 ＣＰ氨基酸序列构建的进化树显示ꎬ本研
究的 ４ 个中国分离物分为 ２ 个类群ꎬ其中 Ｂ￣Ｊｉａｎ￣
ｇｘｉ￣１１￣４ 与 ００７ＶＩＩＭＳ 分离物和中国台湾分离物
ＴＮ３４０ 为一个类群ꎬ Ｂ￣Ｇｕａｎｇｘｉ￣１１￣１、 Ｂ￣Ｇｕａｎｇ￣
ｄｏｎｇ￣１１￣５、Ｇ￣Ｓｉｃｈｕａｎ￣１０￣６０分离物与其他 １３ 个分
离物组成另一个类群(图 １)ꎮ 此外ꎬ不同分离物
ＣＰ的 Ｎ末端变异较大ꎬ第 ３￣３２位氨基酸为多变区
(图 ２)ꎬ其他部分相对保守ꎮ
２.３ ＳＰＣＦＶ四川分离物 ｃｐ基因原核表达载体构
建及原核表达
以含有 Ｇ￣Ｓｉｃｈｕａｎ￣１０￣６０ 分离物 ｃｐ 基因的重
组质粒为模板ꎬ利用引物 ＣＦＶＢＰ１ 和 ＣＦＶＢＰ２ 进
行 ＰＣＲ扩增ꎬ获得大小为 ０.９ ｋｂ的目的条带ꎬ将目
的条带克隆至 ｐＭＤ１９￣Ｔ 载体中ꎬ获得重组质粒
ｐＭＤ￣ＣＦＶＣＰꎮ 利用 ＥｃｏＲ Ｉ 和 Ｘｈｏ Ｉ 双酶切处理ꎬ
将酶切后回收的目的片段克隆至 ｐＥＴ￣２８ａ ( ＋)表
达载体中ꎬ测序表明成功构建了 ＳＰＣＦＶ ｃｐ 基因的
原核表达载体 ｐＥＴ￣ＣＦＶＣＰꎮ
Ｔａｂｌｅ １ Ｔｈｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｉｓｏｌａｔｅ Ｃｏｕｎｔｒｙ ｏｆ ｏｒｉｇｉｎ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｋｉｂｏｇａ ６ｂ Ｕｇａｎｄａ ＥＵ３７５９０８ [２]
Ｈｏｉｍａ ３ｃ Ｕｇａｎｄａ ＥＵ３７５９０２ [２]
ＫＢＬ ３８ Ｕｇａｎｄａ ＥＵ３７５９０３ [２]
Ｍｐｉｇｉ ６ｂ Ｕｇａｎｄａ ＥＵ３７５９０６ [２]
９４￣１Ｓ Ｋｅｎｙａ ＥＵ３７５９００ [２]
ＳＰＣＦＶ￣ＣＩＰ Ｐｅｒｕ ＥＵ３７５８９９ [２]
Ｈｏｉｍａ ４ Ｕｇａｎｄａ ＡＹ４６１４２１ [１０]
Ｒｕｋｉｎｇｉｒｉ １ｂ Ｕｇａｎｄａ ＥＵ３７５９０７ [２]
Ｎｊｏｒｏ ５ Ｋｅｎｙａ ＥＵ３７５９１０ [２]
ＫＹ５ Ｋｅｎｙａ ＥＵ３７５９０４ [２]
Ｂ￣Ｇｕａｎｇｘｉ￣１１￣１ Ｃｈｉｎａ ＫＣ１３０１８６ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
ＴＮ３９９ Ｕｎｋｎｏｗｎ ＥＵ３７５９０９ [２]
Ｂ￣Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ￣１１￣５ Ｃｈｉｎａ ＫＣ１３０１８４ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｇｗａｎｇｚｈｕ １ Ｃｈｉｎａ ＥＵ３７５９０１ [２]
Ｇ￣Ｓｉｃｈｕａｎ￣１０￣６０ Ｃｈｉｎａ ＫＣ１３０１８３ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｌｅ￣９７￣５９８ Ｕｎｋｎｏｗｎ ＥＵ３７５９０５ [２]
Ｂ￣Ｊｉａｎｇｘｉ￣１１￣４ Ｃｈｉｎａ ＫＣ１３０１８５ Ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
００７ＶＩＩＭＳ Ｕｎｋｎｏｗｎ ＥＵ３７５８９７ [２]
ＴＮ３４０ Ｃｈｉｎａ ＥＵ３７５８９８ [２]
７３６
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. １ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｃｐ ｏｆ １９ ＳＰＣＦＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ
ＭＹａＶ (ＡＢ５１０４７７) ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｏｕｔｇｒｏｕｐ.
Ｆｉｇ. ２ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｏ ３５ｔｈ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄｓ ｏｆ ｃｐ ｆｒｏｍ
１９ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ｃｈｌｏｒｏｔｉｃ ｆｌｅｃｋ ｖｉｒｕｓ
Ｄｏｔ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｗａｓ ｔｈｅ ｓａｍｅ ａｓ ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｏｎｅ ｏｆ ｉｓｏｌａｔｅ Ｋｉｂｏｇａ ６ｂ..
８３６
６期 乔 奇ꎬ等:甘薯褪绿斑病毒外壳蛋白的分子变异及其特异抗血清制备
将 ｐＥＴ￣ＣＦＶＣＰ 质粒转化大肠杆菌 ＢＬ２１
(ＤＥ３)ꎬ收集 ＩＰＴＧ 诱导的菌液ꎬ以诱导的含 ｐＥＴ￣
２８ａ(＋)的菌液以及未诱导的含 ｐＥＴ￣ＣＦＶＣＰ 重组
质粒的菌液为阴性对照ꎬ进行 ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ 分析ꎮ
结果表明ꎬ含 ｐＥＴ￣ＣＦＶＣＰ 质粒的菌株诱导后特异
性地表达出大小为 ３６.５ ｋＤａ 的目的蛋白(图 ３)ꎬ
说明 ｃｐ基因得到了正确表达ꎮ
Ｆｉｇ. ３ ＳＤＳ￣ＰＡＧＥ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｏｆ ｐＥＴ￣ＣＦＶＣＰ
Ｌａｎｅ １:ＢＬ２１(ＤＥ３)ꎻＬａｎｅ ２:ｐＥＴ￣２８ａ ( ＋) ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｎｄｕｃ￣
ｔｉｏｎꎻＬａｎｅ ３: ｐＥＴ￣２８ａ(＋) ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ ＩＰＴＧꎻＬａｎｅ ４:ｐＥＴ￣
ＣＦＶＣＰ ｗｉｔｈｏｕｔ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎꎻＬａｎｅ ５:ｐＥＴ￣ＣＦＶＣＰ ｉｎｄｕｃｅｄ ｗｉｔｈ
ＩＰＴＧꎻＬａｎｅ ６:Ｐｒｏｔｅｉｎ ｍａｒｋｅｒ.
２.４ 抗血清制备和效价测定
利用回收的特异性表达的 ３６.５ ｋＤａ 蛋白免疫
家兔ꎮ 第 ６次免疫后 １０ ｄ 采血ꎬ获得 ＳＰＣＦＶ 的抗
血清ꎮ ＡＣＰ￣ＥＬＩＳＡ 测定结果表明ꎬ抗血清稀释
１２ ８００倍后仍能与 ＳＰＣＦＶ侵染的甘薯叶片的汁液
发生阳性反应ꎮ
２.５ ＳＰＣＦＶ抗血清检测应用
以稀释 １０ ０００倍的 ＳＰＣＦＶ 抗血清作为一抗ꎬ
利用 ＡＣＰ￣ＥＬＩＳＡ方法对采自田间的 ２３ 份甘薯样
品进行检测ꎬ结果表明ꎬ有 ２份样品与 ＳＰＣＦＶ抗血
清呈阳性反应ꎬ其余 ２１份样品则呈阴性反应ꎬ利用
ＣＦＶＪＣＰ１ / ＣＦＶＪＣＰ２ 引物对 ＲＴ￣ＰＣＲ 扩增 ＳＰＣＦＶ
ｃｐ基因片段ꎬ结果表明上述 ２ 份血清学阳性样品
中均可扩增出大小为 ２５４ ｂｐ 的目的条带ꎬ而 ２１ 份
血清学阴性样品中则不能扩增到目的条带ꎮ 用国
际马铃薯中心(ＣＩＰ)的 ＳＰＣＦＶ ＮＣＭ￣ＥＬＩＳＡ 试剂
盒对上述样品进行复检ꎬ检测结果完全一致ꎮ 这些
试验结果说明本研究所制备的抗血清具有较好的
特异性ꎬ可用于田间甘薯样品的检测ꎮ
３ 讨论
ＳＰＣＦＶ病毒粒子长度为 ８００ ｎｍ左右ꎬ比香石
竹潜隐病毒属(Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ)其他病毒的粒子(长度
为 ６１０￣７００ｎｍ)要长ꎬ而与 Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ 病毒却相似ꎬ
早期曾推测该病毒可能属于 Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ 属病毒[２]ꎮ
但是ꎬ电镜观察发现在感病植物组织中 ＳＰＣＦＶ 病
毒粒子数量有限ꎬ没有形成风轮状内含体ꎬ不具备
Ｐｏｔｙｖｉｒｕｓ病毒典型的细胞病理学特征ꎬ却与 Ｃａｒｌａ￣
ｖｉｒｕｓ病毒很相似[２]ꎮ Ａｒｉｔｕａ等对 ＳＰＣＦＶ乌干达分
