全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
#"""*$"!+
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#
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$
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%
.
,/001,#"""*$"!+,!"#$,"&,#""
收稿日期$
!"#$*"%*"+
&修改稿收到日期$
!"#$*"$*#$
基金项目$国家
)&%
(计划"
!"##22#"2#"$"#
#&四川省十二五油菜育种攻关项目"
34!"##
5
6
77
"+
#&国家科技支撑计划"
!"#%829"#8"%
#
作者简介$李
!
清"
#)(
#!女!在读硕士研究生!主要从事植物分子遗传生物学研究)
:*;$
=/
>
/1
7
?=
!
#&%,@A;
"
通信作者$王茂林!博士!教授!博士生导师!主要从事植物分子生物学研究和油菜遗传育种研究)
:*;$
;=B<1
7!
0@C,DEC,@1
甘蓝型油菜
$
个
%/123
!
基因的克隆与表达
李
!
清!赵
!
云!苏海峰!杨
!
华!杨朋娜!王茂林"
"四川大学 生命科学学院!成都
&#""&$
#
摘
!
要$该实验采用同源克隆技术在甘蓝型油菜中克隆得到
!
个重复的编码磷脂酶
9
的
!"#
!
基因!命名为
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
"
FD18<1?
登录号为
GH##%+)&
和
GH##%+)-
#!两者核苷酸序列一致性为
)-,%%I
)对
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
编码蛋白进行序列比对分析发现!两者序列一致性为
#,"#I
!大部分差异残基零散地分布
于氨基酸全序列中!但在
JK9
"
蛋白活性催化位点的第
#
个
LG9
基序紧邻的一段序列中!差异氨基酸残基数达到
-
个)此外! 个蛋白的三维结构预测结果也存在较大差异)对
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
基因进行表达分析发现!两
者在生长旺盛的组织部位表达量较高&低温胁迫下
$%!"#
!
#
表达上调!而
$%!"#
!
!
表达不受影响&干旱和盐胁
迫下!两者上调至最大作用时间点不同!
$%!"#
!
#
在盐胁迫信号转导中起主导作用!而
$%!"#
!
!
在干旱胁迫信号
转导中起主导作用&高温胁迫下!两者表达均呈下调趋势)研究表明!
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
在甘蓝型油菜逆境防
御系统中发挥作用!但表达模式的差异性可能会使两者呈现出异于原始基因的多样性功能)
关键词$
!"#
!
&甘蓝型油菜&重复基因&基因克隆&表达分析
中图分类号$
M-)+
&
M-)&
文献标志码$
2
%&"#
(
)!*+
,
-.//#""012"%/123
!
3../#%($44-"$/$
5
64
KNM/1
7
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OL2PQC1
!
3RL7
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Q24FLC<
!
Q24FJD1
7
1<
!
T24FU"
"
VA=D
7
DASK/SD3@/D1@D
!
3/@WC<1R1/XDY0/Z
5
!
VWD1
7
EC&#""&$
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VW/1<
#
45/6-)76
$
N1ZWD
[
YD0D1Z0ZCE
5
!
ZBAEC
[
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WA0
[
WA=/
[
<0D9
"
JK9
#
7
D1D0
!
1<;DE$%!"#
!
#
"
FD18<1?<@*
@D00/A1GH##%+)&
#
<1E$%!"#
!
!
"
FD18<1?<@@D00/A1GH##%+)-
#!
BDYD@=A1DE5
WA;A=A
7
AC0@=A1/1
7
SYA;$&(()*%
+
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>
CD1@D0W5
,]WD
[
YDE/@ZDE<;/1A<@/E0D
>
CD1@D
<=/
7
1;D1Z<1<=
5
0/00WABDEZW"
00W5
<1E;A0ZASE/SSDYD1Z/<=<;/1A
<@/E0/ZD0BDYDE/0
[
DY0DE
!
LABDXDY
!
ZWD1C;\DYASE/SSDYD1Z/<=<;/1A<@/E0/ZD0B<0C
[
ZA0DXD1/1ZWD0D*
>
CD1@DZW.
<@D1ZZWDS/Y0ZLG9;AZ/SBW/@W/0AS@YC@/<=/;
