全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA摇 41(4): 393鄄398(2011)
收稿日期: 2010鄄07鄄12; 修回日期: 2011鄄04鄄16
基金项目: 国家自然科学基金资助项目(30860162); 国家科技部国际合作与交流专项(2008DFA30560)
通讯作者: 黄家风,教授,主要从事植物病毒学研究; Tel: 0993鄄2327489, E鄄mail: hjf@shzu. edu. cn
第一作者: 都业娟 (1973 - ),女,山东烟台人,讲师,博士研究生,主要从事植物病毒学研究; E鄄mail: dyj_agr@shzu. edu. cn。
侵染新疆加工番茄的中国番茄黄化曲叶病毒
DNA鄄A的基因组特征
都业娟1, 许文博2, 向本春1, 黄家风1*
( 1石河子大学绿洲农作物病害防控重点实验室, 新疆石河子 832003; 2大连市农业科学研究院, 大连 116036)
摘要: 从新疆加工番茄上分离到病毒分离物 XJ26鄄4,对其基因组 DNA鄄A全序列测定表明,XJ26鄄4 DNA鄄A全长 2 737 个核
苷酸(GenBank登录号:FN985163),具有典型的双生病毒基因组特征。 进一步序列比较发现,XJ26鄄4 DNA鄄A 与中国番茄
黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl China virus, TYLCCNV)各分离物的同源性最高,达到 91. 2% ~ 99. 5% ,而与其他双
生病毒的序列相似性均在 79. 5%以下,表明 XJ26鄄4 是 TYLCCNV 的一个分离物。 这是首次明确新疆加工番茄受到粉虱
传双生病毒的侵染。
关键词: 加工番茄; 中国番茄黄化曲叶病毒; 菜豆金色花叶病毒属; DNA鄄A
Genomic characterization of Tomato yellow leaf curl China virus infecting pro鄄
cessing tomato in Xinjiang摇 DU Ye鄄juan1, XU Wen鄄bo2, XIANG Ben鄄chun1, HUANG Jia鄄feng
( 1Key Laboratory of the Prevention and Control for Oasis Crop Disease of Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832003,China;
2Dalian Academy of Agricultural Science, Dalian 116036, China)
Abstract: The virus isolate XJ26鄄4 was collected from the leaves of processing tomato showing yellow mo鄄
saic symptom in Xinjiang. The complete nucleotide sequence of DNA鄄A was determined, it comprised 2 737
nucleotides and had typical genomic organization of begomoviruses. Sequence comparison showed that DNA鄄A
of XJ26鄄4 had the highest sequence identities (91. 2% -99. 5% ) with that of Tomato yellow leaf curl China
virus ( TYLCCNV ) isolates, while less than 79. 5% identities were found when compared with other bego鄄
moviruses isolated in Asian and Africa. It was concluded that isolate XJ26鄄4 infecting processing tomato was
one of TYLCCNV isolates. This is the first report of whitefly鄄transmitted geminviruses in Xinjiang.
