全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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-
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
!"#$)##)"#
基金项目$贵州省科技计划厅联合基金项目"黔科合
12
字
!"#*
(
&!#3
#&贵州省教育厅重点项目"黔教合
45
字
!"#*
(
!(#
#
作者简介$蒋向辉"
#3&*
#!男!博士!副教授!主要从事药用植物功能成分研究)
6)78.9
$
-
:;<.&(3
!
#+%,=>7
金银花丙酮酸激酶基因的克隆与表达特性分析
蒋向辉!冯仕彪
"凯里学院 化学与材料工程学院!贵州凯里
$$+"##
#
摘
!
要$采用
?@)AB?
和
?CB6
技术!首次从金银花中克隆丙酮酸激酶基因全长
=DEC
!命名为
!
"
#$%
"
F<0G80H
登录号
IJ+!#3*+,#
#!
"
#$%
基因编码区序列全长为
#$%%K
L
!共编码
$#"
个氨基酸)基于基因序列亲缘关系分析
结果显示!
"
#$%
基因与烟草
#$%
基因亲缘关系最近!属于双子叶植物
#$%
基因家族)蛋白质亚细胞定位分析认
为
1
-
AH=
在线粒体或叶绿体中发挥作用)
1
-
AH=
蛋白质的三维空间结构预测结果显示!
1
-
AH=
蛋白主要由
"
)
螺旋*
不规则盘绕组成)定量
AB?
检测发现!
"
#$%
基因在金银花不同组织中广泛表达!但表达水平各有差异!黄花中表
达量最高)该研究丰富了
#$%
基因库资源!为揭示
!
"
#$%
基因在金银花糖代谢方面的生物学作用奠定了基础)
关键词$金银花&丙酮酸激酶基因&表达特性&定量
AB?
中图分类号$
J&($
&
J&(+
文献标志码$
C
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+
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98
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P8Z<89
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V
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L
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&
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Q80T.T8T.Z!!
金银花"
!&(%)*+
"
+
,
&(%+@PQ0K,
#系忍冬科
忍冬属多年生常绿藤本植物!又名金花*银花和忍冬
花!是中国中医和民族民间医生常用的药材!其药用
价值较高!具有广谱抗菌和散风消肿的功效!常用于
治疗清热解毒*痈肿疔疮*丹毒和血痢等病症#()目
前!国内外主要针对其化学成分*药用价值和经济价
值作了大量的研究!)*(!但有关金银花丙酮酸激酶的
研究还未见有报道)
丙酮酸激酶"
LV
UQZ8T!简称
A4
#作为高
等植物糖酵解中的一种限速酶!催化磷酸烯醇式丙
酮酸生成
C@A
和丙酮酸的相关反应!而丙酮酸又
是三羧酸循环"
@BC
#的重要前体物质!参与萜类物
质代谢和氨基酸合成等多种生理生化反应$(!丙酮
酸激酶在所有生物细胞代谢途径中都起着十分重要
的作用)
G等+(研究发现!在转基因烟草中
A4
缺乏可导致花芽分化和开花延迟)
40>\9等&(研究发现!转基因烟草由于
-.#4%
的缺乏!与
野生型相对表现为生长相对缓慢!且碳元素的积累
相对较少*暗呼吸速度减慢)
9^.Z等((通过
?EC.
技术来抑制
5.#4%
在马铃薯中的表达!研究
发现突变体表现为丙酮酸*有机酸含量与野生型相
比相对减少)
S80
O
\80
等3(和
C0WU<
等#"(通过对
拟南芥
6.#4%
和油菜
7#4%
功能的研究发现!
A4
有调节与控制光合作用的产物转化为油脂的作用)
_P80
O
等##)#!(研究发现!水稻
/^A4#
蛋白缺失的突
变体植株矮化!出现有叶鞘包穗的现象!结实率与野
生型相比明显降低!进一步研究发现其
CGC
%
FC
的相对含量发生了变化且抗氧化能力减弱)另有研
究表明
A4
是催化光合产物生成油脂的关键酶#%()
可见!
A4
的活性与植物的糖代谢*能量代谢和信号
转导等方面的功能有关)因此!克隆金银花丙酮酸
激酶基因!并研究其功能对探索金银花发育过程中
的生理生化反应特性有十分重要的意义)本研究首
先通过对高等绿色植物
#$%
基因序列的分析!根据
保守序列设计简并性引物!并通过采用
?@)AB?
和
?CB6
技术从药用植物金银花中克隆
!