[
AYZ<1@DSAYZWD
[
YAZD/1
*
0@5
Z/@<@Z/X/Z
5
,
N1!
ZWDYD0C=Z0AS%*90ZYC@ZCYD
[
YDE/@Z/A1ASZWDZBA81JK9
"
0
[
YAZD/10<=0A0WAB<
7
YDD1@D,^D<=*Z/;D
>
C<1Z/Z!7
D1D0BDYDD_
[
YD00DE;AYD/1ZWDY<
[
*
/E=
57
YAB/1
7
Z/00CD0,]WDD_
[
YD00/A1AS$%!"#
!
#B<0C
[
*YD
7
C=!
BW/=DZWDD_
[
YD00/A1AS$%!"#
!
!B<0
C1@W<1
7
DEC1EDYZWD=AB*ZD;
[
DY7
WZ<1E0<=Z0ZYD00
!
ZWDD_
[
YD00/A1ASZWDZBA
$%!"#
!7
D1D0\AZW0W5
YA0DZA;<_/;C;DSSD@Z[
A/1Z0
!
$%!"#
!
#/10<=Z0ZYD000/
7
1<=ZY<10EC@Z/A1
[
=<
5
0!
\CZ/1EYAC
7
WZ0ZYD000/
7
1<=ZY<10EC@Z/A1
$%!"#
!
!
[
=<
5
07
C=5
YA=D,]WDD_
[
YD00/A1AS\AZW$%!"#
!7
D1D0B<0EAB1*YD
7
C=C1EDYZWDW/
7
W*ZD;
[
DY!
#<1E$%!"#
!
!/1ZWD$-%
+
,(
[
=<
5
5
0ZD;ZW7
5
!
\CZZWD0DE/SSDYD1@D0/1D_
[
YD00/A1
[
5
0WAB
ZWD/YE/SSDYD1ZSC1@Z/A1SYA;ZWDAY/
7
/1<=
7
D1D,
8.
9
2"-!/
$
JWA0
[
WA=/
[
<0D9
"
&
$&(()*%
+
,(
&
7
D1DEC
[
=/@&
@A1/1
7
&
D_
[
YD00/A1<1<=
5
0/0
!!
磷脂酶
9
"
JWA0
[
WA=/
[
<0D9
!
JK9
#是生物体内
普遍存在的一种跨膜信号转导酶!它能够水解甘油
磷脂的磷酸二酯键!产生磷脂酸
J2
和一个极性头
部基团胆碱)在拟南芥中!已克隆得到
#!
种
!"#
基因!归为
&
大类$
!"#
!
"
#
+
!
+
%
#+
!"#
"
"
#
+
!
#+
!"#
#
"
#
+
!
+
%
#+
!"#
$
+
!"#
%
"
#
+
!
#和
!"#
&
)在植
物磷脂酶
9
蛋白家族中!
JK9
"
蛋白含量最多+发挥
作用最为广泛!在植物生长代谢旺盛的部位以及幼
嫩组织中的活性较高,#*%-)植物中
JK9
"
蛋白的
4*
端序列具有一个与
V<
!` 和磷脂结合的
V!
结构域!
当
V<
!` 与
V!
域结合以后!将增强该结构域与磷脂
的亲和力!许多参与信号转导和磷脂代谢的酶
"
JGV
+
JKV
+
@JK2!
#中均存在该结构域,$*+-)在其
V*
端的序列中包含
!
个
LaGaaa9
基序!在第
!
个
LG9
基序之后不远处具有一段高度保守的
NF324*
N4M^
序列!其中保守的
3DY
残基将作为亲核试剂攻
击底物中的磷原子!以促进催化反应的进行,&-)
磷脂酶
9
参与生物膜的合成与降解!介导植物
的生长+发育和衰老过程!对保证储藏种子的活力和
油脂稳定性具有重要作用,--)许多研究表明!
JK9
"
的活性受小
F
蛋白生长素响应因子"
]WD0;<=F*
[
YAZD/1[
A10DS<@ZAY
!
2^ H
#+
V<
!`
+
4*
酰基
乙醇胺"
42:
#+
F
"
等信号分子调节!它是介导胞外
信号进入胞内的关键枢纽!参与
282
和乙烯等激
素的信号转导)已知
282
信号在植物对衰老+干
旱等胁迫响应中具有重要作用!当细胞遇到外界胁
迫刺激时!
V<
!` 诱导胞质中的
JK9
"
聚集在膜上!形
成一个
282*F
"
*JK9
"
通路!
JK9
"
被激活以后将
产生
J2
)
J2
也是一个重要的信号分子!一方面!
在高渗胁迫中!部分
J2
被磷酸化后生成
9FJJ
!
9FJJ
又将促进
J2
大量合成!使得信号增强&另一
方面!
J2
能激活
U2JG
信号通路+
V<
!` 依赖的蛋
白激酶和离子通道活性!从而使信号转导至下游靶
分子!最终影响气孔的开闭,)*#!-)在信号通路中!
JK9
"
会被
JK2
的产物
=
5
0AJ:
和
JK9
#
的产物
4*
乙酰胺所抑制!从而将不同的磷脂酶家族和同一家
族的不同亚基间信号转导相联系,#%-)因此!
JK9
"
在植物对干旱+伤害和盐胁迫等逆境的响应中具有重
要作用)此外!最近也有研究表明
JK9
"
能增强植物
对温度胁迫的耐受性,#$-!但相关报道仍然较少)
在真核生物基因组中!存在大量基因重复现象!
这些重复基因能为植物进化提供丰富的素材,#+*#--)
从水稻等植物中克隆得到的与花发育相关的重复基
因
.!%
和
!/
等的研究表明!这些重复基因的序列
和表达情况存在一定的差异!这些差异在进化中可
能导致某些原有功能的丢失或一些新功能的产生!
从而推动进化的发生,#+!#)*!"-)甘蓝型油菜是双二倍
体物种!具有
22VV
组成的基因组!其中
2
基因组
来自于二倍体祖先芸薹"
$-&
+

