全 文 ：农抗 702 对植物病原真菌的抑制效果及抑菌机理*
魏赛金1,2 摇 杜亚楠1 摇 倪国荣2 摇 张慧雯1 摇 涂国全1 摇 潘晓华2**
( 1江西农业大学生物科学与工程学院, 南昌 330045; 2江西农业大学作物生理生态与遗传育种教育部重点实验室 /江西省作
物生理生态与遗传育种重点实验室, 南昌 330045)
摘摇 要摇 为探索农抗 702 在植物病害生物防治中的实际应用价值及对病原真菌的作用机理,
采用生长速率法测定其抑菌谱,并以水稻纹枯病菌为研究对象,测定其作用下菌丝的电解质
渗漏、蛋白质、核酸、Mg2+、K+含量的变化,及其对细胞膜麦角甾醇生物合成和水稻纹枯病菌超
显微结构的影响.结果表明: 农抗 702 对供试 13 种病原真菌均有较强的抑制作用,其中对油
菜菌核病菌的作用最强,EC50为 0. 23 滋g·mL-1;农抗 702 作用水稻纹枯病菌菌体后相对电导
率增加 72. 2% ;蛋白质、核酸、Mg2+、K+等胞内物质均发生了不同程度的渗漏;细胞麦角甾醇含
量降低了 92. 0% ;细胞膜轮廓不清、破损;细胞器严重损伤,有空泡化.抑制麦角甾醇合成、造
成真菌细胞膜渗透增加是农抗 702 抑制真菌的主要机理.
关键词摇 农抗 702摇 抑制作用摇 水稻纹枯病菌
文章编号摇 1001-9332(2012)12-3435-06摇 中图分类号摇 Q935摇 文献标识码摇 A
Inhibition effect of Ag鄄antibiotic 702 on plant pathogenic fungi and related mechanisms. WEI
Sai鄄jin1,2, DU Ya鄄nan1, NI Guo鄄rong2, ZHANG Hui鄄wen1, TU Guo鄄quan1, PAN Xiao鄄hua2 ( 1Col鄄
lege of Bioscience and Bioengineering, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China;
2Ministry of Education Key Laboratory of Crop Physiology, Ecology and Genetic Breeding / Jiangxi
Province Key Laboratory of Crop Physiology, Ecology and Genetic Breeding, JAU, Nanchang
330045, China) . 鄄Chin. J. Appl. Ecol. ,2012,23(12): 3435-3440.
Abstract: To explore the practical application value and action mechanisms of Ag鄄antibiotic 702
against pathogenic fungi, the inhibition spectrum of Ag鄄antibiotic 702 was studied by measuring the
mycelium growth rate of pathogenic fungi, and the effects of Ag鄄antibiotic 702 on the membrane
permeability of Rhizoctonia solani, a typical pathogenic fungus, were investigated, with the varia鄄
tions of mycelium electrolyte leakage and protein, nucleic acid, and Mg2+ and K+ contents under the
action of Ag鄄antibiotic 702 determined, and the effects of Ag鄄antibiotic 702 on the cell membrane
ergosterol biosynthesis and ultramicrostructure observed. The results showed that the active products
of Ag鄄antibiotic 702 had stronger inhibition effect on 13 test pathogens, among which, Sclerotinia
sclerotiorum was most sensitive, with the EC50being 0. 23 滋g·mL-1 . As compared with the control,
the relative electric conductivity of R. solani treated with Ag鄄antibiotic 702 was increased by
72郾 2% , the contents of protein, nucleic acid, and Mg2+ and K+ leaked from the R. solani cells
were all increased, while the ergosterol content was decreased by 92. 0% . The cell membrane out鄄
line was not clear, organelles were badly damaged, and vacuole appeared. It was suggested that the
inhibition of ergosterol biosynthesis and the increase of membrane permeability could be the main
action mechanisms of Ag鄄antibiotic 702 against pathogenic fungi.
Key words: Ag鄄antibiotic 702; inhibition effect; Rhizoctonia solani.
*国家自然科学基金项目(30960011)、国家自然科学基金面上项目
(31071724 ) 和 江 西 省 自 然 科 学 基 金 项 目 ( 2009GZN0030,
2010GZN0037)资助.
**通讯作者. E鄄mail: xhuapan@ 163. com
2012鄄08鄄08 收稿,2012鄄10鄄08 接受.
