全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４４(４): ４２２￣４２７(２０１４)
收稿日期: ２０１２￣１１￣０９ꎻ 修回日期: ２０１４￣０３￣１４
基金项目: 国家自然科学基金项目(３０９７１９５４)ꎻ江苏高校优势学科建设工程资助项目
通讯作者: 马桂珍ꎬ教授ꎬ主要从事植物病害生物防治研究ꎻＴｅｌ:０５１８￣８５８９５４２７ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｇｕｉｚｈｅｎｍａ＠ｓｏｈｕ.ｃｏｍ
第一作者: 王淑芳ꎬ女ꎬ河北安国市人ꎬ博士ꎬ主要从事有益微生物的利用及植物病害生物防治研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｗａｎｇｓｈｕｆａｎｇ２００１＠ｈｏｔｍａｉｌ.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０４.０１１
应用实时荧光定量技术评价粉红粘帚霉
对水稻纹枯病的田间防治效果
王淑芳１ꎬ 马桂珍１∗ꎬ 李世东２ꎬ 孙漫红２ꎬ 暴增海１ꎬ 付泓润１ꎬ 葛平华１
( １淮海工学院海洋学院ꎬ连云港 ２２２００５ꎻ ２中国农业科学研究院植物保护研究所ꎬ北京 １０００８１)
摘要:本研究利用实时荧光定量 ＰＣＲ技术监测施用生防菌前后土壤中粉红粘帚霉 ６７￣１和水稻纹枯病菌 ＡＧ￣１ＩＡ的数量ꎬ并
调查发病情况ꎬ收割后测产ꎬ评估生防菌粉红粘帚霉 ６７￣１的田间防治效果ꎮ 实时荧光定量检测结果表明ꎬ粉红粘帚霉 ６７￣１
防治水稻纹枯病的效果随着用药浓度的增加而增强ꎬ各处理间差异极显著ꎮ 用药后土壤中粉红粘帚霉 ６７￣１的含量在一定
时间内随培养时间的延长逐渐升高ꎬ停止用药后逐渐减少ꎮ 水稻纹枯病菌在清水对照组中没有显著变化ꎬ在处理组中水稻
纹枯病菌的数量随时间降低ꎮ ６０ ｇ / ６６７ ｍ２菌量的防效及产量与井冈霉素对照组差异不显著ꎮ 防病保产结果与实时荧光定
量结果基本一致ꎬ说明粉红粘帚霉 ６７￣１的孢子制剂对水稻纹枯病具有优良的田间防治效果ꎬ实时荧光定量 ＰＣＲ 技术可以
用于生物防治效果的田间评价ꎮ
关键词:粉红粘帚霉ꎻ水稻纹枯病菌ꎻ荧光定量 ＰＣＲꎻ田间防治效果
Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｔｈｅ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ｏｎ ｒｉｃｅ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ
ｕｓｉｎｇ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ 　 ＷＡＮＧ Ｓｈｕ￣ｆａｎｇ１ꎬＭＡ Ｇｕｉ￣ｚｈｅｎ１ꎬ２ꎬ ＬＩ Ｓｈｉ￣ｄｏｎｇꎬ
ＳＵＮ Ｍａｎ￣ｈｏｎｇꎬ ＢＡＯ Ｚｅｎｇ￣ｈａｉ１ꎬ ＦＵ Ｈｏｎｇ￣ｒｕｎ１ꎬ ＧＥ Ｐｉｎｇ￣ｈｕａ　 ( １Ｍａｒｉｎｅ ｃｏｌｌｅｇｅꎬ Ｈｕａｉｈａｉ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｏｌｏ￣
ｇｙꎬ Ｌｉａｎｙｕｎｇａｎｇ ２２２００５ꎬＣｈｉｎａꎻ ２ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ ＣＡＡＳꎬ Ｂｅｉｊｉｎｇ １０００８１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｉｓ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｍｉｃｒｏｂｅ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅｒａｐｙ Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ
６７￣１ ｈａｄ ｂｅｅｎ ｐｒｏｖｅｄ. Ｔｈｉｓ ｐａｐｅｒ ａｉｍｅｄ ａｔ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｆｉｅｌｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ６７￣１ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｒｉｃｅ ｓｈｅａｔｈ
ｂｌｉｇｈｔ ｏｆ Ｇ. ｒｏｓｅｕｍ ６７￣１ ａｎｄ Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ ＡＧ￣１ＩＡ ｂｙ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ Ｒｅａｌｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ
ＰＣＲｄｉｓｅａｓｅ ｉｎｄｅｘａｎｄ ｙｉｅｌｄ. Ｔｈｅ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｏｕｎｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ６７￣１ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｗｉｔｈ ｔｉｍｅꎬ ｔｈｅ
ｈｉｇｈｅｓｔ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｔ ｔｈｅ ２２ｔｈ ｄａｙ ａｎｄ ｔｈｅｎ ｄｅｃｒｅａｓｅｄ . Ａｄｄｉｔｉｏｎａｌｌｙꎬ ｔｈｅ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｒｉｃｅ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ ｐａｔｈｏｇｅｎ
Ａ￣１ＩＡ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｃｈａｎｇｅ ｉｎ ｔｈｅ ｐｕｒｅ ｗａｔｅｒꎬ ａｎｄ ｄａｔａ ｏｆ ６０ｇ / ６６７ｍ２ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｈａｄ ｎｏ ｏｂｖｉｏｕｓｌｙ ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ
ｗｉｔｈ ｔｈａｔ ｏｆ ｖａｌｉｄａｍｙｃｉｎ Ａ ｃｏｎｔｒｏｌ. Ｆｉｅｌｄ ｔｒｉａｌ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ Ｇ. ｒｏｓｅｕｍ ６７￣１ ｈａｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｃｔ ａｎｄ
ｔｈｅｒａｐｙꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ ｙｉｅｌｄ ｏｆ ｒｉｃｅ. Ｉｎ ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎꎬ ｔｈｅ Ｇ. ｒｏｓｅｕｍ ６７￣１ ｓｐｏｒｅ ｗａｓ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｉｎ ｃｏｎｔｒｏｌｉｎｇ
ｒｉｃｅ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ ｐａｔｈｏｇｅｎꎬ ａｎｄ Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ａｇｅｎｔｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍꎻ ｒｉｃｅ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔꎻ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲꎻ Ｆｉｅｌｄ ｅｆｆｉｃａｃｙ