#!
V
基因组来自于
二倍体祖先甘蓝"
$-012&*2
#
,
#
!
#*!!
-
)因此!在甘
蓝型油菜中存在许多重复基因!对其进行研究是十
分必要的)目前!已在拟南芥+甘蓝+花生+葡萄+麻
风树等植物中克隆出
!"#
!
基因!对其参与的膜脂
降解和逆境信号转导功能也有一定的研究,!%*!+-!但
!"#
!
在甘蓝型油菜中尚未克隆出来)为了解甘蓝
型油菜
!"#
!
基因功能!本研究根据已知的甘蓝
!"#
基因序列信息!克隆得到了
!
个重复的
!"#
!
基因!并研究了这
!
个重复基因在不同组织和发育
时期+不同的逆境胁迫下的表达情况!以进一步探讨
!"#
!
在植物生长发育和逆境响应中的作用)
#
!
材料和方法
:,:
!
材
!
料
甘蓝型油菜"
$&(()*%
+
,(
#品系
#^-
由四
川大学生命科学学院油菜课题组提供!种植于四川
大学试验地)取其两叶一心期+四叶一心期+抽薹
期+花期的根+茎+叶!取样后立即放入液氮!
()"b
冰箱保存备用!实验重复
%
次!结果由
%
次重复实验
结果平均得到)
:,$
!
方
!
法
:;$;:
!
总
<=4
的提取和
7>=4
的制备
!
取
",#
7
油菜材料!于研钵中加液氮研磨成细粉!迅速转入
#,+;K
的离心管中!立即加入已预冷的
#;K]Y*
/6A= D^<
7
D1Z
"
]N24F:4
!
8:NcN4F
#!振荡混匀后!
利用
JW<0DKA@? FD= LD5
"
]N24F:4
!
8:N*
cN4F
#进行总
4^2
的提取)然后将总
4^2
用于
总
@942
的制备!
@942
的制备采用
:<0
5
3@Y/
[
Z
H/Y0Z*3ZY<1E@9423
5
1ZWD0/03C
[
DYU/_
"
]Y<10FD1
8/AZD@W
!
8D/
.
/1
7
!
VW/1<
#)
:;$;$
!
引物设计与
123
!
基因全长
7>=4
的克隆
!
根据
FD18<1?
数据库中已经报道的甘蓝"
$&(3
()*012&*2
#的
JK9
基因
942
序列设计引物对
J
"
"表
#
#)
JV^
反应采用
:<0
5
4
5
942
[
A=
5
;DY*
<0D
"
]Y<10FD18/AZD@W
!
8D/
.
/1
7
!
VW/1<
#!体系为
+"
$
K
!反应程序为
$b
预变性
+;/1
!
$b
变性
%"0
!
+)b
退火
$"0
!
-!b
延伸
!;/1$+0
!
%%
个循环以
后!
-!b
后延伸
#";/1
)
JV^
产物置
#,"I
琼脂糖
中电泳!用紫外凝胶成像仪"
8/A*^#观察结果)采
#"#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
李
!
清!等$甘蓝型油菜
!
个
$%!"#
!
基因的克隆与表达
用凝胶回收试剂盒"
]N24F:4
#回收目的片段!回
收产物与
[
:23Q*]#
"
]Y<10FD18/AZD@W
!
8D/
.
/1
7
#
载体连接后转化
6-*01)9L+
"
感受态细胞!涂于含
有氨苄青霉素的
K8
固体培养基上!过夜培养后!挑
取白色克隆!经含有氨苄青霉素的液体培养基振荡
培养
&W
后!菌落
JV^
检测是否有插入片段!阳性
克隆送华大基因公司测序)
:;$;?
!
123
!
基因生物信息学分析
!
利用
WZZ
[
$%%
BBB,D_
[
<0
5
,AY
7
%和
WZZ
[
$%%
BBB,1@\/,1=;,1/W,
7
AX
%网站对推测蛋白质的各种理化性质进行分析)
在
FD18<1?
进行
8K23]
比对!氨基酸序列比对运
用
942U24
软件完成)利用
V=C0Z<=_#,)%
和
U:F2+,"!
软件构建
4c
"
1D/
