全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４５(１): ２２￣３２(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０１￣１６ꎻ 修回日期: ２０１４￣０９￣１６
基金项目: 广西自然科学基金重点项目( ２０１０ＧＸＮＳＦＤ０１３０３１)ꎬ第 ４６ 批教育部留学回国人员科研启动基金ꎬ自治区主席科技资金
(１３２４１０２)
通讯作者: 王日升ꎬ副研究员ꎬ主要从事蔬菜分子生物学研究ꎻＴｅｌ:０７７１￣３２４９２０１ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｓｈｅｎｇｒｉｗａｎｇ＠１２６.ｃｏｍ
第一作者: 李猷ꎬ男ꎬ江西宁都人ꎬ硕士研究生ꎬ主要从事植物分子生物学研究ꎻＥ￣ｍａｉｌ:ｌｙ１３１４５２０９９＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０１.００４
西瓜与枯萎病菌非亲和互作相关
基因的分离及表达分析
李 猷１ꎬ３ꎬ 王日升２ꎬ３∗ꎬ 董登峰１ꎬ 张 曼２ꎬ 刘文君２ꎬ 陈振东２ꎬ 董文斌２
( １广西大学农学院ꎬ南宁 ５３０００４ꎻ ２广西农业科学院蔬菜所ꎬ南宁 ５３０００７ꎻ ３广西作物遗传改良生物技术重点开放实验室ꎬ南宁 ５３０００７ )
摘要:从整体水平阐明西瓜对西瓜枯萎病菌 １号生理小种的抗病分子机制和抗病相关基因的表达特征ꎬ以高抗枯萎病菌 １
号生理小种的西瓜品种“卡红(Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ)”为试材ꎬ接种西瓜枯萎病菌和蒸馏水的根尖组织作为测验方(Ｔｅｓｔｅｒ)和驱动
方(Ｄｒｉｖｅｒ)ꎬ构建西瓜枯萎病菌胁迫的 ＳＳＨ￣ｃＤＮＡ正向文库ꎮ 利用反向 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ 斑点杂交技术对文库中克隆进行杂交筛
选ꎮ 随机测序 ３００个阳性克隆ꎬ序列比对分析ꎬ利用 ＲＴ￣ＰＣＲ 技术分析抗病相关基因的表达特性ꎮ ２５９ 条 ＥＳＴ 成功测序ꎬ
１６７条与已知基因具有较高的同源性ꎬ占全部 ＥＳＴｓ的 ６５.５％ꎬ其中与抗病和防卫相关的有 ６４条 ２３种ꎬ占 ２４.７％ꎻ卡红对枯
萎病菌 １号生理小种的抗性相关基因主要涉及抗病信号传导、抗病防卫、转录因子、次生代谢合成和细胞保护等方面ꎻ
Ａｑｕａｐｏｒｉｎ和 Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ基因在接种后表达量均增加ꎮ Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ 对枯萎病菌侵染作出的反应是全方位多方面的ꎬ抗病
相关基因主要集中在系统获得性抗性反应中ꎬ获得了一些 Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ与野生西瓜 ＰＩ２９６３４１ 在与枯萎病生理小种 １ 互作
中差异表达的基因ꎬ为深入研究西瓜与枯萎病菌互作的分子机制以及关键基因的功能分析奠定基础ꎮ
关键词:西瓜ꎻ 枯萎病ꎻ 抑制消减杂交ꎻ 表达序列标签ꎻ ＲＴ￣ＰＣＲ
Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ
ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ａｎｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｎｉｖｅｕｒｎ　 ＬＩ Ｙｏｕ１ꎬ３ꎬ
ＷＡＮＧ Ｒｉ￣ｓｈｅｎｇ２ꎬ３ꎬ ＤＯＮＧ Ｄｅｎｇ￣ｆｅｎｇ１ꎬ ＺＨＡＮＧ Ｍａｎ２ꎬ ＬＩＵ Ｗｅｎ￣ｊｕｎ２ꎬ ＣＨＥＮ Ｚｈｅｎ￣ｄｏｎｇ２ꎬ ＤＯＮＧ Ｗｅｎ￣
ｂｉｎ２ 　 ( １Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００４ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ２Ｖｅｇｅｔａｂｌｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅꎬ Ｇｕａｎｇｘｉ Ａｃａｄｅｍｙ
ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ ５３０００７ꎬ Ｃｈｉｎａꎻ ３Ｇｕａｎｇｘｉ Ｃｒｏｐ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙꎬ Ｎａｎｎｉｎｇ
５３０００７ꎬ Ｃｈｉｎａ )
