全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 42(4): 425-430(2012)
收稿日期: 2011-03-15; 修回日期: 2011-12-25
基金项目: 海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室项目(2010hckled-08); 海南省自然科学基金项目(311028);
海南大学青年基金项目(qnjj1157); 海南大学 2010 年本科生创新科研课题(HDCX2010014)
通讯作者: 骆焱平,博士,副教授,主要从事生物农药研究; E-mail:yanpluo@yahoo. com. cn
第一作者: 王兰英(1976 - ),女,山东郓城人,讲师,硕士,主要从事生物防治研究; E-mail:daivemuwly@126. com。
水稻纹枯病生防内生菌糖蜜草固氮螺菌的分离与鉴定
王兰英, 谢 颖, 廖凤仙, 王 琼, 骆焱平*
(海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室,海南大学环境与植物保护学院, 海口 570228)
摘要:本文首先对砂仁内生细菌进行分离,以水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)为靶标菌对获得菌株进行离体拮抗活性、盆
栽及田间试验测定。 结果表明:获得的 27 株内生细菌中有 4 株具有较好的离体抑菌活性,其中 SRJ2-4 抑菌效果最好,抑菌
带达到 18 mm;SRJ2-4 的盆栽防效及田间防效分别为 80. 7%与 79. 4% ,与其它菌株相比达极显著水平。 SRJ2-4 处理的亩
产量为 488. 79 kg,高于其他药剂处理。 对该菌株形态、生理生化及 16S rDNA序列进行分析,将该内生菌鉴定为糖蜜草固
氮螺菌(Azospirillum melinis)。
关键词:砂仁; 内生细菌; 水稻纹枯病菌; 糖蜜草固氮螺菌
Isolation and identification of an endophytic bacteria Azospirillum melinis against
Rhizoctonia solani 　 WANG Lan-ying, XIE Ying, LIAO Feng-xian, WANG Qiong, LUO Yan-ping
(Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources, Ministry of Education,
College of Environment and Plant Protection, Hainan University, Haikou 570228, China)
Abstract: Twenty-seven endophytic bacterial strains isolated from Fructus amomi were tested for in vitro
antagonistic activity, pot experiment and field trial against the rice sheath blight pathogen, Rhizoctonia solani.
The results revealed that 4 of the 27 isolates showed good anti-fungal activity against Rhizoctonia solani, of
which SRJ2-4 exhibited the best effect with an inhibition zone up to 18 mm in diameter. The control efficacy
of SRJ2-4 strain in pot experiment and field trial were 80. 7% and 79. 4% respectively, significantly higher
than those of other isolates. The yield of the field treated with SRJ2-4 was also found to be the highest, up to
488. 79 kg·667 m -2 . According to the morphological analysis, physiological and biochemical determination
and 16S rDNA sequence comparison, the strain SRJ2-4 was identified as Azospirillum melinis.
Key words: Fructus amomi; endophytic bacteria; Rhizoctonia solani; Azospirillum melinis
中图分类号: S476　 　 　 　 　 文献标识码: A　 　 　 　 　 文章编号: 0412-0914(2012)04-0425-06