7
W\AY*
.
A/1/1
7
#树)使
用
N*]233:^ 0DYXDY
,
!&
-和
RV3HVW/;DY<#,)
进行
蛋白质的三维结构预测和分析)
:;$;@
!
123
!
重复基因
A%<
引物特异性鉴定
!
根
据扩增所获得的
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
基因的全
序列!在两者碱基差异位点分别设计特异性
JV^
引
物!
$%!"#
!
#
的特异性引物对为
J
#
!
$%!"#
!
!
的
特异 定 量 引 物 对 为
J
!
"表
#
#)分 别 以 含 有
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!@942
的重组质粒作为模
板进行
JV^
分析!来鉴定每一个基因的特异性引
物!
JV^
条件为
+b
预变性
%"0
!
$b
变性
#"0
!
&"b
退火
%"0
!
$"
个循环后!
-!b
后延伸
+;/1
)
JV^
产物置
#,"I
琼脂糖中电泳!用凝胶成像仪
"
8/A*^#观察结果)
:;$;B
!
123
!
基 因 的 表 达 分 析
!
为 了 检 测
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
基因在甘蓝型油菜的不同
组织及不同发育时期的表达水平!取两叶一心+四叶
一心+抽薹期及花期的根+茎+叶!分别提取
;^ 42
!
以其反转录获得的
@942
为模板!进行实时荧光定
量
JV^
分析"
>
]^*JV^
#!
JV^
仪为美国
8/A*^的
VHa&
)
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
基因的
>
]^*
JV^
引物对分别为
J
#
和
J
!
)以
"
3*7)%
基因"
FD1*
8<1?
登录号
2H###)#!
#作为内参基因!引物对为
J
%
"表
#
#)采用
]Y<103Z]U
]A
[
FYDD1
>
JV^ 3C*
[
DYU/_
"
]Y<10FD18/AZD@W
#试剂盒进行定量实验!
反应体系为
!d]Y<103Z]U
]A
[
FYDD1
>
JV^
混
合液
#!,+
$
K
!
@942#
$
K
!上下游引物"
#"
$
;A=
%
K
#
各
",+
$
K
!加水至
!+
$
K
)
$%!"#
!
的
>
]^*JV^
反应条件为
+b
预变性
%"0
!
$"
个循环"
+b#"
0
!
&"b%"0
#!溶解曲线绘制条件为
)"
个循环"
++
b#;/1
!每个循环升高
",+b
#)采用
%%
8Z
方法
计算相对表达量!每样品进行
%
次重复)
:;$;C
!
123
!
基因在非生物胁迫下的表达分析
!
为了检测
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
基因在非生物胁
迫下的表达水平!选择饱满+色泽鲜亮+大小均匀的
甘蓝型油菜种子!用
",#I L
7
V=
!
表面消毒
#"
;/1
!自来水多次冲洗后催芽
!$W
!播于含营养土
e
蛭石"
%e#
#的土壤中!于温室中培养"
!$b
!光强
%""
$
;A=
.
;
(!
.
0
(#
!
#&W
光照!
)W
黑暗!相对湿
度控制在
&"I
&
-"I
#)待幼苗长至四叶一心期!
用蒸馏水小心地冲洗掉根上黏附的大块土壤!迅速
置于铺有纱布的白磁盘内!用
#
%
!LA<
7
=<1E
营养
液!缓苗
!$W
后进行胁迫处理)温度胁迫的样品分
别置于
$"b
和
$b
培养箱中!在
$"b
胁迫后
"
+
!
+
$
+
&
和
)W
取样!在
$b
胁迫后
"
+
%
+
&
+