Key words: processing tomato; Tomato yellow leaf curl China virus; Begomovirus; DNA鄄A
中图分类号: S432. 41摇 摇 摇 摇 摇 文献标识码: A摇 摇 摇 摇 摇 文章编号: 0412鄄0914(2011)04鄄0393鄄06
摇 摇 双生病毒科(Geminiviridae)病毒是一类具有
孪生颗粒形态的单链环状 DNA 植物病毒。 根据
传播介体、寄主范围和基因组结构可将双生病毒分
成 4 个属,其中具有经济重要性的病毒大多属于菜
豆金色花叶病毒属(Begomovirus)。 该属病毒侵染
双子叶植物,在自然条件下由烟粉虱 ( Bemisia
tabaci)传播,因而也称粉虱传双生病毒(whitefly鄄
transmitted geminviruses,WTG) [ 1 ]。 WTG 在全球
范围内危害猖獗,对巴基斯坦、印度等我国周边国
家的棉花、番茄、辣椒等作物造成严重危害[2,3]。
我国自 1982 年报道双生病毒以来,云南、广西、广
东、福建和海南等南方省区的烟草、番茄、番木瓜、
南瓜和杂草上相继发现多种双生病毒,给农业生产
造成极大损失[4 ~ 8]。 大多数 begomoviruses 为双组
摇
植物病理学报 41 卷
分病毒,基因组含有 2 条大小均为 2. 5 ~ 3. 0 kb 的
DNA 分子,即 DNA鄄A 和 DNA鄄B。 少数 begomo鄄
viruses 为单组分病毒,基因组只含一条 DNA 分
子,即 DNA鄄A,大小约 2. 8 kb[9]。 近年研究发现,
有些单组分 begomoviruses伴随一种新型的卫星分
子———DNA茁分子[10]。
加工番茄在新疆有“红色产业冶之称,是新疆
农业的支柱产业之一,对新疆经济发展具有非常重
要的作用。 随着加工番茄种植面积的增加以及种
植年限的延长,加工番茄病毒病日益严重,造成一
般田块减产 10% ~ 30% ,严重的减产 50% 以
上[11]。 田间症状亦日趋复杂,除普通花叶、蕨叶、
病毒性坏死条斑外,黄色花叶是近年新出现的一种
症状类型,在北疆各加工番茄产区均有不同程度的
分布。 为了弄清其病毒种类及致病类型,对病区采
集的病样进行了分子鉴定,证明它是中国番茄黄化
曲叶病毒的一个分离物。
1摇 材料与方法
1. 1摇 毒源
病毒分离物 XJ26鄄4 来自新疆石河子加工番茄
品种里格 87鄄5,表现黄色花叶症状的植株。
1. 2摇 总 DNA提取
根据 Xie等 [ 12 ]报道的方法提取 XJ26鄄4 感染
的加工番茄总 DNA。
1. 3摇 PCR扩增、克隆并测序
根据双生病毒基因组间隔区及外壳蛋白保守
序列设计引物 PA 和 PB,扩增 DNA鄄A 部分区
域[1 2 ],克隆并测序;然后根据已测序列设计特异
引物 PYF 和 PYR,扩增近全长的 DNA鄄A。 PCR 反
应条件:94益 1 min,55益 1 min,72益 2 min 30 s,5
个循环;94益 45 s,60益 50 s,72益 2 min 30 s;30
个循环。 将 PCR 扩增产物克隆到载体 pMD18鄄T
vector(TaKaRa, Japan)上,选择 PCR 和酶切鉴定
均为阳性的克隆,委托上海生工生物工程技术服务
有限公司测序。 克隆及测序所用引物序列见表 1。
1. 4摇 序列分析
利用软件 DNAStar 5. 02 (DNASTAR Inc. ,
Madison,WI,USA)和 DNAMAN Version 5. 2. 2
(Lynnon Biosoft ,Quebec,Canada)进行序列分析。
多序列比较采用 DNAStar clustal W 方法,进化树
构建采用 DNAMAN 的邻近相连法(Neighbor鄄join鄄
ing)。 用于 DNA鄄A 序列比较和进化分析的病毒
见表 2。
2摇 结果与分析
2. 1摇 病毒分离物 XJ26鄄4 基因组 DNA鄄A 结构
利用双生病毒的简并引物 PA和 PB对表现黄
色花叶症状的加工番茄样品 XJ26鄄4(图 1)的基因
组进行 PCR,扩增到一条约 500 bp 的特异条带
(图 2),克隆并测序,得到 518 个核苷酸。 然后根
据所测序列设计引物 PYF 和 PYR,又扩增到一条
约2. 3 kb的特异条带(图 3),将其克隆并测序,测
序引物为 Y6F2 和 Y6R2。 将 2 次测序结果进行序
Table 1摇 Primers used for cloning and sequencing of DNA鄄A and DNA茁 of XJ26鄄4
Primer Sequence(5忆寅 3忆)* Position in XJ26鄄4 DNA鄄A / nt
PA TAATATTACCKGWKGVCCSC 2731鄄13
PB TGGACYTTRCAWGGBCCTTCACA 511鄄489
PYF CCCAAAGGGTTGTGAAGGG 479鄄496
PYR TGTCTGCGGGGACCACTTT 25鄄42
Y6F2 CCTTTAATTTGAACTGGYTTCCC 1709鄄1731
Y6R2 GGAARCCAGTTCAAATTAAAGGG 1709鄄1731
茁01 GTAGGTACCACTACGCTACGCAGC
茁02 AGTGGTACCTACCCTCCCAGGGGT
“*冶: B = C,T or G; K = G or T; R = A or G; S = C or G; V = A, C or G; W =A or T; Y = C or T.