中图分类号: Ｓ４３２.４４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０４￣０４２２￣０６
　 　 水稻纹枯病是遍及全球的水稻病害ꎬ对水稻的
危害极大ꎮ 一般造成 １０％~ ３０％的减产ꎬ严重时可
达 ５０％[１ꎬ２]ꎮ 由于此病发生面积广、流行频率高ꎬ
所致损失往往高于稻瘟病ꎬ因此成为水稻稳产、高
产的严重障碍ꎮ
　 　 长期以来ꎬ生产上用于防治水稻纹枯病的主要
措施之一是喷施井冈霉素及其复配剂ꎮ 由于长期
使用单一品种的药剂ꎬ导致水稻纹枯病的防治效果
　
　 ４期 王淑芳ꎬ等:应用实时荧光定量技术评价粉红粘帚霉对水稻纹枯病的田间防治效果
逐年下降[ ３~５]ꎮ 随着生物防治技术的日趋成熟ꎬ粘
帚霉(Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ)在植病生物防治中的应用潜力
正日益受到人们的重视ꎬ并不断有所突破ꎮ 据报
道ꎬ国内外许多学者已将其用于防治水稻纹枯病ꎬ
国外已有粘帚霉制剂[ ６ ]商品化生产ꎮ
　 　 粉红粘帚霉(Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ) ６７￣１ 对核
盘菌的菌核( Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ)有强烈的破
坏作用ꎬ同时还能够寄生立枯丝核菌(Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ
ｓｏｌａｎｉ)等多种植物病原菌[ ７ ]ꎮ 前期实验证明这一
粉红粘帚霉菌株制剂叶面喷施对小麦纹枯病、大豆
菌核病及番茄灰霉病防效达 ７０％以上ꎮ 目前已开
发出 ６７￣１ 的可湿性粉剂ꎬ田间实验证明该可湿性
粉剂对大豆菌核病的的防效超过或 ２５％咪鲜胺乳
油 ５０％多菌灵可湿性粉剂效果ꎬ其增产效果也比
较明显[ ８~１０]ꎮ 多年来抗菌机制及防治效果是国内
外学者对生防菌的研究重点ꎬ少有学者关注生防菌
在环境中与病原微生物的相互作用ꎮ 但是ꎬ深入研
究自然土壤生态系中病原微生物和生防微生物的
互作及种群生态学ꎬ对发展植病生防理论和进一步
提高生防菌的防效具有重要意义[１１]ꎮ 本实验利用
实时荧光定量 ＰＣＲ 技术ꎬ以实时监测到的喷施粉
红粘帚霉 ６７￣１可湿性粉剂的水稻土壤中生防菌与
水稻纹枯病菌的定量数据为基础ꎬ同时调查病情指
数ꎬ计算田间防病效果ꎬ并结合测产数据对该菌对
水稻纹枯病的防治作用进行理论与田间数据相结
合的分析ꎬ为该菌的广泛应用提供依据ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 供试药剂
　 　 ２亿活孢子 / ｇ 粉红粘帚霉可湿性粉剂由中国
农业科学院植物保护研究所土传病害实验室研制
提供ꎮ ５％ 井岗霉素水剂由浙江钱江生物化学股
份有限公司生产ꎬ购于江苏省灌云县植保站ꎮ 常用
生化试剂、ＵＮＩＱ￣１０柱式 ＤＮＡ 回收试剂盒和实时
荧光定量 ＰＣＲ扩增引物由上海生工生物工程有限
公司生产ꎬＳＹＢＲ􀅹 Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ( Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ
Ｔｉｍｅ) 试剂由大连宝生物工程有限公司生产ꎮ
１.２　 试验田基本情况
　 　 试验于 ２０１１ 年在连云港市灌云县水稻田进
行ꎮ 试验田平坦ꎬ排水方便ꎮ 供试品种为新稻 １８ꎮ
５月 ２０ 日播种ꎬ６ 月 ２０ 日移栽ꎬ６ 月 ２０ 日施基肥
(４５％复合肥 ２５ ｋｇ / ６６７ｍ２、尿素 １０ ｋｇ / ６６７ｍ２)ꎬ７
月 １日施返青肥尿素 ２０ ｋｇ / ６６７ｍ２ꎬ８月 １０ 日施穗
肥尿素 ７.５ ｋｇ / ６６７ｍ２ꎮ １１ 月 ５ 日收获ꎮ 水肥管理
采取栽后至烤田前浅水分蘖足水ꎬ孕穗、抽穗扬花
后内歇灌溉ꎬ收割前半个月断水ꎮ
１.３　 田间试验设计
　 　 粉红粘帚霉孢子制剂(２ 亿活孢子 / ｇ)用量设
５ 个浓度:３０ｇ / ６６７ ｍ２、４０ｇ / ６６７ ｍ２、５０ｇ / ６６７ ｍ２、