+
#!
+
!$
和
$)W
取样)分别以
!"" ;;A=
%
K 4和
!"I
J:F*&"""
的
#
%
!LA<
7
=<1E
营养液进行胁迫处理!
胁迫后
"
+
%
+
&
+

+
#!
+
!$
和
$)W
分别取样)每个样
品至少取
#"
株叶片混合!立即置于
()"b
液氮中
保存!分别提取
4^2
进行
>
]^*JV^
!
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
基因的定量引物对分别为
J
#
和
J
!
!实验
重复
%
次)采用
%%
8Z
法计算相对表达量!所得数据
用
3J33!#,"
进行方差分析!在置信水平
+I
上用
9C1@<1
法进行多重比较!用
PY/
7
/1),+
绘制图表)
!
!
结果与分析
$;:
!
%/123
!
基因全长
7>=4
克隆与序列分析
根据甘蓝
!"#
基因
P^ H
设计引物!以甘蓝型油
表
:
!
%/123
!
基因克隆及荧光定量
A%<
所用引物
]<\=D#
!
JY/;DY0SAY@=A1/1
7
<1E
>
]^*JV^ AS$%!"#
!7
D1D
引物名称
JY/;DY1<;D
引物序列
JY/;DY0D
>
CD1@D
"
+f
#
%f
# 用途
9D0@Y/
[
Z/A1
J
"
$%!"#
!
*H
$%!"#
!
*^
2]FFVFV2FV2]V]F]]FV2
]]22F]]F]22FF2]]FF2FFV2FF
P^ H
扩增
2;
[
=/S/@J
#
$%!"#
!
#*
>
H
$%!"#
!
#*
>
^
2FV]V]]2FFFV]V2FFFV]]2
]V]]F]FVV]]V2]2]2FV]VF2
J
!
$%!"#
!
!*
>
H
$%!"#
!
!*
>
^
F2]VF222V]FF22V2]FFFFF
FF2VF22F]]2]VVFF22V2
J
%
"
3*7)%*
>
H
"
3*7)%*
>
^
]V]]VV]V2VFV]2]VV]VVF
2FVVF]V]VV2FV]V]]FV
>
]^*JV^
!"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
菜
@942
为模板进行
JV^
扩增!得到长约
!$%"[
片段"图
#
#)将产物纯化后连接到
[
:23Q*]#
克隆
载体!得到了
-
个重组子!测序结果显示!有
!
种不
同核苷酸序列!其中
$
个重组子所含
@942
片段大
小为
!$%%[
!命名为
$%!"#
!
#
"
GH##%+)&
#!另
%
个重组子所含
@942
片段大小为
!$%[
!命名为
$%!"#
!
!
"
GH##%+)-
#)两者都包含一个完整的
P^ H
!核 苷 酸 序 列 的 一 致 性 为
)-,%%I
)在
$%!"#
!
!
第
#"%![
处比
$%!"#
!
#
多
&
个核苷
酸!即多编码了
!
个氨基酸!其余差异的核苷酸位点
图
#
!
$%!"#
!
基因全长
@942
的扩增
H/
7
,#
!
2;
[
=/S/@7
ZW@942
AS$%!"#
!7
D1D
U,+""[
942=&
#,$%!"#
!
都呈分散性排布)将
!
个甘蓝型油菜
$%!"#
!
基
因核苷酸序列与二倍体祖先甘蓝和芸薹的
!"#
基
因核苷酸序列比对发现!
$%!"#
!
#
与甘蓝
!"##
基因"
2H""$$+
#核苷酸序列的一致性为
,!&I
!
$%!"#
!
!
与甘蓝
!"#!
基因"
2H""$$$
#核苷酸
序列的一致性为
&,&$I
)将
!
个甘蓝型油菜
$%!"#
!
基因与芸薹基因组序列比对+拼接后得到
芸薹
!"#
的核苷酸序列!
$%!"#
!
#
与芸薹
!"#
核苷酸序列一致性为
&,))I
!
$%!"#
!
!
与芸薹
!"#
核苷酸序列一致性为
)-,+$I
)
$;$
!
%/123
!
蛋白的生物信息学分析
分析表明!
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
推测蛋白的
JN
分别为
+,$+
和
+,%-
!相对分子量分别为
#,
和
!,"?9
)
!
个
81JK9
"
氨基酸序列一致性为
#,"#I
!两者
4
端都具有
V!
结构域!
V
端具
!
个
LaGaaa9
基序! 个基序之间相差约
%!"
个氨基
酸"图
!
#)
!
个蛋白均含
/^\\D0
等,!--提出的
8A_2
"
HgFFN9KV9F^ Q9
#+
8A_8
"
HNQN:4MQHK
#和
8A_V
"
NF324N4M^ 3
#
%
个保守序列以及
#
个
JNJ!
结合位点"
^^
#)
8A_V
中
3DY
残基将作为亲核试
剂来攻击底物磷脂上的磷原子!这些保守序列都将
决定磷脂酶
9
催化活性的发挥)
!
个
81JK9
"
氨基
图
!
!
甘蓝型油菜+甘蓝及拟南芥
JK9
"
#
与
JK9
"
!
氨基酸序列比对
81JK9
"
+
P@JK9
"
+
2ZJK9
"
分别为甘蓝型油菜+甘蓝和拟南芥中的
JK9
"
蛋白&序列上方的数字代表
该氨基酸的位点&
(
代表相同的氨基酸&
"
代表该位点无氨基酸&/代表未在图中显示的氨基酸
H/
7
,!
!
2=/
7
1;D1ZASZWDJK9
"
#<1EJK9
"
!
[
YAZD/1AS$%!"#
!
!
9*!"#
!
<1E.7!"#
!7
D1D0
81JK9
"
!
P@JK9
"
<1E2ZJK9
"
0Z<1ESAYZWDJK9
"[
YAZD/10SYA;$-%
+
,(
!
$-012&*2
!
.-7:1)%
!
YD0
[
D@Z/XD=
5
,
]WD1C;\DY0/1ZWD0D
>
CD1@D/1E/@&
(/1E/@&
"
YD
[
YD0D1Z0
7
<
[
/1ZYAEC@DEZA;<_/;/6D<=/
7
1;D1Z
&/
YD
[
YD0D1Z0ZWD<;/1A<@/EBW/@W/01AZ0WAB1/1ZWD0D
>
CD1@D
%"#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
李
!
清!等$甘蓝型油菜
!
个
$%!"#
!
基因的克隆与表达
酸序列相比较!在两者的
V!
域中有
&
个氨基酸具
有差异&两者第
#
个
LG9
基序都是
LMGNgg9
!但
在
81JK9
"
!
的
LMGNgg9
序列后第