摇 摇 由病原真菌引起的植物病害是农作物产量和品 质降低的主要原因之一.长期以来,防治植物真菌病
害主要采用化学杀菌剂,但持续大量使用化学杀菌
剂对环境造成了严重污染[1] .因此,从 20 世纪 80 年
代开始,人们开始寻找天然抗菌剂和微生物代谢产
物来代替传统的化学农药. 微生物源农用抗生素具
应 用 生 态 学 报摇 2012 年 12 月摇 第 23 卷摇 第 12 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇
Chinese Journal of Applied Ecology, Dec. 2012,23(12): 3435-3440
有环境兼容性好、持效期长、低毒、对人畜和天敌安
全等特点,已广泛应用于植物病害的防治,如井冈霉
素、春雷霉素[2] .其中,抗真菌抗生素是一类在使用
过程中极不容易产生抗药性的抗生素[3] . 因此,开
发高效低毒的抗真菌抗生素,对保护环境、提高农作
物产量和质量具有十分重要的意义[4] .
农用抗生素对病原真菌的作用机制主要分为 3
个方面:一是影响真菌细胞壁合成,造成菌丝顶端膨
大,不能生长而死亡,如尼可霉素、多氧霉素 D;二是
影响真菌细胞膜中甾醇合成及磷脂双分子层,损伤
细胞质膜,造成细胞内物质的泄漏,从而起到杀菌作
用,如灰黄霉素、纳他霉素;三是作用于真菌生物合
成,如杀稻瘟菌素鄄S 抑制菌丝蛋白质的合成,灰黄
霉素作用于核酸等大分子物质的合成[5] .
本实验室在以棉花枯萎病为靶标筛选农用抗生
素产生菌的过程中,从棉花土壤中分离筛选到了一
株链霉菌(编号为 702),鉴定为稠李链霉菌(Strepto鄄
myces padanus),其抗真菌组分为多烯大环内酯类抗
生素[6],并暂命名为农抗 702(Ag鄄antibiotic 702).
为明确该菌株在植物病害生物防治中的实用价
值,为后续生防制剂研发提供科学依据,本研究采用
菌丝生长速率法测定活性产物农抗 702 的抑菌谱,
并选用水稻生产中侵染地域广、对稻米产量和品质
影响大的水稻纹枯病菌[7]作为靶标病原真菌,参照
Latoud[8]的方法测定菌丝体细胞质膜通透性,采用
高效液相色谱法研究靶标菌的麦角甾醇含量[9],结
合透射电镜观察农抗 702 对水稻纹枯病菌细胞质膜
产生的破坏作用,以期明确农抗 702 对病原真菌的
作用机理.
1摇 材料与方法
1郾 1摇 供试材料
供试菌株:水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、
稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、小麦赤霉病菌(Fu鄄
sarium graminearum)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxys鄄
porum)、烟草赤星病菌(Alternaria alternate)、油菜菌
核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、紫荆炭疽病菌(Col鄄
letotrichum gloeosporioides)、交链孢病菌(Alternaria)、
车前草穗枯病菌(Fusicoccum sp. )、车前草菌核病菌
(Sclerotinia sclerotiorum)、辣椒根腐病菌 (Capsicum
fusarium)、富贵竹炭疽病菌(Colletotrichum gloeospo鄄
rioides)和葡萄炭疽病菌 ( Colletotrichum gloeospori鄄
oides).以上菌株均为本实验室保藏.
马铃薯培养基(PDA) [10]:用于病原真菌培养.
供试抗生素:农抗 702,参照文献[11]提取.
主要仪器和试剂:岛津 SPD鄄10A 高效液相色
谱;3200 原子吸收分光光度计;紫外分光光度计;电
导率仪;立日鄄7650 型透射电镜. 麦角甾醇标准品
(阿拉丁,纯度 98. 0% )和色谱甲醇等.
1郾 2摇 研究方法
1郾 2郾 1 农抗 702 对各种植物病原真菌的抑制作用摇
采用菌丝生长速率法[12],25 益培养 2 d,测量菌落
直径,计算菌丝生长抑制率.采用剂量对数—抑制率
概率值法求得毒力回归方程、有效中浓度(EC50).
1郾 2郾 2 水稻纹枯病菌细胞膜通透性测定摇 取对数生
长期的水稻纹枯病菌菌丝,超纯水冲洗后各取 0. 5 g
菌丝加入 5 mL 6 滋g·mL-1的农抗 702 溶液,分别作
用 15、30、60、90、150、210、250、300、400 和 500 min
后测定菌丝的相对渗透率,每个样品重复 3 次,电
导率测定方法及相对渗透率计算公式参照文献
[13].