６０ｇ / ６６７ ｍ２、７０ｇ / ６６７ ｍ２ꎻ以 ５％井冈霉素 ２００ ｍＬ /
６６７ ｍ２为对照 ＣＫ１ꎬ清水为空白对照 ＣＫ２ꎮ 每一
浓度及对照为一处理ꎬ每一处理重复 ３次ꎮ 试验田
周围设 ２. ５ ｍ 保护行ꎬ小区随机排列ꎬ面积为
１６ｍ２ꎬ每小区周围设 ０􀆰 ５ ｍ保护行ꎮ ８月 ３１日和 ９
月 ８日分别施药 １次ꎬ采用背负式手动压缩喷雾器
喷雾ꎮ 两次用药前(８ 月 ３１ 日和 ９ 月 ８ 日)和用药
后(９月 １５ 日ꎬ９ 月 ２２ 日ꎬ１０ 月 ２ 日ꎬ１０ 月 １２ 日和
１０月 ２２日)按照 ５点取样法采集水稻根部 ０~１５ ｃｍ
深度的土壤样品ꎬ提取土壤 ＤＮＡꎬ应用实时荧光定
量 ＰＣＲ方法ꎬ测定不同处理土壤中粉红粘帚霉和水
稻纹枯病菌的数量ꎮ 同时参照 Ｔａｎ 等[１２]的方法ꎬ调
查 ８月 ３１日用药前和 ９ 月 ２２ 日的病情指数ꎬ计算
防病效果ꎮ 水稻收获后不同小区单独测定水稻产
量ꎬ计算保产效果ꎮ
１.４　 标准曲线的构建
　 　 参照 Ｗｈｉｔｅ 等的方法[１３]ꎬ用 ＩＴＳ１ / ＩＴＳ４ 引物
分别扩增 ６７￣１菌株和 ＡＧ１￣ＩＡ菌株的 ＩＴＳ序列ꎬ并
分别克隆到大肠杆菌 ＤＨ５а的感受态细胞ꎬ筛选阳
性克隆子ꎮ 分别提取含 ６７￣１菌株 ＩＴＳ 序列的阳性
克隆子 Ｚ＿１和含 ＡＧ￣１ＩＡ菌株 ＩＴＳ序列的阳性克隆
子Ｗ＿１２做标准品ꎬ用紫外分光光度计测定质粒的
浓度ꎮ 将制备好的质粒进行 １０倍梯度稀释ꎬ使质粒
的浓度为 １０１ ~１０８拷贝 / μＬꎬ以模板数的对数值为横
坐标ꎬ以临界循环值 Ｃｔ为纵坐标ꎬ建立标准曲线ꎮ
１.５　 土壤样品 ＤＮＡ提取和 ＤＮＡ浓度纯度测定
　 　 土壤 ＤＮＡ提取参照 Ｚｈａｏ等[１４]的方法略加修
改ꎬ先进行土壤样品预处理ꎬ再结合玻璃珠破碎和
ＣＴＡＢ￣ＳＤＳ 方法进行手提获得粗提 ＤＮＡꎮ 粗提
ＤＮＡ用 ＵＮＩＱ￣１０ 柱式 ＤＡＮ 回收试剂盒进行纯
化ꎬ纯化后的 ＤＮＡ经稀释用于 ＰＣＲ扩增ꎮ
３２４
　
植物病理学报 ４４卷
１.６　 扩增体系和程序
　 　 粉红粘帚霉实时荧光定量采用特异性引物
ＧＲＯ￣Ｒ ( ５′￣ＧＡＡＴＡＴＣＡＣＴＡＣＴＴＣＧＣＡＧＡＧＧ￣３′)
和 ＧＲＯ￣Ｆ(５′￣ＧＣＧＴＣＡＴＴＴＣＡＡＣＣＣＴＣＡＣ￣３′) [１５]ꎮ
水稻纹枯病实时荧光定量采用特异性引物 ＲｓＦｘ(５′￣
ＣＡＧＡＴＧＡＡＣＣＧＣＴＴＣＴＡＡＴＡＧＴＣＣＡ￣３′) 和 ＲｓＲｎ
(５′￣ＧＧＧＴＡＧＴＣＣＴＡＣＣＴＧＡＴＴＴＧＡＧＡＴＣＡ￣３′)[１６]ꎮ
　 　 采用大连宝生物工程有限公司生产的 ＳＹＢＲ􀅹
Ｐｒｅｍｉｘ Ｅｘ ＴａｑＴＭ(Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅ) 试剂进行扩
增ꎮ 扩增采用 ２０ μＬ体系ꎮ 扩增的体系如下:ＳＹＢＲ
ｂｕｆｆｅｒ:１０ μＬꎬ引物各 ０.３ μｍｏｌ / ＬꎬＤＮＡ模板 １ μＬꎬ
无菌水补足到 ２０ μＬꎮ 扩增采用两步法ꎬ程序如下:
９５℃预变性 ３０ ｓꎻ ９５℃变性 ５ ｓꎬ６０℃退火和延伸
３０ｓꎬ此处收集荧光信号ꎬ共 ４０个循环ꎻ最后按照 ｉＱ５
实时荧光定量检测系统默认程序制备融解曲线ꎬ
９５℃变性 １ ｍｉｎꎬ５５℃复性 １ ｍｉｎꎬ５５℃复性 ３０ ｓꎬ此
处收集荧光信号ꎮ 将测定样品的 Ｃｔ 值代入标准曲
线的线性公式ꎬ得到体系中模板的数量ꎮ
１.７　 数据分析
　 　 本研究数据分析采用 ＳＰＳＳ(版本 １３.０)软件
进行显著性检验和相关性分析ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 粉红粘帚霉 ６７￣１ 和水稻纹枯病菌 ＡＧ￣１ＩＡ
实时荧光定量 ＰＣＲ标准曲线制作
　 　 用制备的标准品进行实时荧光定量扩增ꎬ获得
标准曲线(图 １、图 ２)ꎮ 由可知ꎬ当粉红粘帚霉 ６７￣
１菌株起始数量在 １０２１０８拷贝 / μＬ之间时ꎬ待测样
品中粉红粘帚霉 ６７￣１ 菌株的起始数量与 ＰＣＲ 扩
增循环数之间呈现良好的线性关系ꎬ相关系数为 ０.