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｓｙｓｔｅｍ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｎｉｖｅｕｒｎ ｉｎ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｗａｓ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ
ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｗｈｏｌｅ ｌｅｖｅｌꎬ ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ ｔｈｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ａｎａｌｙｚｅｄ. “Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ”ꎬ ａ
ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｖａｒｉｅｔｙ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒａｃｅ １ ｗａｓ ｕｓｅｄ ａｓ ｔｈｅ ｔｅｓｔ ｍａｔｅｒｉａｌꎬ
ａｎｄ ａ ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｗａｓ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ｂｙ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ (ＳＳＨ) ｕｓｉｎｇ ｒｏｏｔ ｔｉｐ ｔｉｓｓｕｅｓ ｓａｍ￣
ｐｌｅｄ ａｔ ０、６、１２、２４、３６、４８ ａｎｄ ７２ ｈ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｒａｃｅ １ ｏｆ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｎｉｖｅｕｒｎ ｏｒ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａ￣
ｔｅｒ. Ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｅｄ ｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｖｅｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｄｏｔ￣ｂｌｏｔꎬ ａｎｄ ３００ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｗｅｒｅ ｒａｎｄｏｍｌｙ ｓｅ￣
ｑｕｅｎｃｅｄꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｗｏ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲ. Ａ ｔｏｔａｌ ｏｆ ２５９ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｅｘ￣
ｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｗｅｒｅ ｓｃｒｅｅｎｅｄ ｏｕｔꎬ ａｎｄ １６７ ｏｆ ｔｈｅｍ ｗｅｒｅ ｑｕｉｔｅ ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈｅ ｋｎｏｗｎ ｇｅｎｅｓꎬ ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ
６５.５％ꎻ Ａｍｏｎｇ ｏｆ ｔｈｅｍꎬ ６４ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｄｉｓｅａｓｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｎｄ ｄｅｆｅｎｓｅꎬ ａｃｃｏｕｎｔｉｎｇ ｆｏｒ ２４.７％. Ｂｌａｓｔ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｓｉｇｎａｌ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎꎬ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｅｆｅｎｓｅꎬ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒꎬ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓꎬ ｐｌａｎｔ ｃｅｌｌ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎꎬ ｅｔｃ. Ｆｕｒｔｈｅｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｔｈａｔ
　
　 １期 李 猷ꎬ等:西瓜与枯萎病菌非亲和互作相关基因的分离及表达分析
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｑｕａｐｏｒｉｎ ａｎｄ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｇｅｎｅｓ ｗｅｒｅ ｂｏｔｈ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｐｈｙｓｉｏ￣
ｌｏｇｉｃａｌ ｒａｃｅ １. Ｔｈｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｂｅｔｗｅｅｎ Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ ａｎｄ Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｉｎｖｏｌｖｅｓ ｍａｎｙ ａｓｐｅｃｔｓꎬ ｗｈｉｃｈ ｉｓ
ｓｉｍｉｌａｒ ｔｏ ｔｈａｔ ｏｆ ＰＩ２９６３４１. Ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅｌａｔｅｄ ｇｅｎｅｓ ａｒｅ ｍａｉｎｌｙ ｔｈｏｓｅ ｐａｒｔｉｃｉｐａｔｉｎｇ ｉｎ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｑｕｉｒｅｄ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｒｅａｃｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ｇｅｎｅｓ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ ｂｕｔ ｎｏｔ ｉｎ ＰＩ２９６３４１ ｗｅｒｅ ｇａｉｎｅｄ. Ｔｈｅｓｅ
ｒｅｓｕｌｔｓ ｍａｋｅ ａ ｇｏｏｄ ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｆｕｒｔｈｅｒ ｅｘｐｌｏｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ａｎｄ
Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ａｎｄ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｋｅｙ ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｇｅｎｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃｉｔｒｕｌｌｕｓ ｌａｎａｔｕｓꎻ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍꎻ ＳＳＨ￣ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙꎻ ＥＳＴꎻ ＲＴ￣ＰＣＲ
中图分类号: Ｓ４３２ꎬＳ１８８　 　 文献标识码: Ａ　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０１￣００２２￣１１
　 　 西瓜枯萎病是由半知菌亚门镰孢属尖孢镰刀
菌(Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ.ｓｐ. ｎｉｖｅｕｒｎ)寄生引起的
一种世界性真菌土传病害ꎬ国际公认的西瓜枯萎病
菌有 ０、１和 ２三个生理小种ꎬ我国以 １号生理小种
为主[１]ꎮ 西瓜枯萎病在我国广泛发生ꎬ病田一般
减产 ２０％ ~ ３０％ꎬ严重的可达 ５０％以上ꎬ甚至绝
产[２]ꎮ 采用抗病品种是防治西瓜枯萎病最经济有
效的途径ꎬ明确枯萎病菌与西瓜之间的互作机理可
为西瓜枯萎病抗病育种提供可靠的理论依据ꎬ对防
治西瓜枯萎病具有重要意义ꎮ 目前ꎬ西瓜抗枯萎病
机理研究主要涉及组织学、生理、生物化学及分子
标记方面ꎬ已明确根系组织结构和生理生化方面存
在抗病因子[３ ꎬ ４]ꎬ西瓜野生种质 ＰＩ２９６３４１ 与枯萎
病菌 １ 号生理小种互作机理的研究发现一些转