离物 Ｈｏｉｍａ ４基因组的分子特征研究表明ꎬ该分离
物与 Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ 病毒相同ꎬ基因组中均包含 ６ 个
ＯＲＦｓꎬ但是 ６个 ＯＲＦｓ编码的氨基酸序列与乌头潜
隐病毒 ( Ａｃｏｎｉｔｕｍ ｌａｔｅｎｔ ｖｉｒｕｓ)、蓝莓焦枯病毒
(Ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｓｃｏｒｃｈ ｖｉｒｕｓ)、百合无症病毒 ( Ｌｉｌｙ
ｓｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓ ｖｉｒｕｓ)等典型 Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ病毒的相似性
较低ꎬ在进化树上只与 Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ 的暂定种甜瓜黄
化相关病毒(Ｍｅｌｏｎ ｙｅｌｌｏｗｉｎｇ￣ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ)关
系较近[ １０ ]ꎮ ２００９ 年 ＩＣＴＶ 第九次报告将 ＳＰＣＦＶ
和甜瓜黄化相关病毒均划为香石竹潜隐病毒
属[１]ꎮ 此外ꎬ本研究的 ４ 个分离物和已报道的
ＳＰＣＦＶ分离物的 ＣＰ 氨基酸序列 Ｃ 末端均含有
“ＤＸ＝１５ ＴＧＧ”基序ꎬ具有 Ｃａｒｌａｖｉｒｕｓ 病毒 “ＤＸ＝１６￣２０
ＴＧＧ”基序的相似特征ꎮ
本研究的 ４ 个分离物分别取自广东、广西、江
西和四川ꎬ均为中国南方薯区ꎬ但 ４个分离物 ｃｐ 基
因核苷酸序列一致性为 ７８.３％ ~ ８９.９％ꎬ序列存在
较大的分子变异ꎮ ４个分离物 ｃｐ 基因推导的氨基
酸序列一致性为 ９１. ３％ ~ ９５. ７％ꎬ其中 Ｎ 末端第
３￣３２位氨基酸变异较大ꎬ３０个氨基酸中有 ２５ 个存
在差异ꎬ而氨基酸序列的其他区域较为保守ꎮ 在系
统进化树上ꎬ６ 个中国分离物分为 ２ 组ꎬ其中来自
广东湛江的样品 Ｂ￣Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ￣１１￣５、广西百色的
Ｂ￣Ｇｕａｎｇｘｉ￣１１￣１、四川南充的 Ｇ￣Ｓｉｃｈｕａｎ￣１０￣６０ 和已
报道的广州分离物(Ｇｗａｎｇｚｈｕ １)为一组ꎬＢ￣Ｊｉａｎ￣
ｇｘｉ￣１１￣４和台湾分离物(ＴＮ３４０)为另外一组ꎮ 中
９３６
植物病理学报 ４４卷
国不仅是世界上甘薯种植面积最大的国家ꎬ而且甘
薯种植区域辽阔ꎬ复杂的生态条件为病毒与寄主协
同进化过程中病毒发生分子变异提供了有利条件ꎮ
因此ꎬ进一步研究 ＳＰＣＦＶ ２ 个组群分离物的致病
性、寄主范围等对于探明 ＳＰＣＦＶ 是否存在株系分
化具有重要意义ꎬ并可为该病毒在我国的发生演替
规律研究奠定基础ꎮ
本研究在大肠杆菌中高效表达了 ＳＰＣＦＶ的外
壳蛋白ꎬ并以表达的外壳蛋白为抗原免疫家兔制备
了抗血清ꎮ 效价测定表明ꎬ抗血清稀释 １２ ８００ 倍
后仍能与感病甘薯叶片汁液产生阳性反应ꎬ而且ꎬ
检测结果与 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测结果和国际马铃薯中心
提供的 ＳＰＣＦＶ抗血清检测结果完全一致ꎮ 高质量
ＳＰＣＦＶ抗血清的获得ꎬ为高效快速检测方法的建
立以及对该病毒的监测和预警奠定了良好基础ꎮ
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ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｉｓｅｒｕｍ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ａｃｔａ Ｐｈｙ￣
ｔｏｐａｔｈｏｌｏｇｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物病理学报 )ꎬ ２００７ꎬ ３７
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责任编辑:于金枝
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