９９８ꎬ线性方程为 ｙ ＝ ３.４６７ｘ＋３７. １８９ꎬ扩增效率为
９４％(图 １)ꎮ 当水稻纹枯病菌 ＡＧ￣１ＩＡ起始数量在
１０３－１０８拷贝 / μＬ 之间时ꎬ待测样品中水稻纹枯病
菌 ＡＧ－１ＩＡ的起始数量与 ＰＣＲ扩增循环数之间呈
现良好的线性关系ꎬ相关系数为为 ０.９９９ꎬ线性方程
为 ｙ＝３.５８１ｘ＋４１.９６９ꎬ扩增效率为 ９０.２％(图 ２)ꎮ
２.２　 不同处理后土壤中粉红粘帚霉实时荧光定量
ＰＣＲ检测结果
　 　 提取各处理组土壤样品 ＤＮＡꎬ分别进行实时
荧光定量 ＰＣＲ 检测ꎬ测定粉红粘帚霉 ６７￣１的数量
变化(表 １)ꎮ 可知ꎬ除去 ５０ ｇ / ６６７ ｍ２处理组ꎬ其他
处理组中 ８月 ３１日到 ９月 ２２日ꎬ粉红粘帚霉的数
量不断增加ꎬ在 ９ 月 ２２ 日ꎬ达到最高ꎮ 而且除去
５０ ｇ / ６６７ ｍ２处理组ꎬ其他各个处理组粉红粘帚霉
６７￣１菌株在 ９月 ２２日的数量随用药量的增加而增
加ꎮ 在 ９月 ２２日到 １０月 ２２日ꎬ除去 ５０ ｇ / ６６７ ｍ２
处理组ꎬ其他各处理组数量明显开始减少ꎮ ５０ｇ /
６６７ ｍ２处理组早于其他处理组达到最高ꎬ并以 ９ 月
１５日为转折点ꎬ之后逐渐降低ꎮ 对照组粉红粘帚
霉数量相对于处理组变化不显著(Ｐ<０.０１)ꎮ
Ｆｉｇ. １　 Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ Ｇｌｉｏｃｌａｄｉ￣
ｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ６７￣１
Ｆｉｇ. ２　 Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ ｏｆ ＡＧ￣１ＩＡ
２.３　 不同处理后土壤中水稻纹枯病菌 ＡＧ￣１ＩＡ 的
实时荧光定量 ＰＣＲ检测结果
　 　 在检测土壤样品中粉红粘帚霉数量的同时ꎬ对
不同的处理组进行水稻纹枯病菌 ＡＧ￣１ＩＡ的实时荧
光定量 ＰＣＲ检测ꎮ 在处理组和 ５％井冈霉素对照组
４２４
　
　 ４期 王淑芳ꎬ等:应用实时荧光定量技术评价粉红粘帚霉对水稻纹枯病的田间防治效果
Ｔａｂｌｅ １　 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲ ｏｆ Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｏｓｅｕｍ ６７￣１
Ｓｐｏｒｅ ｗｅｉｇｈｔ
ｇ / ６６７ｍ２
Ｄａｔａ / ×１０９ ｃｏｐｉｅｓ􀅰ｇ ｄｒｙ ｓｏｉｌ－１
３１ꎬ Ａｕｇ. ８ꎬ Ｓｅｐ. １５ꎬ Ｓｅｐ. ２２ꎬ Ｓｅｐ. ２ꎬ Ｏｃｔ. １２ꎬ Ｏｃｔ. ２２ꎬ Ｏｃｔ.