"
#$%
基因
全长!解析
!
"
#$%
基因的结构*功能及其在金银花
不同部位的表达情况!为全面解析
!
"
#$%
基因在金
银花生长发育中的生理作用提供重要参考)
#
!
材料和方法
@,@
!
材料与试剂
实验材料为金银花!于
!""3
年引自山东省平邑
县)实验所需的
AB?
相关试剂
WE@A/
和
DEC
A>9
V
7*
L
XD#()@
载体均购自宝生物工程有限
公司试剂&逆转录的
?E8/抑制剂*逆转录酶*
9^)
.
O
>
"
W@
#
#(
与
D08/<
#
等购自
AU>7<
O
8
公司&限制性
内切酶购自
XGM
公司产品&
?CB6
克隆试剂盒为
B9>0T<=P
公司产品&用于提取
?EC
的
@U.[>9
试剂
与定量
AB?
的
S5G?AU<7.:
购自
@8H8U8
公司)
@=A
!
金银花总
BC>
提取与引物设计
采用
@U.[>9
试剂提取金银花嫩叶总
?EC
!按
?CB6
试剂盒的相关说明合成
=DEC
第一链)从
EBGM
"
PTT
L
$%%
\\\,0=K.,097,0.P,
O
>Z
%#中下载高
等植物
#$%
基因家族的核苷酸序列!采用
DEC)
XCE
软件进行同源性分析!选取与金银花亲缘关
系相对较近的烟草
-.#4%
基因序列为参考序列!
同时兼顾蓖麻*葡萄*梅花*油棕等
#$%
核苷酸序列
的保守性设计简并性引物!
AB?
所用引物见表
#
)
@=D
!
金银花
1
2
45"
基因克隆
首先将从金银花绿蕾中提取的
?EC
逆转录为
=DEC
!以此作为模板进行简并性引物的
AB?
扩
增!获得
!
"
#$%
基因片段!再通过
AU.7软件
根据已知片段序列分别设计
!
"
#$%
基因
$`)?CB6
外侧引物
!
"
#$%)FSA#
与内侧引物
!
"
#$%)EFSA#
!
以及
%`)?CB6
外侧引物
!
"
#$%)FSA!
与内侧引物
!
"
#$%)EFSA!
!并分别与
?CB6
试剂盒中的通用引
物
YAX
与
EYAX
配对!以通过
?CB6
试剂盒得
到的
=DEC
第一链为模板进行
AB?
扩增!产物回
收克隆测序后!将得到的
$`)?CB6
和
%`)?CB6
序
列拼接!并对起始密码子与终止密码子在
EBGM
中
进行比对确认!最后得到
!
"
#$%
基因的全长
BDS
)
@=E
!
金银花
1
2
45"
基因序列的生物信息学分析
通过
DECXCE
和
X6FC*,"
软件相结合对
相关序列进行比对和处理后!进行核苷酸序列分析
与构建系统进化树)通过
AU>T
L
8U87
在线软件进行
蛋白质理化性质分析*
@7
L
U"
PTT
L
$%%
\\\,=P,
<7K0U
O
%
/>;T\8U<
%
@XA?6D
+
;>U7,PT79
#进行
跨膜区分析*
AUT<.0
"
PTT
L
$%%
\\\,
L
UL
U>T<.0,>U
O
%#进行二级结构分析*
SaMSS)X D^61
%
SaMSS)AWKb.<\进行蛋白质三级结构分析)
@=F
!
金银花
1
2
45"
基因在不同部位表达量定量
5$B
检测
分别提取
*
年生金银花绿蕾*白蕾*白花*黄花*
幼叶和幼茎的总
?EC
!逆转录为
=DEC
后作为模
板!进行
J)AB?
扩增!检测
!
"
#$%
基因表达情况!
!
"
#$%
基因特异引物序列与内参基因
C=T.0
引物序
表
@
!
5$B
扩增引物
@8K9<#
!
AU.7L
9.;.=8T.>0
引物名称
AU.7引物序列
AU.7]
Q<0=<
"
$`
"
%`
#
简并性引物
#
D<
O
<0L
U.7F@BCCCBC@CFCBC@CFCFFF
简并性引物
!
D<
O
<0L
U.7BCBCCBCC@FCF@@@FFB@B@C
!
"
#$%)FSA# FCBC@CFCFFFCC@B@@FCCFFCCB
!
"
#$%)EFSA# CBC@CFCF@FFFCC@B@@FCCFFC
!