个氨基酸处
比
81JK9
"
#
的该处序列多出
!
个非极性的甘氨酸!
在第
#
个
LG9
基序和
8A_2
之间存在包括多出的
!
个甘氨酸在内的
-
个氨基酸残基差异&
!
个
81JK9
"
氨基酸序列的第
!
个
LaGaaa9
基序分
别是
L3GUUNg9
和
L]GU]Ng9
!在
JNJ!
结合
位点+第
!
个
LaGaaa9
基序及
8A_V
邻近区域
有
-
个氨基酸残基存在差异)
!
个
81JK9
"
氨基酸
序列中某些氨基酸残基的极性差异可能影响两者在
膜上的催化活性)
利用
N*]233:^ 3DYXDY
对
!
个
81JK9
"
蛋白
进行三级结构预测分析"图
%
#!发现
!
个
81JK9
"
蛋白都折叠成相对独立的
!
个亚结构域!
4
端都由
%
个
"
螺旋和无规卷曲组成&
81JK9
"
#
的
V
端由
!"
个
"
*
螺 旋+
-
个

*
折 叠 和 无 规 卷 曲 组 成!而
81JK9
"
!
的
V
端由
#)
个
"
*
螺旋+
)
个

*
折叠和无
规卷曲组成)
!
个蛋白的
8A_V
中的
3DY
残基都位
于蛋白质活性口袋中)由于
!
个蛋白中有差异氨基
酸的存在!可以看出两者的
4
端构象差异较大!
4
端是与
V<
!` 结合相关)在
V
端!
81JK9
"
!
的
"
*
螺
旋数目较少!有利于骨架解开螺旋!使蛋白活性口袋
的开口变大!能更好地容纳底物!保证与底物的充分
结合)在
V
端蛋白质活性口袋处! 个
81JK9
"
蛋
白的

*
折叠的分布情况不同!在
81JK9
"
#
中!从左
向右逆时针方向看!
-
个

*
折叠分
%
组排布"第
#
+
!
组各有
!
个

*
折叠!第三组有
%
个

*
折叠#&而在
81JK9
"
!
中!从左向右逆时针方向看!有
)
个

*
折
叠!也可分为
%
组!依次是
%
+
!
+
%
个

*
折叠!第
#
组
和第
%
组分布在一条直线上!且与第
!
组垂直)这
些差异排布可能会影响底物与
3DY
残基的碰撞!从
而影响蛋白的催化活性)但这些推测来自于三级结
构的预测!具体的情况还需相关的蛋白结构分析实
验验证)
$;?
!
DAE>
!
蛋白系统进化分析
将
!
个
81JK9
"
氨基酸序列与已知的不同来源
的
#+
个
!"#
基因氨基酸序列进行同源性分析)
从该
4c
树"图
$
#可以看出!不同物种
"
型
!"#
基
因聚合在一个分支上!而

+
(
型聚合在另一个分支
上!所以
!
个
$%!"#
!
与其他物种
!"#
基因
"
型
亲缘关系较

+
(
近!说明本研究从甘蓝型油菜中克
隆得到的
!
个磷脂酶
9
基因属于
!"#
!
家族)在
所有
!"#
!
聚类的分支上! 个
$%!"#
!
与双子叶
植物亲缘关系较近!
!
个
$%!"#
!
分别与甘蓝的
!"#
!
#
和
!"#
!
!
的亲缘关系最近!甚至超过了
$%!"#
!
两者间的亲缘关系!这也体现了甘蓝型油
菜的确与甘蓝有着很近的亲缘关系)
$;@
!
%/123
!
基因
A%<
鉴定
选取
$%!"#
!
核苷酸序列差异较大的
$
个位
点进行扩增!
$%!"#
!
#
引物对
J
#
的扩增片段大小
为
#&$[
!
$%!"#
!
!
引物对
J
!
的扩增片段大小为
#%"[
)以含有
$%!"#
!
@942
的重组质粒作为
模板进行
JV^
反应后电泳检测结果"图
+
#!以含
$%!"#
!
#@942
重组质粒为模板!以
J
#
为引物时!
能够扩增出
$%!"#
!
#
片段&以
J
!
为引物!不能够
扩增出
$%!"#
!
!
片段)以含
$%!"#
!
!@942
重
组质粒为模板!只有以
J
!
为引物时!能够扩增出
$%!"#
!
!
片段)结果表明
J
#
和
J
!
这两对引物能
够成功地将
!
个
$%!"#
!
片段特异性地区分开)
图
%
!
81JK9
"
#
与
81JK9
"
!
的蛋白构象
2,81JK9
"
#
的蛋白构象&
8,81JK9
"
!
的蛋白构象&红色表示
"
螺旋&黄色表示

折叠&
绿色表示无规卷曲&紫红色表示
8A_V
中的丝氨酸残基
H/
7
,%
!
JYAZD/1@A1SAY;"
#<1E81JK9
"
!
2,JYAZD/1@A1SAY;"
#
&
8,JYAZD/1@A1SAY;"
!
&
]WDYDE@A=AY0Z<1E0SAY
"
*WD=/_
&
]WD
5
D=AB@A=AY0Z<1E0SAY