1郾 2郾 3 水稻纹枯病菌蛋白质和核酸渗漏测定摇 称取
1 g对数生长期的菌丝体,加入 6 滋g·mL-1的农抗
702(用 0. 05 mol·L-1pH 6. 8 柠檬酸鄄磷酸盐缓冲液
配制),终体积 10 mL,以等量缓冲液为对照.于 0、2、
4、6、8、12 和 24 h 取样,离心去除菌体,检测胞外液
在 260 和 280 nm处吸光值[8] .每个样品重复 3 次.
1郾 2郾 4 水稻纹枯病菌 Mg2+、K+离子渗漏测定 摇 取 3
块直径为 10 mm 菌块,接种于 100 mL 马铃薯蔗糖
液体培养基中,25 益180 r·min-1振荡培养 16 h 至
延滞期后期,添加农抗 702 使其终浓度分别为 0、
1郾 0、1. 55、3. 0、4. 67 和 6 滋g·mL-1,继续培养 48 h.
发酵液经 4000 r·min-1离心后取上清液 1 mL,用火
焰原子吸收光谱法测定 Mg2+、K+吸光度,依据标准
曲线计算 Mg2+、K+浓度.
1郾 2郾 5 农抗 702 对水稻纹枯病菌麦角甾醇生物合成
的影响试验摇 分别称取 0、1. 55 滋g·mL-1农抗 702
处理的湿菌体 0. 5 g放入研钵中,加入 1. 25 mL PBS
缓冲液,研磨成匀浆,然后加入 3 mL 新鲜配制的皂
化剂,混匀后 80 益水浴皂化 60 min.用 12 mL 石油
醚提取,蒸馏水洗涤,醚层于 60 益水浴挥干[14],用
无水乙醇洗下后定容至 0郾 5 mL,待测,每处理 3 个
重复.配制浓度为 250、125、50、5 和 2. 5 滋g·mL-1的
麦角甾醇标准溶液,按预设条件测定,以色谱峰面积
为纵坐标、浓度为横坐标,得标准方程:y = 15807x+
77770( r=0. 9992),测定待测样品麦角甾醇的浓度,
并计算菌丝中麦角甾醇含量.
色谱柱为 Hypersil ODS,尺寸为 150 mm伊4. 6
6343 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
mm,填料 HYPERSILODS2,5 滋m;流动相为色谱纯
甲醇;紫外检测器检测波长 282 nm;柱温为室温;流
速为 0. 9 mL·min-1;进样量 50 滋L.
1郾 2郾 6 透射样品制备及观察[15] 摇 挑取少许 4. 67
滋g·mL-1农抗 702 处理的样品,以未经药物处理的
水稻纹枯病菌菌丝作为对照,置于离心管中,2. 5%
戊二醛 4 益下预固定,1. 0%的饿酸固定,乙醇脱水,
透射电镜样品经漂洗、固定、乙醇脱水、纯丙酮处理,
包埋剂梯度渗透后分装包埋,70 益加热过夜,超薄
切片,经醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色,上镜观察.
1郾 3摇 数据处理
采用 Excel 2007 进行数据统计,利用 DPS 7. 05
软件进行数据的方差分析及 Duncan 氏新复极差法
检验(琢=0. 05).
2摇 结果与分析
2郾 1摇 农抗 702 对植物病原真菌的抑制作用
表 1 表明,农抗 702 的抑菌谱较广,对水稻纹枯
病菌、车前草穗枯病菌等 13 种病原真菌均有较强的
抑制作用.其中对油菜菌核病菌、葡萄炭疽病菌菌丝
生长抑制作用最强, EC50 分别为 0. 23 和 0. 27
滋g·mL-1;对交链孢病菌和辣椒根腐病菌的抑制效
果相对较弱,EC50分别为 4. 13 和 3. 40 滋g·mL-1 .
2郾 2摇 农抗 702 对水稻纹枯病菌细胞膜通透性的影
响
由图 1可知,农抗 702 处理 60 min 后,处理组菌
体浸出液相对渗透率为15郾 5% ,较对照高72郾 2% .
图 1摇 农抗 702 处理下水稻纹枯病菌的细胞膜相对通透率
Fig. 1摇 Membrane relative permeability of Rhizoctonia solani un鄄
der Ag鄄antibiotic 702 treatment.
玉:对照 Control (CK); 域:处理 Treatment. 下同 The same below.
随着作用时间的延长,对照组和处理组菌体的相对
渗透率均逐渐升高,且处理组的相对渗透率始终明
显高于对照.表明农抗 702 与水稻纹枯病菌的相互
作用在 60 min左右对细胞膜造成了损伤.说明农抗
702 对水稻纹枯病菌的作用靶位点可能在细胞
膜上.