"
#$%)FSA! BCBCCBCC@FCF@@@FFB@B@C
!
"
#$%)EFSA! C@FCCFBCBBCBCCBCFCC@BCBB
YAX
B@CC@CBFCB@BCB@C@CFFFBCCFBCF@)
FF@C@BCCBFBCFCF@
EYAX CCFBCF@FF@C@BCCBFBCFCF@
!
"
#$%)R CB@@CFFC@B@@FC@C@BBCC@FCF
!
"
#$%)? FC@BBC@@FC@BCF@B@FF@BB@CF
6%.)R C@FC@FB@BBBCFFFBCF@@@
6%.)? @BBC@F@BC@BBBCF@@FB@F
*&%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
列见表
#
)
!
!
结果与分析
A=@
!
金银花总
BC>
提取与
1
2
45"
基因中间序列
的克隆
采用
@U.[>9
法从金银花老叶*白蕾*嫩叶和白
花中分别提取总
?EC
!经
",(c
琼脂糖电泳检测结
果显示"图
#
#!从白蕾中提取的总
?EC
条带较为清
析完整!将其逆转录为
=DEC
!用设计好的简并性引
物扩增得到
#
条约为
+""K
L
左右的亮带"图
#
#!克
隆测序后发现其长度为
+#&K
L
!该序列与
EBGM
数
据库中
#$%
基因一致性较高!表明该片段是金银花
!
"
#$%
基因的一部分)
A=A
金银花
1
2
45"
基因全长
0GC>
克隆
!
"
#$%)FSA#
和
YAX
的
AB?
产物在
3""K
L
左右的位置显示
#
条亮带!将此
AB?
产物稀释
#"
倍后作为模板!用
!
"
#$%)EFSA#
与
EYAX
的引物
对进行
AB?
扩增!电泳检测在
(""K
L
左右位置有
#
条亮带"图
!
#!将产物克隆测序后得到
&3"K
L
插入
片段!将该序列在
EBGM
数据库进行
G98/T
比对)结
果表明!该序列是
!
"
#$%
基因的一部分!并含有
C@F
起始密码子)
!
"
#$%)FSA!
和
YAX
的
AB?
产物在
#"""K
L
左右显示
#
条亮带!将此
AB?
产物
稀释
#"
倍后作为模板!用
!
"
#$%)EFSA!
与
EYAX
的引物对进行
AB?
扩增!电泳检测在
*3"K
L
左右
位置有
#
条亮带"图
!
#!测序结果表明!该序列为
*&!K
L
!
"
#$%
基因的一部分!并含有终止密码子
@FC
)将
$`)?CB6
和
%`)?CB6
扩增产物序列在
F<0=
软件中拼接得到
!
"
#$%
基因的全长
BDS
序列
3+"K
L
"
F<0G80H
登录号
IJ+!#3*+,#
#)
图
#
!
金银花
?EC
提取及
!
"
#$%
中间片段克隆
#
$
*
分别为老叶*白蕾*嫩叶和白花
?EC
&
$
*
+,
为
!
"
#$%
中间片段扩增产物*空白对照
R.
O
,#
!
D0>;!3
"
+
,
&(%+?EC
80W7.WW9<;U8
O
7<0T>;!
"
#$%
#*,?EC;U>7>9W9<8;
!
\P.T!
V
>Q0
O
9<8;80W
\P.T<;9>\!
UL
<=T.Z<9
V
&
$
!
+,X.WW9<;U8
O
7<0T
87
L
9.;.L
U>WQ=T/!
"
#$%
!
K980H=>0TU>9
A=D
!
金银花
1
2
45"
基因序列分析
A=D=@
!
1
2
45"
全长
0GC>
拼接及生物信息学分析
!
将获得的两端序列与同源片段序列进行拼接得到
#
个长
#(3&K
L
的
BDS
序列)序列分析表明!
"
#8
$%
基因编码区由
#$%%
个核苷酸组成!编码
#
个含
有
$#"
个氨基酸的蛋白质!起始密码子为
C@F
!终
止密码子为
@FC
"图
%
#)
EBGM
在线比对发现!该
基因编码的氨基酸序列与蓖麻*碧桃*烟草和杨树等
植物中
!
"
#$%
基因编码的氨基酸序列一致性都达
到
(+c
以上)
AU>T
L
8U87
分析其理化性质!推测该
蛋白的分子式
B
$+*+
2
3*#&
E
#(&&
^
!%+3
S
%&(
!相对分子量
为
#$%+#&,&
!等电点为
*,3+
)对
1
-
AH=
蛋白进行
蛋白跨膜区域预测!结果显示$整个序列只有一个跨
膜信号区域!这个区域的氨基酸序列为
1R1111M)
ACMb1bMS5A1
!