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摇
摇 4 期 都业娟,等:侵染新疆加工番茄的中国番茄黄化曲叶病毒 DNA鄄A的基因组特征
Table 2摇 Begomoviruses used for sequence comparisons
Viruse
Name Abbreviation
GenBank
accession No.
Host Nation
Ageratum yellow vein China virus[G13] AYVCNV[G13] AJ558120 Lycopersicon esculentum China
Ageratum yellow vein Taiwan virus AYVTV AF307861 Ageratum conyzoides China: Taiwan
Chilli leaf curl virus[Multan] ChiLCuV[Mul] AF336806 Pepper Pakistan
Cotton leaf curl Alabad virus[804a] CLCuAV[804a] AJ002452 Cotton Pakistan
East Africancassava mosaic Zanzibar virus EACMV AJ516003 Cassava Kenya
Euphorbia leaf curl virus [G35] ELCV[G35] AJ558121 Euphorbia pulcherrima China
Malvastrum yellow vein virus [Y47] MYVV[Y47] AJ457824 Malvastrum China
Papaya leaf curl China virus [G2] PaLCuCNV[G2] AJ558123 Carica papaya China
Pepper leaf curl Bangladesh virus PepLCBV AF314531 Pepper Bangladesh
Soybean crinkle leaf virus [Japan] SbCLV[JP] AB050781 Soybean Japan
Squash leaf curl Yunnan virus SLCYV AJ420319 Squash China
Stachytarpheta leaf curl virus[Hn5] StaLCV[Hn5] AJ495814 Stachytarpheta jamaicensis China
Tobacco leaf curl Kochi virus [KK] TbLCKoV[KK] AB055009 Lycopersicon esculentum Japan
Tobacco leaf curl Yunnan virus [Y3] TbLCYNV[Y3] AF240674 Tobacco China
Tomato leaf curl China virus [G32] ToLCCNV[G32] AJ558118 Lycopersicon esculentum China
Tomato yellow leaf curl China virus[Dl198] TYLCCNV[Dl198] EU365686 Artemisia carvifolia Buch China
Tomato yellow leaf curl China virus[Y5] TYLCCNV[Y5] AJ319674 Tomato China
Tomato yellow leaf curl China virus[Y10] TYLCCNV[Y10] AJ319675 Tomato China
Tomato yellow leaf curl China virus [Y11] TYLCCNV[Y11] AJ319676 Tomato China
Tomato yellow leaf curl China virus [Y43] TYLCCNV[Y43] AJ781302 Tomato China
Tomato leaf curl Laos virus ToLCLV AF195782 Tomato Laos
Fig. 1摇 Yellow mosaic symptom on processing tomato plants
A: Infected plant; B: Infected leaves.
Fig. 2 摇 PCR amplification of DNA extracted
from XJ26鄄4 with primers PA / PB
M: DNA marker; 1, 2, 3: XJ26鄄4; 4: Negative control.
Fig. 3 摇 PCR amplification of DNA extracted
from XJ26鄄4 with primers PYF / PYR
M: DNA marker; 1:Negative control; 2: XJ26鄄4.