*WD=/_
&
]WD
7
YDD1@A=AY0Z<1E0SAYY<1EA;@A/=
&
]WD;<
7
D1Z<@A=AY0Z<1E0SAYY<1EA;@A/=
$"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
图
$
!
81JK9
"
蛋白与其他
JK9
蛋白的氨基酸序列的进化树分析
标尺代表碱基替换率&分支上数字代表
8AAZ0ZY<
[
验证中基于
#"""
次的重复该节点可信度
H/
7
,$
!
JW
5
=A
7
D1DZ/@ZYDD<1<=
5
0/0ASEDEC@DE81JK9
"[
YAZD/1B/ZWAZWDYJK9
[
YAZD/10
]WD1C;\DY0/1ZWDYC=DY/1E/@&
]WD1C;\DY0A1ZWD\Y<1@WD0
;D<1ZWDYD=/<\/=/Z
5[
DY@D1ZAS\AAZ0ZY<
[
0X<=CD\<0DEA1#"""YD
[
=/@图
+
!
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
基因
>
]^*JV^
鉴定
U,9K!"""
&
[
JK9
"
#
和
[
JK9
"
!
分别代表以含有
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
的重组质粒为模板&
J
#
和
J
!
分别代表用于扩增
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
特异性基因片段的引物对
H/
7
,+
!>
]^*JV^ /ED1Z/S/@!7
D1D0
U,9K!"""
&
[
JK9
"
#<1E
[
JK9
"
![
=<0/;E0@A1Z7
$%!"#
!
#<1E$%!"#
!
!
!
YD0
[
D@Z/XD=
5
&
]WDZBAYD@A;\/1<1Z
[
=<0/;E0BDYDC0DE<0
ZD;
[
=!
YD0
[
D@Z/XD=
5
&
]WDZBA
[
[
Y/;DY0
!
J
#
<1EJ
!
BDYDC0DEZA<;
[
=/S
5
ZWD0
[
D@/S/@$%!"#
!
0D
7
;D1Z
$;B
!
%/123
!
在不同生长时期各组织的表达分析
利用
>
]^*JV^
方法!分析甘蓝型油菜
!
个
$%!"#
!
基因在两叶一心+四叶一心+抽薹期+花期
不同组织中的表达情况"图
&
#)由图
&
!
2
可以看
出!根中
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
的表达呈不断上
升的趋势! 个基因在两叶一心期和四叶一心期的
表达量明显低于抽薹期和花期)由图
&
!
8
可以看
出!茎中
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
在两叶一心期+四
叶一心期及抽薹期的表达量较低!且
%
个阶段表达
量相差不大!但两者的表达量都在花期最高)由图
&
!
V
可以看出!叶中抽薹期
$%!"#
!
#
的表达量较
低!除此之外!
$%!"#
!
#
在其余几个时期的表达量
相差不大&而
$%!"#
!
!
在抽薹期表达量最低!在两
图
&
!
$%!"#
!
在甘蓝型油菜根"
2
#+茎"
8
#+
叶"
V
#不同时期的
>
]^*JV^
分析
)
,
两叶一心期&
*
,
四叶一心期&
+
,
抽薹期&
,
,
花期&
不同小写字母表示不同发育时期间在
","+
水平上差异显著
H/
7
,&
!
$%!"#
!
D_
[
YD00/A1/1YAAZ0
"
2
#!
0ZD;0
"
8
#
<1E=D"
V
#
AS$&(()*%
+
,(ECY/1
7
ZWDE/SSDYD1Z
EDXD=A
[
;D1Z<=0Z<
7
D05>
]^*JV^
)
,!*DC
[
W
5
=<0
&
*
,$*DC
[
W
5
=<0
&
+
,8A=Z/1
7
&
,
,H=ABDY/1
7
&
]WDE/SSDYD1Z1AY;<==DZZDY0/1E/@7
1/S/@<1Z
E/SSDYD1@D<;A1
7
EDXD=A
[
;D1Z0Z<
7
D0+"#
&
期
!!!!!!!!!!!!!
李
!
清!等$甘蓝型油菜
!
个
$%!"#
!
基因的克隆与表达
图
-
!
$%!"#
!
#
+
$%!"#
!
!
在不同非生物胁迫下的表达模式
2,
低温胁迫&
8,
高温胁迫&
V,
盐胁迫"
!"";;A=
%
K4#&
9
干旱胁迫"
!"IJ:F*&"""
#&不同小写字母
表示不同胁迫时间
","+
水平差异显著
H/
7
,-
!
:_
[
YD00/A1
[
!
#<1E
$%!"#
!
!
7
D1D0/10DDE=/1
7
0B/ZWX2,KABZD;
[
DY"
$b
#&
8,L/
7
WZD;
[
DY"
$"b
#&
V,3<=Z0ZYD00
"
!"";;A=
%
K4#&
9,9YAC
7
WZ0ZYD00
"
!"IJ:F*&"""
#&
]WDE/SSDYD1Z1AY;<==DZZDY0/1E/@0/
7
1/S/@<1ZE/SSDYD1@D<;A1
7
0ZYD00Z/;D叶一心期的表达量较高)
$;C
!
%/123
!
在非生物胁迫下的表达分析
利用
>
]^*JV^
方法!分析
$%!"#
!
基因在各
种非生物胁迫下的表达情况"图
-
#)由图
-
!
2
可以
看出!低温胁迫下!
$%!"#
!
#
表达呈先上升后下降
的趋势!胁迫
W
时表达量最高!而
$%!"#
!
!
在整
个胁迫过程中与对照"
W
#相比变化不大!一直保持
初始表达水平)高温胁迫"图
-
!
8
#下!两者的表达
量均在胁迫
!W
时开始下调!下调后
$%!"#
!
!
表
达量逐渐降低!而
$%!"#
!
#
一直保持胁迫
!W
时
的表达量!并一直高于
$%!"#
!
!
表达量)盐胁迫
"图
-
!
V
#下!
$%!"#
!
的表达均呈先上升后下降趋
势!
$%!"#
!
!
在 胁 迫
&W
时 表 达 量 最 大!而
$%!"#
!
#
表达量在胁迫
#!W
时才达到最大!但在
整个 胁 迫 过 程 中
$%!"#
!