1
-
AH=
蛋白跨膜结构域中
E
端位
于胞外!而
B
端位于胞内!在
F<0G80H
中进行同源
性分析表明
1
-
AH=
蛋白氨基酸序列与其他植物
AH=
蛋白的同源区域主要集中在
E
端结合结构域!在
B
端同源性较低)进一步亚细胞定位研究表明!
1
-
AH=
蛋白定位于线粒体或叶绿体"可能性
(&,+c
#!符合
功能基因的亚细胞定位特征)
采用
AS^ ?@
在线工具对
!
"
#$%
进行蛋白质亚
细胞定位分析认为
!
"
#$%
可能在线粒体或叶绿体
等细胞器中发挥作用)参照蒋向辉等#*(的方法将
!
"
#$%)5RA
的融合表达载体通过原生质体法转入
拟南芥!结果"图
*
#显示!在
!
"
#$%)5RA
融合表达
细胞中!黄色荧光蛋白主要分布于叶绿体与线粒体
图
!
!
!
"
#$%
基因
$`)?CB6
和
%`)?CB6
扩增结果
#
$
*
分别为绿蕾*白蕾*白花和黄花
$`)?CB6
第一轮
AB?
产物&
$
为第二轮
AB?
产物&
+
为第二轮对照&
$
3
分别为
%`)?CB6
第一轮
AB?
产物!第二轮
AB?
产物!第二轮对照
R.
O
,!
!
69<=TU>
L
P>U0>;$`)?CB6
80W%`)?CB687
L
9.;.=8T.>0
#*,$`)?CB6;.U/TU>Q0WAB?
L
U>WQ=T/;U>7
O
U<<0KQW
!
\P.T!
\P.T<;9>\!
V
<9>\;9>\!
UL
<=T.Z<9
V
&
$,@P<
/<=>0WU>Q0W
L
U>WQ=T/
&
+,G980H=>0TU>9>;/<=>0WU>Q0W
&
&3,%`)?CB6;.U/TU>Q0WAB?
L
U>WQ=T/
!
/<=>0W
U>Q0WAB?
L
U>WQ=T/
!
K980H=>0TU>9>;/<=>0WU>Q0W
$&%!
#!
期
!!!!!!!!!!!!
蒋向辉!等$金银花丙酮酸激酶基因的克隆与表达特性分析
区域!图
*
显示
1
-
AH=
蛋白主要在植物细胞的线粒
体或叶绿体上表达!这与生物信息学分析的结果基
本一致)
A=D=A
!
H
I
5J0
蛋白质的三维空间结构预测
!
采用
SaMSS)X D^61
%
SaMSS)AWKb.<\在线数据库进
行蛋白质三级结构特征分析!并进行高级结构预测!
结果显示!
1
-
AH=
蛋白主要由
"
)
螺旋*不规则盘绕与
延伸链组成"图
$
#!
"
螺旋为主是叶绿体和线粒体的
主要空间结构!也是
1
-
AH=
蛋白质行使生物学功能
的基础)
A=D=D
!
1
2
45"
基因系统进化关系分析
!
!
"
#$%
基
因在
EBGM
数据库中比对分析发现!与
!
"
#$%
基因
亲缘关系较近的主要是双子叶植物的
#$%
基因!与
单子叶植物相对较远)系统进化分析结果"图
+
#表
明!
"
#$%
与蓖麻*碧桃*烟草和杨树的亲缘关系相
对较近)进一步对
!
"
#$%
编码的蛋白质与蓖麻*碧
桃*烟草*杨树等的蛋白质序列进行同源分析!结果
表明!
1
-
AH=
蛋白与
*
个物种的一致性都较高!表明
#$%
基因在物种进化过程有着较高的保守性)
图
%
!
!
"
#$%
基因核苷酸序列和推测氨基酸序列
带下划线
C@F
表示起始密码子&
#
,
表示终止密码子
@FC
R.
O
,%
!
=DEC/<
]
Q<0=<80WW8=.W/<
]
Q<0=<>;!
"
#$%
C@F\.TPQ0WU=>W>0
&
@FC\.TP
#
7<80/TU=>W>0
+&%!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
*
!
1
-
AH=)5RA
蛋白在拟南芥中表达
8,
绿光激发内源荧光&
K,
蓝光激发
5RA
&
=,
合成图
R.