2郾 3摇 水稻纹枯病菌蛋白质和核酸的渗漏
由图 2 可知,随着农抗 702 作用时间的延长,病
菌胞外液中核酸和蛋白质的含量比对照明显增加,
12 h后含量变化逐渐平缓.作用 24 h 时,处理组的
核酸和蛋白质含量较对照组分别增高 58郾 6% 和
81郾 2% .表明经农抗 702 处理后水稻纹枯病菌细胞
膜的通透性发生了改变,导致大量核酸和蛋白质的
外渗.这一结果进一步证明,农抗 702 对水稻纹枯病
菌的靶位点在细胞膜上.
表 1摇 13 种植物病原真菌对农抗 702 的敏感性
Table 1摇 Sensibility of thirteen plant pathogenic fungi to Ag鄄antibiotic 702
菌摇 种
Strain
毒力回归方程
Virulence regression equation
相关系数
Related coefficient
EC50
(滋g·mL-1)
水稻纹枯病菌 Rhizoctonia solani y=4. 93118+1. 3152x 0. 9947 1. 55
紫荆炭疽病菌 Colletotrichum gloeosporioides y=3. 99373+1. 98723x 0. 9907 3. 21
交链孢病菌 Alternaria y=3. 93546+1. 72748x 0. 9966 4. 13
车前草穗枯病菌 Fusicoccum sp. y=5. 43575+0. 90602x 0. 9950 0. 33
车前草菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum y=4. 77841+2. 48878x 0. 9979 1. 23
小麦赤霉病菌 Fusarium graminearum y=4. 73849+1. 7781x 0. 9915 1. 40
辣椒根腐病菌 Capsicum fusarium y=4. 13447+1. 62940x 0. 9966 3. 40
富贵竹炭疽病菌 Colletotrichum gloeosporioides y=4. 40158+2. 50977x 0. 9980 1. 73
烟草赤星病菌 Alternaria alternate y=5. 05771+1. 13313x 0. 9914 0. 89
稻瘟病菌 Magnaporthe oryzae y=4. 09833+1. 83801x 0. 9877 3. 09
油菜菌核病菌 Sclerotinia sclerotiorum y=5. 88404+1. 37024x 0. 9990 0. 23
棉花枯萎病菌 Fusarium oxysporum y=4. 54312+2. 46578x 0. 9967 1. 53
葡萄炭疽病菌 Colletotrichum gloeosporioides y=5. 70924+1. 23171x 0. 9944 0. 27
734312 期摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 魏赛金等: 农抗 702 对植物病原真菌的抑制效果及抑菌机理摇 摇 摇 摇 摇
图 2摇 农抗 702 对水稻纹枯病菌菌丝核酸和蛋白质渗漏的
影响
Fig. 2摇 Effect of Ag鄄antibiotic 702 on nucleic acid and protein
leakage of Rhizoctonia solani.
2郾 4摇 农抗 702 对水稻纹枯病菌胞内 Mg2+、K+渗漏
的影响
图 3 表明,随着农抗 702 浓度的升高,水稻纹枯
病菌细胞 Mg2+、K+渗漏呈上升趋势. 说明农抗 702
对水稻纹枯病菌细胞膜确实造成了损伤,从而导致
细胞膜渗透性发生改变,这一现象与水稻纹枯病菌
胞内蛋白质、核酸的渗漏基本一致.
2郾 5摇 农抗 702 处理对水稻纹枯病菌结构的影响
与对照组相比,病菌经 4. 67 滋g·mL-1农抗 702
处理后细胞结构发生了显著变化,细胞膜轮廓不清、
破损;细胞器严重损伤,有空泡化,细胞内物质密度
显著降低(图4) . 这一结果进一步证明农抗702处
图 3摇 不同浓度农抗 702 对水稻纹枯病菌胞内 K+、Mg2+渗露
的影响
Fig. 3摇 Effect of Ag鄄antibiotic 702 with different concentrations
on K+, Mg2+ leakage of Rhizoctonia solani.
图 4摇 透射电镜下的水稻纹枯病菌结构
Fig. 4摇 Structure of Rhizoctonia solani under TEM.
A:正常菌丝 Normal hyphae(20000 伊); B:处理菌丝 Treated hyphae
(25000伊).
理导致病菌细胞膜受损.