３０ １.２８±０.０３ ３.７１±０.１９ ４.４４±０.１４ ４.６７±０.１７ ２.１０±０.１０ ２.５０±０.１１ １.５１±０.０１
４０ １.２８±０.０３ ３.８６±０.０７ ４.３７±０.１６ ４.７９±０.１８ ２.５１±０.１１ ２.４９±０.１２ ２.０１±０.０１
５０ １.２８±０.０３ ４.０１±０.２０ ４.７２±０.２０ ４.６６±０.２１ ２.９７±０.０８ ２.８７±０.１２ ２.４０±０.１２
６０ １.２８±０.０３ ４.１８±０.２０ ４.７３±０.２４ ５.００±０.２３ ３.３５±０.１４ ３.０９±０.１５ ２.８１±０.１４
７０ １.２８±０.０３ ４.２４±０.２０ ５.００±０.２５ ５.８５±０.２６ ３.６８±０.１７ ３.４３±０.０９ ３.２３±０.１６
ＣＫ１ １.２８±０.０３ １.５５±０.０６ １.３７±０.０４ １.２８±０.０７ ２.１９±０.０５ ２.１７±０.１１ １.３０±０.０６
ＣＫ２ １.２８±０.０３ １.４２±０.０７ １.５７±０.０８ １.５６±０.０５ ２.３４±０.１２ ２.３２±０.１３ １.４８±０.０５
　
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ＰＣＲ ｏｆ ＡＧ￣１ＩＡ
Ｓｐｏｒｅ ｗｅｉｇｈｔ
ｇ / ６６７ｍ２
Ｄａｔａ / ×１０９ ｃｏｐｉｅｓ􀅰ｇ ｄｒｙ ｓｏｉｌ－１
３１ꎬ Ａｕｇ. ８ꎬ Ｓｅｐ. １５ꎬ Ｓｅｐ. ２２ꎬ Ｓｅｐ. ２ꎬ Ｏｃｔ. １２ꎬ Ｏｃｔ. ２２ꎬ Ｏｃｔ.
３０ ４.７２±０.２５ ３.８７±０.２９ ３.４９±０.１６ ３.６２±０.１３ ２.９５±０.１５ ２.５８±０.１２ ２.４２±０.１１
４０ ４.７２±０.２５ ３.６２±０.１３ ３.６７±０.１７ ３.４２±０.１５ ２.６１±０.０９ ２.５２±０.１２ ２.２５±０.１０
５０ ４.７２±０.２５ ３.５１±０.１４ ３.４６±０.１２ ３.２１±０.１０ ２.９９±０.０５ ２.４３±０.１１ ２.２８±０.１０
６０ ４.７２±０.２５ ３.４３±０.１５ ３.２１±０.１７ ２.３１±０.１５ ２.２４±０.１１ ２.１６±０.１０ ２.２１±０.０３
７０ ４.７２±０.２５ ３.４２±０.１４ ３.６６±０.１５ ２.６０±０.１１ ２.３３±０.１１ ２.１０±０.０６ ２.０９±０.０５
ＣＫ１ ４.７２±０.２５ ３.２８±０.１５ ２.０８±０.１１ ２.１８±０.０８ ２.３０±０.１２ ２.０５±０.１２ ２.３５±０.１１
ＣＫ２ ４.７２±０.２５ ５.９０±０.０２ ６.２５±０.０１ ８.００±０.０２ ４.４４±０.１７ ４.２８±０.１１ ４.１８±０.１８
　
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｂｉｏｃｏｎｔｒｏｌ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ ｒｅｓｅｕｍ ６７￣１ ｏｎ ｒｉｃｅ ｓｈｅａｔｈ ｂｌｉｇｈｔ
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ
(ｇ / ６６７ｍ２)