　 　 水稻纹枯病(Rhizoctonia solani)又称“花秆”、
“烂脚病”、“富贵病”,分布于亚洲、非洲和美洲等稻
区,在我国华南及长江流域地区发生严重。 植株发
病后叶片枯死,结实率下降,一般减产 10% ~ 30% ,
严重时达到 50%以上。 防治该病以苯来特、稻瘟
净、多菌灵、克瘟散等为主[1],我国主要采用井岗霉
素进行防治[2]。 近年来由于井岗霉素大面积长期使
用,防效日趋降低[3,4],国内外主要水稻区普遍开展
了水稻纹枯病的生防研究工作。 为了寻找和发现高
活性的拮抗内生细菌,Yang等[5]从水稻植株中获得
一株对水稻纹枯病防效较为理想的内生细菌
MR12,鉴定为阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae);
Jiao[6]从 222个水稻样品中获得了 375株内生细菌,
并筛选出对水稻纹枯病有拮抗作用的菌株 69 株,最
终得到一株对水稻纹枯病盆栽防效理想的巨大芽孢
杆菌(Bacillus megaterium),防治效果可达 70%以
　
植物病理学报 42 卷
上。 为了扩大内生细菌的获得范围,本文从四大南
药之一———砂仁(Fructus amomi)中分离、筛选内
生细菌,对获得菌株进行水稻纹枯病离体拮抗活性
及盆栽防效、田间试验测定,对防治理想菌株进行
分类地位确定,为新型微生物生防制剂的研发提供
依据,为水稻纹枯病的生防工作推进奠定基础。
1　 材料与方法
1. 1　 供试材料
1. 1. 1　 供试材料及药剂　 砂仁(Fructus amomi):
采自中国热带农业科学院南药圃;水稻:博 II 优 15
号,海南大学农学院提供;20%井冈霉素可湿性粉
剂:江苏润鸿生物化学有限公司。
1. 1. 2　 供试靶标菌株 　 水稻纹枯病菌(Rhizocto-
nia solani Kühn)由海南大学环境与植物保护学院
提供。
1. 2　 方法
1. 2. 1　 内生菌的分离培养及纯化　 采集新鲜砂仁
的根、茎、叶,用自来水冲洗干净,室内晾干,进行常
规组织表面消毒:在 75% 酒精中浸泡 3 ~ 8 min
(根、茎 8 min,叶 3 min),无菌水冲洗 3 ~ 4 次,随
后用 0. 1%升汞浸泡 2 ~ 3 min,无菌水冲洗 5 次。
将消毒好的植物组织(根、茎去除表皮)无菌条件
下切碎,于无菌研钵中研磨至浆液,稀释 10 倍,取
少量涂抹于牛肉膏蛋白胨培养基上,28℃培养 2 d。
以压组织块法及最后一次表面消毒的无菌水涂抹
法检验外植体表面消毒是否彻底[7]。 采用划线法
纯化菌株,所得菌株斜面保存,备用。
1. 2. 2　 生防内生细菌的筛选　 采用对峙划线法对
分离到的内生细菌进行离体拮抗活性筛选:挑取直
径为 5 mm 水稻纹枯菌菌饼接种于 PDA 平板中
央,然后用接种环挑取少量内生细菌在距离菌饼 2
cm处左、右各划一条菌线,以不接内生菌为对照。
每处理 3 次重复,28℃培养 4 d,统计抑菌带大小。
挑取明显受抑制的靶标菌基内菌丝于 40 倍电子显
微镜下观察菌丝生长情况,对离体拮抗效果理想的
菌株进行盆栽及田间试验测定。
拮抗菌株盆栽防治试验:按要求配制菌株发酵
液[8],接入拮抗菌株,28℃、180 r·min -1振荡培养
3 d,备用。 育无病水稻苗,待水稻生长至 20 d 时,
移栽到无菌的花盆中,每盆 3 丛,每丛 10 株,每一
处理 6 盆。 在水稻分蘖盛期,将培养好的水稻纹枯
病菌秸秆取几根夹在每丛植株间,第 2 d 喷浓度为
108 cfu·mL -1各拮抗菌株发酵液,每丛 20 mL 菌
液,设无菌水(CK1)为空白对照,20% 井冈霉素
WP(CK2)为药剂对照。 10 d 后统计病情指数及
防效。
拮抗菌株田间防效试验:试验田选在海南省儋
州市那大镇沙田村进行。 各拮抗细菌接于发酵培
养液中 28℃ 振荡培养 48 h 后,配成浓度约为
108 cfu·mL -1的菌液,备用。 水稻种子于发酵液
中浸种 48 h,催芽 2 d,播于育秧田,25 d 左右移栽
于田间,处理和对照均设 3 个重复,共计 18 个小
区,每个小区 3 m2,小区随机排列,小区间以保护
行隔离,试验田按常规管理。 分蘖盛期参照 Chen
等[9]方法接种水稻纹枯病菌,随后进行第一次喷
施 108 cfu·mL -1的拮抗菌菌液,隔 15 d 第二次喷
施,设清水(CK1)为空白对照,20%井冈霉素 WP
(CK2)为药剂对照。 距收获期 20 d 随机抽取 50
株按下列分级标准统计病情指数及田间防治效果,
收获期统计亩产量。
病害分级标准[10]:0 级:全株无病;1 级:第四
叶及其以下各叶鞘、叶片发病(以顶叶为第一片
叶);3 级:第三叶片及其以下各叶鞘、叶片发病;5
级:第二叶片及其以下各叶鞘、叶片发病;7 级:剑
叶叶片及其以下各叶鞘、叶片发病;9 级:全株发
病,提早枯死。
1. 2. 3 　 内生细菌鉴定 　 按照常规细菌学方
法[11,12]进行菌落培养特征、菌株形态学观察、革兰
氏染色、芽孢染色及生理生化鉴定。 参照 Xie
等[13]方法测定 16S rDNA 序列,用 BLAST 软件分
析所测得的 16S rDNA序列,并与 GenBank中已知
的序列进行最高同源性比较,通过 Treeview 软件