录因子、激酶、防卫基因和抗病基因ꎬ同时发现
了茉莉酸和木质素两个抗病途径 [２] ꎮ 虽然
ＰＩ２９６３４１ 具有抗西瓜枯萎病 ０、１、２ 三个生理小
种的抗源ꎬ抗病品种 Ｃａｌｈｏｕｎ ｇｒａｙ 具有抗西瓜枯
萎病生理小种 ０、１ 两个抗源 [１] ꎬ但是由于 Ｃａｌ￣
ｈｏｕｎ ｇｒａｙ 与 ＰＩ２９６３４１ 具有不同的抗病血缘、抗
病遗传规律也不同 [５] ꎬ因而以 Ｃａｌｈｏｕｎ ｇｒａｙ 为
试材研究生理小种 １ 介导的抗枯萎病机制可从
另一角度了解抗生理小种 １ 机制ꎮ 了解西瓜抗
枯萎病相关基因表达与调控情况ꎬ为系统揭示
西瓜抗枯萎病分子机理奠定基础ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料
　 　 国际公认的抗枯萎病生理小种 １ 的西瓜品种
“卡红(Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ)”和西瓜专化型枯萎病菌
(Ｆ. ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｎｉｖｅｕｒｎ)１号生理小种均由国
家蔬菜工程技术研究中心许勇研究员惠赠ꎮ
１.２　 枯萎病菌接种
　 　 采用国际通用的苗期抗性接种鉴定方法—浸
根法[６]ꎬ对照接种蒸馏水ꎮ 接种后的 ０、６、１２、２４、
３６、４８ 和 ７２ ｈ 分别取根尖组织ꎬ液氮速冻ꎬ－８０℃
保存ꎮ
１.３　 ＳＳＨ￣ｃＤＮＡ正向文库的构建
　 　 采用植物总 ＲＮＡ提取试剂盒(天根生化科技
(北京)有限公司)分别提取对照和处理的根系总
ＲＮＡꎬ用 ｍＲＮＡ 纯化试剂盒(天根生化科技(北
京)有限公司)纯化 ｍＲＮＡꎬ１.５％琼脂糖凝胶电泳
检测总 ＲＮＡ和 ｍＲＮＡ的质量ꎮ 以处理 ｍＲＮＡ 为
Ｔｅｓｔｅｒꎬ对照 ｍＲＮＡ 为 Ｄｒｉｖｅｒꎬ按照 ＰＣＲ￣ＳｅｌｅｃｔＴＭ
ｃＤＮＡ Ｓｕｂｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ(Ｃｌｏｎｔｅｃｈ)说明书进行两次
差减杂交ꎮ 将 ＰＣＲ 产物转化到 ｐＭＤ１８￣Ｔｖｅｃｔｏｒ
(ＴａＫａＲａ)ꎬ随机挑选白色克隆接种到选择性 ＬＢ
液体培养基(含 Ａｍｐ)ꎬ利用菌液 ＰＣＲ 法检测插入
片段大小ꎮ
１.４　 差示筛选 ＳＳＨ ｃＤＮＡ文库
　 　 ＳＳＨ 文库中克隆依照 Ｒｏｃｈｅ 公司 ＤＩＧ Ｈｉｇｈ
Ｐｒｉｍｅ ＤＮＡ Ｌａｂｅｌｉｎｇ ａｎｄ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｔａｒｔｅｒ ＫｉｔⅠ进
行反向 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交验证ꎬ对照探针为接种蒸馏水
的双链 ｃＤＮＡꎬ处理探针为接种菌液的双链ｃＤＮＡꎮ
将只出现在处理探针杂交膜上或杂交信号强度高
于对照 ２倍以上的克隆视为阳性克隆ꎮ
１.５　 ＥＳＴ分析
　 　 随机挑取 ３００个阳性克隆测序ꎬ测序结果去除
载体后ꎬ将非冗余 ＥＳＴ 进行 ＢＬＡＳＴｘ 和 ＢＬＡＳＴｎ
同源性比对ꎬ比对结果显著性序列的判别标准参照
Ｌｉ等[７]的方法ꎬ并按照 Ｂｅｖａｎ 等[８]的植物基因功
能分类标准对结果进行功能注释、分类和分析ꎮ
３２
　
植物病理学报 ４５卷
１.６　 ＲＴ￣ＰＣＲ分析
　 　 提取枯萎病菌接种 ０、６、１２、２４、４８ 和 ７２ ｈ 的
根系总 ＲＮＡꎬ利用 ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐ ＩＩＩ ＲＴ ( Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ)
将其反转录为 ｃＤＮＡꎮ 利用 Ａｐｐｌｉｅｄ ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
(ＵＳＡ) ７５００ Ｆａｓｔ 测定水通道蛋白(Ａｑｕａｐｏｒｉｎ)和
过氧化物酶(Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ)基因表达量ꎬ内参为 １８Ｓ
ｒＲＮＡꎮ ＰＣＲ试剂购自 Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 公司ꎬ反应体系:
２.０ μＬ １０×ＰＣＲ Ｂｕｆｆｅｒꎬ２.０ μＬ Ｍｇ２＋ (２５ ｍＭ) ꎬ
０.５ μＬｄＮＴＰｓ (２５ ｍＭ)ꎬ上游和下游引物(见表 １ꎬ
１０μＭ)各 ０. ５ μＬꎬ１.０ μＬ ｃＤＮＡꎬ １.０ μＬ ＳＹＢＲ
(２０×)ꎬ０. ２ μＬ Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅꎬ补水至