#
表 达 量 始 终 高 于
81JK9
"
!
表达量)由图
-
!
9
可以看出!在
J:F
模
拟干旱胁迫下!
$%!"#
!
表达均呈先上升后下降趋
势!
$%!"#
!
#
在 胁 迫
!$W
时 表 达 量 最 高!而
$%!"#
!
!
表达量在胁迫
#!W
时达到最大值!并且
在整个胁迫过程中
$%!"#
!
!
的表达量基本上高于
$%!"#
!
#
的表达量)
%
!
讨
!
论
植物的磷脂酶
9
基因不仅参与调控植物生长
发育和衰老!还是一个重要的跨膜信号转导酶!能够
介导胞外信号传向胞内!在伤害+病原菌侵蚀以及干
旱+盐胁迫+温度等逆境的诱导下!磷脂酶
9
家族的
各个成员都将出现大量表达,!)-)目前
JK9
家族的
众多成员已经在很多植物中被克隆和研究!但在甘
蓝型油菜中还未见相关报道)本实验克隆了甘蓝型
油菜的
JK9
基因!得到了
!
个重复基因!分别命名
为
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
!两者的开放阅读框分别
为
!$%%[
和
!$%[
!推测的氨基酸序列一致性
为
#,"#I
)
81JK9
"
#
和
81JK9
"
!
都含有与其他
物种
JK9
"
家族一样保守的
V!
域结构+
!
个
LG9
基序!点突变实验证明这些保守序列的氨基酸对
JK9
催化水解功能的发挥是至关重要的,!-)
在植物的进化历程中!重复基因中某一个拷贝
可能会发展出新的功能!也可能会被丢失从而丧失
功能!因此这些重复的拷贝将逐渐在保持原始基因
不同的亚功能上出现分歧!而若要保持这些新功能!
它们就要保持自身特异的表达模式和蛋白结构!随
着时间的推移!这些比较微小的差异最终将推动植
物进化的发生,#&-)甘蓝型油菜是由甘蓝和芸薹杂
交而得到的双二倍体物种!在其基因组上存在许多
像
!"#
!
这样的重复基因!
$%!"#
!
#
和
$%!"#
!
!
的核苷酸序列与
!
个亲本"甘蓝和芸薹#的
!"#
核
苷酸序列都保持着较高的一致性!这表明甘蓝型油
菜
$%!"#
!
基因共同继承了双亲的原始基因!具有
较强的进化潜力)
&"#
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
在罂粟+甘蓝等植物中都已纯化得到了
!
个
JK9
同工酶!它们分别由
!
个重复基因编码!通过
表达和酶活测定分析表明这些同工酶具有不同催化
潜能,%"*%!-)将蛋白序列中某些氨基酸用另外一些氨
基酸替代改变相应氨基酸的极性或带电性质!或者
直接删除来检测蛋白活性发现某些氨基酸的差异将
影响蛋白的活性)特别是在
JK9
蛋白第一个
LG9
基序后面的一段氨基酸序列中!将甘蓝
JK9!
蛋白
第
%$%
位
g
#
U
!第
%+&
位
U
#
g
!删除第
%+#
和
%+!
位的
:
+
U
时!或者将罂粟
JK9!
蛋白第
%+!
位
:
#
M
时!由于替代氨基酸带电性的改变以及是否
具备芳香环等差异将影响蛋白质的高级结构!故相
应蛋 白 的 活 性 将 大 大 改 变,%#*%!-)甘 蓝 型 油 菜
81JK9
"
#
和
81JK9
"
!
蛋白序列比对中!保守序列
中的关键氨基酸如
LG9
基序中的
L/0
+
K
5
0
+
20
[
!
在
!
个蛋白中都十分保守!然而在第一个
LG9
基
序后面一段氨基酸序列中出现了密集的
-
个氨基酸
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而除了在两叶一心期的叶中表达量较高外!在成熟
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!
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长旺盛的发育期和组织中表达量更高)
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!
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信号负调因子
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"一种
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酶#反应!介导
282
的信号转导!调控脯氨酸的生
物合成和气孔开闭!以调节细胞中水分的含量!从而
达到调节植物对干旱+盐以及高低温胁迫适应的目
的,%&*%-)在麻风树和葡萄中的研究表明当幼苗在处
于以上胁迫不久后!幼苗中
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!
的表达量立即上
调,!%!+-)本实验中!低温胁迫时
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在
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!
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这与前人所提出的重复基因在具体功能中具有差异
性的结果一致!这可能是
!
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一个竞争性调整!通常在重复基因中某个基因会逐
渐起主导作用,$"-)此外!本实验中高温胁迫下!
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!
需要下调某些生理过程来
抵御高温胁迫带来的伤害!但目前还未有确切的证
据予以支持)
总之!
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在甘蓝型油菜抵御逆境的分子
机制中具有重要作用!并且
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子育种研究!但它们在逆境信号转导中的差异性功
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