构建系统进化树[14]。
2　 结果与分析
2. 1　 砂仁内生细菌分离结果
采用严格的组织表面消毒法,对砂仁的根、茎、
叶进行了内生细菌的分离,经过 2 d 的培养,在未
发现对照组有菌落长出的情况下,共获得 27 株内
生细菌。 其中从茎部分离得到 14 株,从叶部分离
得到 13 株,从根部未检测到菌株。
624
　
　 4 期 　 　 王兰英,等:水稻纹枯病生防内生菌糖蜜草固氮螺菌的分离与鉴定
2. 2　 生防内生细菌筛选结果
2. 2. 1　 离体活性测定结果及靶标菌基内菌丝观察
将分离得到的内生细菌与靶标菌经对峙划线培养
4 d后,发现菌株 SRJ2-3、SRJ2-4、SRJ2-5 及 SRY2-
5 对供试靶标菌有较好的抑菌效果,抑菌带超过 15
mm,其中从茎部分离的 SRJ2-4 抑菌效果最为理
想,抑菌带达到 18 mm,靶标菌菌落几乎没有扩延。
挑取靶标菌对照基内菌丝及对峙培养的基内菌丝
观察发现:对照菌丝褐色,粗壮,原生质均匀,能明
显看到菌丝内隔膜;SRJ2-3、SRJ2-5 及 SRY2-5 对
峙培养的菌丝相似,均可见细胞质明显浓缩,菌丝
变细,透明,畸形,中空菌丝较多,菌丝内隔膜不清
晰,其中 SRY2-5 中空菌丝最多,扭曲畸形最严重;
SRJ2-4 对峙培养的菌丝与前述情况有所不同,可
以明显看到菌丝变细,轮廓不清晰,断裂较多,细胞
壁不完整。
2. 2. 2　 拮抗菌株对水稻纹枯病防效及产量影响
测定了活性较好的 SRJ2-3、 SRJ2-4、 SRJ2-5 及
SRY2-5 菌株的盆栽及田间防治效果,并统计最终
亩产量(表 1)。
　 　 由表 1 可知,在盆栽试验和田间小区试验中,
供试 4 种菌株对水稻纹枯病均有一定的防治效果,
其中内生菌 SRJ2-4 效果最好,盆栽及田间防效分
别达到 80. 7%与 79. 4% ,优于对照药剂;内生菌
SRJ2-3、SRJ2-5、SRY2-5 的盆栽及田间防效低于
50% ,防效稍差于对照药剂。 比较不同处理亩产量
发现,菌株 SRJ2-4 处理亩产量最高,达 488. 79 kg,
明显高于药剂对照与空白对照,比空白对照增产
12. 2% ;其他菌株处理亩产量也明显高于空白对
照,与药剂对照差异不显著,由此可见所有菌株处
理均能在防治水稻纹枯病的基础上增加亩产量。
2. 3　 内生细菌 SRJ2-4 的鉴定
2. 3. 1　 SRJ2-4 的菌落形态　 将菌株 SRJ2-4 置于
牛肉膏蛋白胨培养基上培养 24 h,发现菌株 SRJ2-
4 的菌落为乳白色,扁平较大,表面光滑,边缘整
齐,随培养时间延长,边缘逐渐皱缩,后期菌落呈淡
红色。
2. 3. 2　 SRJ2-4 菌株的染色　 将菌株 SRJ2-4 培养
18 ~ 20 h,随后进行革兰氏染色、芽孢染色及鞭毛
染色。 发现该菌为革兰氏阴性菌、杆状、无芽孢、周
生鞭毛(图 1)。
2. 3. 3　 SRJ2-4 的生理生化特征　 参照《伯杰细菌
鉴定手册》方法对菌株进行部分生理生化测定(表
2)。 由表 2 可知,该菌株属好氧型,含有呼吸酶;
淀粉水解阳性,能把培养基中淀粉水解为无色糊精
等小分子;在石蕊牛奶中生长旺盛,使指示剂褪色;
能利用柠檬酸盐作为唯一碳源,将柠檬酸分解为二
氧化碳;不能将苯丙氨酸氧化脱氨形成苯丙酮酸;
不能分解培养基中含硫氨基酸生成硫化氢;能产生
蛋白酶使明胶液化;不能水解蔗糖形成果聚糖;含
有过氧化氢酶,可以将过氧化氢分解成水和氧;能
够发酵葡萄糖、麦芽糖、半乳糖以及肌醇产酸,均不
产生气体;可以在阿拉伯糖、麦芽糖、D-果糖、蔗
糖、葡萄糖、甘油、甘露醇、肌醇等作为唯一碳源的
培养基上生长;菌株在浓度 2% ~ 3%的 NaCl 中生
长良好,在浓度为 5% ~ 10% 的 NaCl 中生长受
抑制。
Table 1　 Effect of antagonistic endophytic bacteria on rice sheath blight control and yield of rice
Treat
Potted plant test Field test
Disease
index
Control
effect / %
Disease
index
Control
effect / %
Yield
kg·667 m -2
Yield
increase / %
CK1 68. 5 - 78. 6 - 435. 6 C -
CK2 32. 7 52. 2 B 48. 8 37. 9 B 468. 23 B 7. 5 C
SRJ2-3 38. 9 43. 2 B 52. 3 33. 5 B 466. 78 B 7. 2 C
SRJ2-4 13. 2 80. 7A 16. 2 79. 4 A 488. 79 A 12. 2 A
SRJ2-5 36. 6 46. 6 B 51. 7 34. 2 B 467. 65 B 7. 4 C
SRY2-5 39. 2 42. 8 B 49. 4 37. 1 B 470. 54 B 8. 0 B
CK1:Blank control; CK2:20% validamycin WP. Data followed by different letters are significantly different at 0. 01
level.