Ｐｒｏｔｅｃｔ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ / ％
Ｔｏｔａｌ ｓｐｉｋｅ Ｇｒａｉｎｓ ｐｅｒ ｓｐｉｋｅ Ｙｉｅｌｄ / ｋｇ
Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｔｈａｎ
ｃｏｎｔｒｏｌ / ％
３０ ４３.４７ｅＣ ４ ２５１ １３１.２ １３.８ ２.２２ｅＤ
４０ ４９.５８ｄＣ ４ １８９ １３１.５ １３.８ ２.２２ｅＤ
５０ ５６.４９ｃＢ ４ ２２３ １３２.０ １４.０ ３.７０ｄＣ
６０ ６２.５９ｂＡＢ ４ ２５３ １３２.３ １４.３ ５.９３ｃＢ
７０ ６８.５１ ａＡ ４ ３１１ １３２.７ １４.８ ９.６３ａＡ
ＣＫ１ ６５.４６ ａｂＡ ４ ２３７ １３２.５ １４.４ ６.６７ｂＢ
ＣＫ２ － ４ １８７ １３０.７ １３.５ －
　
ＣＫ１中ꎬ水稻纹枯病菌的数量基本上为逐渐下降
的趋势ꎻ而且各个处理组水稻纹枯病菌 ＡＧ－１ＩＡ
的数量随用药量的增加而减少ꎻ各处理组间除第一
次测量外ꎬ各测量时间获得的菌量均存在极显著差
异(Ｐ<０.０１)ꎻ清水对照组 ＣＫ２ 的水稻纹枯病菌数
量相对于其他组ꎬ基本没有变化(表 ２)ꎮ
２.４　 粉红粘帚霉孢子制剂防治水稻纹枯病试验结果
　 　 参照文献[１２]ꎬ调查 ８月 ３１日和 ９月 ２２日的
５２４
　
植物病理学报 ４４卷
病情指数ꎬ计算防效ꎮ 水稻收获后测定产量ꎮ 随着
施药量的增加ꎬ病情指数降低ꎬ防效升高ꎮ 在 ７０ ｇ /
６６７ ｍ２的时候ꎬ防效最高为 ６８.５１％ꎮ 施用 ５％井冈
霉素水剂 ２００ ｍＬ / ６６７ ｍ２的对照组中ꎬ防效为
６５.４６％ꎮ喷洒粉红粘帚霉 ６７￣１ 菌 ７０ｇ / ６６７ ｍ２的处
理与施用 ５％井冈霉素水剂 ２００ ｍＬ / ６６７ ｍ２的处理
防效数值接近ꎮ 测产结果表明ꎬ随着用药量的增
加ꎬ总穗数、穗粒数和产量呈现增加趋势ꎬ且都在
７０ ｇ / ６６７ ｍ２试验田中达到最大ꎮ 产量较清水对照
组 ＣＫ１ 增加了 ９.６３％ꎬ比施用 ５％井冈霉素水剂
２００ ｍＬ / ６６７ ｍ２实验田增加了 ２.９６％(表 ３)ꎮ
３　 讨论
　 　 本研究利用实施荧光定量 ＰＣＲ 技术ꎬ对喷施
生防菌粉红粘帚霉 ６７￣１可湿性孢子粉的水稻试验
田中的粉红粘帚霉和水稻纹枯病的数量进行追踪
检测ꎬ并调查田间病指计算防效ꎬ结合田间测产数
据ꎬ对粉红粘帚霉 ６７￣１ 田间防止水稻纹枯病的效
果进行评价ꎮ 结果表明ꎬ处理组中随着生防菌粉红
粘帚霉 ６７￣１ 的孢子制剂的喷施ꎬ稻田土壤中 ６７￣１
的数量逐渐增加ꎬ水稻纹枯病菌数量逐渐减少ꎮ 降
低的速度与 ６７￣１ 粉剂的喷施浓度有关ꎬ孢子浓度
越高抑菌效果越明显ꎮ ７０ ｇ / ６６７ ｍ２浓度的处理组
与未喷施生防菌的清水对照相比ꎬ喷施 ６７￣１ 孢子
粉的处理组病情指数显著降低ꎬ 产量增加ꎮ
７０ ｇ / ６６７ ｍ２浓度的处理组与喷施井冈霉素对照相
比ꎬ病情指数和产量相差不大ꎮ 以上数据说明粉红
粘帚霉 ６７￣１ 可以有效降低水稻纹枯病菌数量ꎬ抑
制水稻纹枯病发生和流行ꎮ 其对水稻纹枯病的防
治效果与井冈霉素相差不大ꎮ
　 　 土壤中 ６７￣１的数量在第 ２２ ｄ 左右达到最大ꎬ