２０ μＬꎮ 扩增条件: ９５℃ ２ ｍｉｎꎻ ９５℃ １０ ｓꎬ ６０℃
３０ ｓꎬ７０℃ ３０ ｓꎬ共 ３６ 个循环ꎮ １８Ｓ ｒＲＮＡ 退火温
度 ６０℃ꎬ３０ 个循环ꎻＡｑｕａｐｏｒｉｎ 和 Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ 退火
温度 ６０℃ꎬ３５ 个循环ꎮ 每组处理重复 ３ 次ꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｐｒｉｍｅｒ ｏｆ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅｓ
Ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒｓ
Ａｑｕａｐｏｒｉｎ
５′￣ＧＧＧＧＴＧＧＡＧＣＴＡＡＣＧＴＴＧＴＧ￣３′
５′￣ＴＧＧＣＧＧＡＧＡＡＧＡＣＧＧＴＧＴＡＡ￣３′
Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
５′￣ＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＧＣＴ￣３′
５′￣ＧＧＧＣＡＡＣＣＡＣＧＴＴＧＡＧＡＡＣＡ￣３′
１８Ｓ ｒＲＮＡ
５′￣ＣＡＴＣＣＡＡＧＧＡＡＧＧＣＡＧＣＡＧＧ￣３′
５′￣ＣＡＧＡＣＴＣＧＡＡＧＡＧＣＣＣＧＧＴＡ￣３′
　
１.７　 数据统计分析
　 　 将目的基因 ｃｔ 的平均值￣看家基因 ｃｔ 的平均
值作为零计算ꎬ实时荧光定量 ＰＣＲ 数据计算采用
２￣△△ ｃ ｔꎬ图 ５、６中纵坐标数值为平均值ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 西瓜根系总 ＲＮＡ和ｍＲＮＡ的质量检测
　 　 根系组织总 ＲＮＡ 共包含两清晰条带ꎬ其中
２８Ｓ 条带的亮度约为 １８Ｓ 的两倍以上 (图 １)ꎬ
Ａ２６０ / Ａ２８０ 值介于 １.８~２.０ꎬ表明总 ＲＮＡ无降解、
纯度高ꎬ纯化后 ｍＲＮＡ 呈弥散状ꎬ达到建库要求
(图 １)ꎬ双链 ｃＤＮＡ 呈弥散状且分布在 ０.２ ~ ４ ｋｂ
之间(图 ２)ꎬ表明合成的双链 ｃＤＮＡ质量高ꎮ
２.２　 ＳＳＨ文库构建
　 　 运用 ＳＳＨ技术进行正向差减杂交ꎬＳＳＨ￣ｃＤＮＡ
文库共获得 １ ４００ 余个克隆ꎮ 随机挑取白色克隆
进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ插入片段介于 ２００ ~ ８００ ｂｐ 之间
(图 ３)ꎬ平均为 ４００~５００ ｂｐꎬ表明构建的文库质量
较好ꎮ
Ｆｉｇ. １　 ＲＮＡ ａｎｄ ｍＲＮＡ ｏｆ ｒｏｏｔ ｔｉｓｓｕｅｓ ｆｒｏｍ
ｔｅｓｔｅｒ ａｎｄ ｄｒｉｖｅｒ
Ｄｒｉｖｅｒ: Ｒｏｏｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒꎻ Ｔｅｓｔｅｒ: Ｒｏｏｔ
ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒａｃｅ １. Ｌａｎｅ１:
Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ｔｅｓｔｅｒꎻ Ｌａｎｅ ２: Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ ｏｆ ｄｒｉｖｅｒꎻ Ｌａｎｅ ３:
Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｏｆ ｔｅｓｔｅｒꎻ Ｌａｎｅ ４: Ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｏｆ ｄｒｉｖｅｒ.
Ｆｉｇ. ２ 　 Ｄｏｕｂｌｅ ｓｔｒａｎｄｅｄ ｃＤＮＡ ｏｆ ｔｅｓｔｅｒ ａｎｄ
ｄｒｉｖｅｒ
Ｌａｎｅ １: ｄｓ ｃＤＮＡ ｏｆ ｔｅｓｔｅｒꎻ Ｌａｎｅ ２: ｄｓ ｃＤＮＡ ｏｆ ｄｒｉｖｅｒ.
２.３　 差示筛选 ＳＳＨ￣ｃＤＮＡ文库结果
　 　 对经菌液 ＰＣＲ法鉴定过的克隆进行点阵膜杂
交筛选ꎬ通过比较信号强度ꎬ确定只出现在处理探
针杂交膜上或是杂交信号强度高于对照 ２ 倍以上
为阳性克隆ꎬ图 ４为部分克隆的检测结果ꎮ
４２
　
　 １期 李 猷ꎬ等:西瓜与枯萎病菌非亲和互作相关基因的分离及表达分析
Ｆｉｇ. ３　 Ｓｏｍｅ ＰＣＲ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｒｅｓｕｌｔｓ ｏｆ ＳＳＨ ｌｉｂｒａｒｙ
Ｍ: ＤＮＡ Ｍａｒｋｅｒꎬ ＤＭ２０００ꎻ １￣１７: Ｉｎｓｅｒｔ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ.