O
,*
!
R9Q>U/=>
L
<>K/0>;U<
L
>UTL
U>T<.05RA.06*+9(:&
,
/(/
8,FU<<09.
O
PT<:=.T8T.>0.0TU.0/.=;9Q>U&
K,G9Q<9.
O
PT<:=.T8T.>0)5RA
&
=,XO
O
<
图
$
!
1
-
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金银花
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2
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基因在不同部位表达量比较
金银花
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基因在不同部位表达定量
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检测结果"表
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!
"
#$%
基因在黄花相对表达
量最高"
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#!而白花中表达量相对较低"
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!
"
#$%
基因在幼茎中相对表达量最低"
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中相对表达量是幼茎的
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倍&对
!
"
#$%
在不同
组织的相对表达量进行方差分析表明!不同组织之
间
!
"
#$%
的相对表达量差异达到极显著水平&进一
步对不同组织间的差异进行多重比较!结果显示!除
绿蕾与幼叶之间的相对表达量差异没有达到显著水
平外!其他组织之间的差异均达到极显著水平"表
!
#)表明
!
"
#$%
基因在金银花不同组织部位中都
表
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!
不同组织中
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化较大)
%
!
讨
!
论
从拟南芥*烟草*番茄和水稻等植物中分离的
#4%
基因序列分析表明!
#4%
基因是一个多基因的
家族!不同植物含有不同的成员个数&()本研究发
现
!
"
#4%
与其他植物的对应基因同源性极高!编码
的蛋白也都有特征性的丙酮酸激酶位点!
"
#4%
是
编码金银花丙酮酸激酶的
A4=
家族新成员!本研究
也证实了
#$%
家族基因在进化过程中的保守性)
本研究分析表明!
"
#4%
基因的启动子为组成型启
动子!该基因在不同组织中表达量明显不同!相对表
达量大小依次为黄花
%
白花
%
白蕾
%
绿蕾
%
幼叶
%
幼茎)金银花初开的药或花蕾!其药用价值相对较
高!含有大量的生物碱和多糖!
!
"
#4%
在金银花花
中的表达量相对较高!该基因的表达可能与调控金
银花花中糖的代谢过程有关)
丙酮酸激酸通过调控植物的糖酵解来调控植物
的糖代谢及能量代谢!从而进一步影响植物的生长
&&%!
#!
期
!!!!!!!!!!!!
蒋向辉!等$金银花丙酮酸激酶基因的克隆与表达特性分析
发育!大量的研究表明!几乎所有的生物体都至少有
一种丙酮酸激酶基因及其对应的酶!但任何丙酮酸
激酶中的保守的氨基酸残基的基因转变都可能引起
丙酮酸激酶的稳定性*活性和变化!最后引起功能的
改变)低等生物酵母中即使有丙酮酸激酶基因的缺
失!其也可以通过补充外源葡萄糖而存活!但是如果
大肠杆菌缺失相应的丙酮酸激酶时!其在无氧条件
则不能存活&丙酮酸激酶缺失的真菌细胞同样无法
进行糖酵解途径而不能存活#$()在高等植物中!丙
酮酸激酶基因被
?EC.
干扰的烟草在低光照条件下
根长比野生型明显要短!花芽分化和开花时间明显
延迟+(!且部分叶片的边缘出现明显的齿刻#+()在
#4%
缺失的拟南芥突变体中!不能积累油脂!萌发
时间明显延迟!幼苗的生长必须依赖外源糖的供
给#&(!这表明
A4=
是催化光合产物生成油脂的一个
关键步骤)
R>=H/
等#((在研究一个拟南芥皱叶型突
变体时发现其糖酵解的活性也有降低现象!同时种
子的含油量也明显降低!而
a6G6?
等#+(发现在烟
草突变体中!即使有丙酮酸激酶的缺失!植物体仍能
正常生长!相关的生理代谢与野生型基本一致!但其
叶片中磷酸烯醇式丙酮酸的含量要明显地高于野生
型!这进一步表明丙酮酸激酶是磷酸烯醇式丙酮酸转
变为丙酮酸的关键酶)本研究克隆了金银花
!
"
#4%
的全长
BDS
!为通过
!
"
#4%
在金银花中的过表达和
干扰表达研究金银花中糖酵解途径及该途径对金银
花次生代谢产物的影响打下了较好的基础)
参考文献!

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国家药典委员会
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中国药典
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北京$中国医药科技出版社!
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