2郾 6摇 农抗 702 对水稻纹枯病菌麦角甾醇生物合成
的影响
麦角甾醇是真菌细胞膜的重要组成成分,在保
持质膜的流动性和稳定膜分子的结构中起重要作
用.测定结果表明(图 5),对照组菌株麦角甾醇的质
量分数为(1. 25依0. 07) mg·g-1,而 1. 55 滋g·mL-1
农抗702处理菌株麦角甾醇的质量分数为(0 . 10依
图 5摇 标准品及不同处理水稻纹枯病菌麦角甾醇在 282 nm处的吸收图谱
Fig. 5摇 Chromatogram of ergosterol in mycelium with different treated condition at UV 282 nm
a) 125 滋g·mL-1麦角固醇标准品 125 滋g·mL-1 ergosterol standard; b)对照 Control (CK); c) 1. 55 滋g·mL-1农抗 702 1. 55 滋g·mL-1 Ag鄄anti鄄
biotic 702.
8343 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷
0. 05) mg·g-1,较对照组下降了 92. 0% .表明农抗
702 处理靶标菌严重影响了其麦角甾醇的合成,导
致细胞膜成份变化,从而影响了细胞膜的通透性.
3摇 讨摇 摇 论
据报道,目前在已发现的抑制植物病原真菌的
放线菌中抑菌谱较广的仅有 6 种[16] .本试验供试的
13 种植物病原真菌中,水稻纹枯病菌、车前草菌核
病菌和油菜菌核病菌属于非产孢丝状真菌,其侵染
宿主主要依赖后期形成的菌核;稻瘟病菌等 10 种属
于产孢丝状真菌,其主要依靠病菌产生的分生孢子
传播.试验结果表明,链霉菌 702 所产活性物质农抗
702 对上述两种类型的植物病原真菌均有较好的抑
制作用,但总体而言,农抗 702 对产孢丝状真菌的有
效浓度高于非产孢丝状真菌,这一结果与陈丽
等[17]、苟丽霞等[1]的研究不一致,原因可能是不同
活性物质对产孢病菌真菌和非产孢病原真菌作用效
果和机制不同.总之,农抗 702 具有较广的抑菌谱,
在农业生产上有很好的开发应用潜力.
微生物细胞膜是许多抗生素的作用位点,而麦
角甾醇是真菌细胞膜的重要组成成分,与磷脂、蛋白
质等共同组成了一个有机的整体,在保持质膜的流
动性和稳定膜分子的结构中起重要作用,是杀菌剂
对真菌作用机理的研究热点. 有学者发现,低浓度
(1伊10-6 mol·L-1)多烯类抗生素即可引起菌群萎
缩、细胞内代谢物质外漏及干质量迅速减轻.多烯类
抗生素可导致酵母菌 K+ 和 NH4 + 的丢失[18],而
Mg2+、K+是维持细胞渗透压平衡的重要盐类物质,
若 Mg2+、K+大量渗漏到细胞外,则表明细胞膜受到
了损伤[19] .罗曼等[20]研究表明,柠檬醛可破坏黄曲
霉细胞质膜的通透性,降低电导率和对周围营养成
份的吸收速率. 制霉菌素 ( nystatin)、两性霉素 B
(amphotericin B)等能选择性地和真菌细胞膜中的
麦角甾醇结合,在细胞膜上形成许多微孔,改变膜的
渗透性,导致细胞内重要物质如 K+、核苷酸和氨基
酸等外漏,从而影响细胞的正常代谢,达到抑菌或杀
菌的作用[21-22] .高伟等[23]研究表明,BMME鄄1 可干
扰茄链格孢菌(Alternaria solani)细胞膜内麦角甾醇
的合成从而改变细胞的通透性.
本研究表明,农抗 702 处理水稻纹枯病菌后浸
出液的相对渗透率、核酸、蛋白质明显提高,培养液
中的 Mg2+、K+渗漏量加大,表明菌体细胞膜受到了
损害,电解质渗漏到了胞外液中.同时,农抗 702 处
理明显降低了菌体麦角甾醇的含量,表明农抗 702
可能以某种方式与麦角甾醇发生作用,导致细胞膜
受损、通透性增加.这些研究结果对农抗 702 的合理
应用具有理论价值.
目前抗生素作用机制研究技术有生物测定、形
态学观察、生理生化测定等[24],随着生物技术的快
速发展,生物信息学、分子生物学、代谢组学、蛋白组
学等技术手段也被广泛应用[25] .本研究还只停留在
核酸、蛋白质、麦角甾醇等生化测试和超显微观察
上,关于该活性物质具体作用的代谢途径、信号通路
及作用靶点等还有待于进一步研究.
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作者简介 摇 魏赛金,女,1969 年生,博士研究生,副教授. 主
要从事农业生物技术研究,发表论文 23 篇. E鄄mail: weisaijin
@ 126. com
责任编辑摇 肖摇 红
0443 应摇 用摇 生摇 态摇 学摇 报摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 摇 23 卷