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摇
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列拼接,得到 XJ26鄄4 基因组 DNA鄄A 全长为 2 737
个核 苷 酸 ( nucleotide, nt ) ( EMBL 登 录 号:
FN985163)。 序列分析表明,XJ26鄄4 分离物具有典
型的双生病毒基因组特征:闭合环状的单链 DNA,
共编码 6 个开放阅读框架(ORF),分别是病毒链
上的 AV1 基因(位于 288 ~ 1 058 nt,编码 CP蛋白)
和 AV2 基因(位于 128 ~ 475 nt,编码参与病毒移动
的相关蛋白)及互补链上的 AC1 基因(位于 1 507
~ 2 592 nt,编码复制相关蛋白 Rep)、AC2 基因(位
于 1 200 ~ 1 604 nt,编码转录激活蛋白 TrAP)、AC3
基因(位于 1 055 ~ 1 459 nt,编码复制增强蛋白
Ren)和 AC4 基因(位于 2 142 ~ 2 435 nt,其编码的
蛋白参与病毒的复制或转录调控)。 在 AV2 和
AC1 之间(对应于核苷酸 2 593 ~ 127 nt)含有一个
长 272 nt的基因间隔区( Intergenic region,IR)。 IR
区含有双生病毒滚环复制和双向转录所需的各种
顺式元件:一个茎环结构,它包含一个与起始复制
有关的高度保守的 9 个核苷酸序列 TAATATT /
AC;一个可能参与转录调控的 TATA Box区(位于
茎环结构上游 76 ~ 79 nt 处,即 DNA鄄A的 2 652 ~
2 655 位核苷酸);2 个位于 TATA Box上游可能与
Rep蛋白结合有关的重复序列 GGTGTCT,分别位
于 2 606 ~ 2 612 nt与 2 634 ~ 2 640 nt。
2. 2摇 XJ26鄄4 DNA 鄄A 与其他双生病毒的同源性
比较
将 XJ26鄄4 DNA鄄A 全序列在 NCBI 上进行
BLAST 检索发现,它与中国番茄黄化曲叶病毒
(TYLCCNV)有很高的序列相似性,为 91. 2% ~
99. 5% ,其中与中国番茄黄化曲叶病毒 Y10 分离
物(TYLCCNV鄄Y10)的相似性最高,为 99. 5% 。
比较 XJ26鄄4 与 TYLCCNV鄄Y10 时发现,即使变异
最大的 IR 区,两者之间的同源性也高达 98. 9% ,
将各 ORF编码蛋白的氨基酸序列进行比较,相互
之间的同源性均达 97. 8% ~ 100% (表 3 )。
而XJ26鄄4DNA鄄A全序列与亚洲、非洲报道的其他粉
Table 3摇 Comparison of nucleotide and amino acid sequence identities of DNA鄄A,
IR and encoded proteins among XJ26鄄4 and other begomoviruses / %
Virus DNA鄄Aa IRa AV1b AV2b AC1b AC2b AC3b AC4b
TYLCCNV[Y10] 99. 5 98. 9 98. 4 99. 1 99. 2 100. 0 97. 8 99. 0
TYLCCNV[Y11] 92. 0 93. 0 92. 2 95. 7 92. 0 86. 6 92. 5 93. 8
TYLCCNV[Y43] 91. 5 92. 3 93. 4 93. 0 91. 1 87. 3 89. 6 84. 5
TYLCCNV[Y5] 91. 6 90. 4 93. 0 93. 0 87. 5 85. 8 91. 8 87. 6
TYLCCNV[Dl198] 91. 2 90. 8 91. 4 93. 0 91. 7 88. 8 91. 8 85. 6
ToLCCNV[G32] 79. 5 45. 7 79. 7 84. 3 85. 3 64. 9 61. 9 87. 6
ELCV[G35] 78. 8 70. 3 83. 2 81. 7 81. 7 68. 7 70. 1 84. 5
SLCYV 77. 1 65. 1 78. 9 68. 8 73. 1 79. 1 83. 2 37. 2
StaLCV[Hn5] 77. 0 49. 4 81. 6 80. 0 79. 7 79. 9 78. 4 40. 6
SbCLV[JP] 77. 0 54. 9 82. 0 77. 4 73. 9 68. 7 72. 4 44. 8
PaLCuCNV[G2] 76. 0 64. 8 82. 0 76. 5 76. 3 67. 2 70. 1 43. 8
TbLCYNV[Y3] 75. 8 57. 0 77. 6 75. 7 73. 1 64. 9 69. 4 45. 8
ChiLCuV[Mul] 75. 5 58. 3 76. 9 73. 0 82. 5 68. 7 66. 4 67. 0
ToLCLV 75. 2 61. 9 82. 0 66. 1 77. 2 73. 9 75. 4 44. 8
AYVTV 75. 0 57. 4 83. 2 80. 0 70. 5 67. 2 69. 4 35. 3
MYVV[Y47] 74. 6 67. 3 77. 6 67. 8 81. 9 62. 7 62. 7 74. 2
AYVCNV [G13] 73. 6 56. 5 76. 5 68. 7 77. 7 67. 2 67. 9 45. 8
TbLCKoV[KK] 72. 6 42. 0 71. 5 73. 2 80. 8 59. 0 71. 6 71. 1
PepLCBV 72. 4 61. 7 78. 0 80. 0 69. 4 67. 9 64. 9 34. 1
EACMV 70. 6 46. 7 78. 4 65. 2 71. 5 56. 0 63. 4 44. 7
CLCuAV[804a] 68. 4 51. 2 76. 5 65. 2 69. 5 60. 4 67. 2 36. 5
a:Nucleotide sequence identity; b:Amino acid sequence identity.