此后逐渐降低ꎮ 说明生防菌粉红粘帚霉 ６７￣１孢子
进入土壤中后ꎬ与土壤中的微生物群进行相互作
用ꎬ并逐渐适应环境ꎬ最终定植在土壤中ꎬ这个过程
大概需要 ２２ ｄꎮ 施用６７￣１后ꎬ水稻纹枯病菌 ＡＧ￣
１ＩＡ的数量不断减少ꎬ说明粉红粘帚霉 ６７￣１ 在实
验浓度可以快速的发挥防治作用ꎮ 因此在实际应
用中以 ２２ ｄ为一个周期ꎬ每隔 ２２ ｄ 就要补充一定
量的生防菌孢子ꎬ才能达到较好的防治效果ꎮ
　 　 对粉红粘帚霉 ６７￣１ 和水稻纹枯病菌 ＡＧ￣１ＩＡ
在同一日期的变化量进行相关性分析ꎬ结果发现处
理组粉红粘帚霉 ６７￣１ 的增加量与水稻纹枯病菌
ＡＧ￣１ＩＡ的降低量有线性相关关系ꎬ相关性系数
(ｒ)为 ０.７１２ꎬ并具有统计学意义(Ｐ<０.０１)ꎮ 以上
数据说明水稻纹枯病菌 ＡＧ￣１ＩＡ 的降低与粉红粘
帚霉６７￣１数量的增加有显著地相关性ꎬ即粉红粘帚
霉 ６７￣１可以用于抑制水稻纹枯病菌 ＡＧ￣１ＩＡ 的增
加ꎬ用于水稻纹枯病菌的防治ꎮ
　 　 本研究对获得的水稻纹枯病菌 ＡＧ￣１ＩＡ 和粉
红粘帚霉 ６７￣１的实时变化量与同时期调查获得的
防效进行相关性分析ꎬ结果发现防效与生防菌及病
原菌的变化量呈现线性相关关系ꎬ相关系数( ｒ)分
别为 ０.８６３和 ０.７７１ꎬ并具有统计学意义(Ｐ<０.０１)ꎮ
说明生防菌的增加量能够显著提高防效ꎬ同时病原
菌的降低量能够显著提高防效ꎮ 说明利用本研究
所采用的实时荧光定量 ＰＣＲ方法可以用于生物防
治的效果评价ꎮ
　 　 本研究建立的实时荧光定量 ＰＣＲ检测体系能
有效的检测土壤中粉红粘帚霉和水稻纹枯病菌的
消长情况ꎬ可以用于评价生物防治水稻纹枯病的效
果ꎮ 本实验所得数据对大田中粉红粘帚霉和水稻
纹枯病的互作影响的相关生态学研究提供了依据ꎬ
具有一定的应用前景ꎬ本实验还是通过测定生防菌
和病原菌数量的方式来检测两种菌的消长动态ꎬ这
种方法ꎬ更加迅速、准确、直观ꎬ为田间病害风险的
评估提供帮助ꎬ也为生防因子的防效评价提供了方
法依据ꎬ更为生物防治的推广提供了有效、合理的
参考模式ꎮ
　 　 粉红粘帚霉 ６７￣１ 在对照及未施用孢子之前ꎬ
就有一定量的扩增信号(表 １)ꎮ 原因可能是稻田
土壤本身含有 ６７￣１菌ꎬ或者 ＰＣＲ 扩增中出现非特
异性扩增ꎬ具体原因有待进一步查找ꎮ 但是ꎬ显著
性检验表明孢子浓度对土壤中 ６７￣１ 菌和 ＡＧ１￣ＩＡ
菌的变化有显著影响ꎬ并随时间推移各时间也呈现
显著变化ꎬ因此此扩增信号并不影响本实验的主要
结论ꎮ 由于实验条件限制ꎬ本实验为 １年时间段内
的检测结果ꎮ 要想更好的研究粉红粘帚霉 ６７￣１对
水稻纹枯病的生物防治效果ꎬ应该在此基础上进行
多年份的实验ꎮ 同时ꎬ本次田间实验结果表明随着
孢子粉浓度的增高ꎬ防效增加ꎬ产量相应增加ꎮ 由
于本次实验设置的最高孢子粉浓度 ７０ ｇ / ６６７ ｍ２为
最佳防治浓度ꎬ因此限制了更高浓度的孢子粉的防
治效果的检测ꎮ 更高浓度的孢子浓度的防治效果
如何应该进一步得到证明ꎮ
６２４
　
　 ４期 王淑芳ꎬ等:应用实时荧光定量技术评价粉红粘帚霉对水稻纹枯病的田间防治效果
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责任编辑:张宗英　 曾晓葳
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