724
　
植物病理学报 42 卷
Fig. 1　 Stain of endophytic bacteria SRJ2-4
Table 2　 Biochemical characters of endophytic bacteria SRJ2-4
Item tested Result Item tested Result
Catalase + Inositol fermentation Produce sour no spirit
Oxidase + Sucrose utilization +
Amylum hydrolyze + Galactose utilization +
Citrate utilization + Glucose utilization +
Litmus milk reaction + Maltose utilization +
Phenylalanine deaminas - Glycerin utilization +
H2S formation - Arabitol utilization +
Glutin liquefaction + D-fructose utilization +
Fructan formation - Mannitol utilization +
Aerobism + Inositol utilization +
Maltose fermentation Produce sour no spirit Growth at 2% -3% NaCl +
Glucose fermentation Produce sour no spirit Growth at 5% -10% NaCl + -
Galactose fermentation Produce sour no spirit
“ + ”:Positive;“ - ”:Negative; “ + - ”:Weaker.
2. 3. 4 　 菌株 16S rDNA 序列分析 　 测得菌株
SRJ2-4 的 16S rDNA碱基序列全长 1 478 bp,将此
序 列 在 GenBank 中 注 册, 获 得 注 册 号 为
HQ407480。 运用在线 Blast软件进行同源性分析,
发现与 SRJ2-4 同源性较高的多数为固氮螺菌属菌
株。 选取其中 7 株同源性 97%以上的菌株构建系
统发育树(图 2)。
　 　 图 2 中显示,菌株 SRJ2-4 与糖蜜草固氮螺菌
(A. melinis)在进化树的同一支上,两菌株同源性
最高,达 98% 。 结合菌株革兰氏阴性,无芽孢,鞭
毛周生,能利用阿拉伯糖、麦芽糖、D-果糖、蔗糖、
葡萄糖、甘油、甘露醇、肌醇等作为唯一碳源,在浓
度 2% ~ 3%的 NaCl 中生长良好,在 NaCl 浓度为
5% ~ 10%时生长受抑制等特征与 Peng 等[15]报道
糖蜜草固氮螺菌生理生化特征基本一致,确定该菌
株为糖蜜草固氮螺菌。
824
　
　 4 期 　 　 王兰英,等:水稻纹枯病生防内生菌糖蜜草固氮螺菌的分离与鉴定
Fig. 2　 Phylogenetic tree based on the 16S rDNA sequence of SRJ2-4
3　 讨论
本研究对南药植物砂仁进行内生细菌分离,通
过离体拮抗活性测定、盆栽及田间防效试验筛选出
一株对水稻纹枯病防效理想的菌株 SRJ2-4,经鉴
定该菌株为糖蜜草固氮螺菌 (Azospirillum meli-
nis)。 有研究表明糖蜜草固氮螺菌具有高固氮酶
活性,可促进糖蜜草及禾本科作物生长[16],菌株
SRJ2-4 田间防效突出,可能是由于菌株提高了水
稻植株的固氮能力,促进植株生长,从而达到防病
增产的功效。 而过去文献报道水稻纹枯病菌生防
细菌多为芽孢杆菌属的菌株[17],但关于该属菌株
对水稻纹枯病的防治作用未见报道,因此进一步探
讨菌株在水稻纹枯病防治领域其他农用活性具有
重要意义。
生物因子防治植物病害所涉及的因素诸多,如
内生菌对外界环境适应能力强弱、试验获得菌株分
泌抑菌物质多少以及生防菌与靶标菌施加顺序等
因素都会直接影响获得菌株盆栽及田间防治效
果[18 ~ 20],本试验结果显示内生菌 SRJ2-3、SRJ2-5、
SRY2-5 离体抑菌活性突出,但盆栽及田间防治效
果不理想,可以考虑提前施加生防菌株,为菌株在
植株上定殖争取有效的时间,以便提高防效。 另外
试验结果显示田间小区防效均比盆栽有所降低,农
田生态系统中环境因素是重要影响因素之一,如果
将该菌株制成活体微生物制剂,生防效果会更为持
久稳定,因此有必要开展高活性菌株发酵配方、菌
株最适生长条件以及菌株活体制剂等产业化生产
关键技术研究。
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责任编辑:李晖
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