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摇
摇 4 期 都业娟,等:侵染新疆加工番茄的中国番茄黄化曲叶病毒 DNA鄄A的基因组特征
虱传双生病毒基因组的序列相似性却在 79. 5%以
下。 从构建的系统关系树(图 4)可以发现,所有来
自亚洲的病毒分离物形成一个大的进化分支,而来
自非洲的东非木薯花叶病毒和南非木薯花叶病毒
单独形成一个分支。 XJ26鄄4 与 TYLCCNV 各分离
物(Y10、Y11、D1198、Y5 和 Y43)形成一个小分
支,且与分离物 Y10 和 Y11 的关系更近。
Fig. 4 摇 Relationship dendrogram based on
alignments of nucleotide sequences
of DNA鄄A among XJ26鄄4 and other
begomoviruses
3摇 讨论
对新疆加工番茄上分离到的病毒分离物
XJ26鄄4 的全基因组进行序列测定和比较表明,
XJ26鄄4 DNA鄄A 与中国番茄黄化曲叶病毒各分离
物的同源性为 91. 2% ~ 99. 5% ,其中与烟草分离
物 Y10 同源性最高,达到 99. 5% 。 根据双生病毒
分类标准,Begomovirus 内,病毒之间基因组 DNA鄄
A核苷酸序列相似性小于 89% ,定为不同的病毒
种类,大于 89%则认为是同种病毒的不同株系或
分离物[ 1 ],因此 XJ26鄄4 是中国番茄黄化曲叶病毒
的一个分离物。 但是目前在我国番茄、烟草、刺茄、
曼陀罗及稀硷上发生的 TYLCCNV 均伴随 DNA茁
分子,并且已证实 DNA茁 分子编码的 茁C1 蛋白是
TYLCCNV 引 起 黄 化、 曲 叶 症 状 的 必 需 因
子[5,13 ~ 16],而我们利用 DNA茁 的特异性引物 茁01
和 茁02 却没有扩增到 DNA茁 分子,因此对新疆加
工番茄上发现的 TYLCCNV是否伴随 DNA茁 分子
还需进一步研究。
WTG最初被认为是一类寄主范围极窄的植物
病原,主要分布在热带和亚热带地区[ 17 ]。 但随着
近年全球气候变暖、贸易增强、耕作制度改变和 B
型烟粉虱世界范围内大发生,使得以其为介体传播
的 Begomovirus病毒在全球范围内广泛发生,造成
至少 39 个国家的棉花、木薯、番茄和烟草等作物遭
受毁灭性危害。 我国已报道的双生病毒主要发生
在广东、广西、海南、云南、福建和浙江等南方省区,
本研究发现中国番茄黄化曲叶病毒侵染新疆加工
番茄,说明新疆的环境条件同样适合这类病害的发
生。 近年新疆烟粉虱的发生逐年加剧,加之周边国
家巴基斯坦双生病毒已造成严重危害,预示这类病
毒很可能在新疆引起危害,需引起高度重视。
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责任编辑:于金枝
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