Ｆｉｇ. ４　 Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｌｏｎｅｓ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ
Ｃｏｎｔｒｏｌ ｐｒｏｂｅ: ｄｓ ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ ｒｏｏｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｄｉｓｔｉｌｌｅｄ ｗａｔｅｒꎻ
Ｔｒｅａｔｍｅｎｔ ｐｒｏｂｅ: ｄｓ ｃＤＮＡ ｆｒｏｍ ｒｏｏｔ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｒａｃｅ １.
２.４　 ＥＳＴ获得和分析
　 　 随机挑取 ３００个阳性克隆测序ꎬ去除测序失败
的样品、空载体、片段小于 １００ ｂｐ 的序列ꎬ共获得
２５９个高质量 ＥＳＴｓꎮ ＢＬＡＳＴｎ 和 ＢＬＡＳＴｘ 比对发
现 １６７条 ＥＳＴｓ与已知基因有较高同源性ꎬ占全部
ＥＳＴｓ的 ６５.５％ꎬ其中与抗病、防卫相关的有 ６４ 条
２３种ꎬ占 ２４.７％ꎻ功能未知的 ＥＳＴｓ有 ９２条ꎮ
　 　 分析 ＥＳＴꎬ可以看到表 ２所列抗病相关基因包
含抗病反应的主要过程ꎬ包括信号类、信号传导、离
子通道成分、过敏反应和系统抗性获得等ꎬ但是抗
病相关基因主要集中在系统获得抗性反应中ꎬ如过
氧化物酶、泛素、类伸展蛋白等ꎮ 除了对抗病相关
的功能进行分析外ꎬ我们对这些抗病相关基因的出
现频率进行了统计(表 ２)ꎬ结果表明ꎬ不同功能的
基因出现的频率差别较大ꎬ出现频率最高的是半胱
氨酸蛋白酶( ｓｙｓｔｅｉｎｅ ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ)基因达 １５ 次ꎬ其
次是延伸因子 １α( ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ １￣ａｌｐｈａ)为 ６
次ꎬ再次为 ＤＥＡＤ 盒 ＲＮＡ 解旋酶 (ＤＥＡＤ ｂｏｘ
ＲＮＡ ｈｅｌｉｃａｓｅ )、Ｓ￣腺苷甲硫氨酸脱羧酶(Ｓ￣ａｄｅｎｏ￣
ｓｙｌｍｅｔｈｉｏｎｉｎｅ ｄｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ)、Ｋｕｎｉｔｚ型蛋白酶抑制
剂(Ｋｕｎｉｔｚ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ)均出现 ４次ꎬ多聚
泛素( ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ)和 ＷＲＫＹ 蛋白(ＷＲＫＹ ｐｒｏ￣
ｔｅｉｎ)出现 ３次ꎮ
２.４.１　 参与西瓜和枯萎病菌非亲和互作的转录因
子　 植物识别病原菌后ꎬ通过一系列信号传递过
程ꎬ诱导相关防卫反应基因的表达ꎬ转录因子在此
过程中起着重要的作用[２]ꎮ 本研究表明ꎬ枯萎病菌
诱导大量编码转录因子基因的表达ꎬ如 ＷＲＫＹ 和
５２
　
植物病理学报 ４５卷
ＭＹＢ家族ꎬ是被公认与植物抗病相关的转录因子ꎮ
　 　 序列 ＣＨ２３５ 与 Ｍｙｂ 基因同源ꎮ Ｍｙｂ 基因在
植株中的过表达能够显著提高植物的抗病能力ꎬ并
具有一定的广谱效应ꎬ西瓜[２]、拟南芥[９]、金鱼
草[１０]、烟草[１１]、玉米[１２]种的类 ＭＹＢ 转录因子调
控相关下游抗病功能基因的过量表达ꎬ减轻病原菌
对植物造成的伤害ꎮ
　 　 序列 ＣＨ０８７ 与 ＷＲＫＹ 基因同源ꎮ ＷＲＫＹ 基
因家族参与调控植物的防卫反应和信号转导途径ꎬ
其家族成员广泛参与植物的抗病防卫反应包括正
调控抗病反应和负调控抗病反应[１３]ꎮ 多项研究表
明ꎬ当植物受到不同病原ꎬ如病毒、细菌、真菌和卵
菌侵染以及防御信号物质诱导时ꎬＷＲＫＹ 基因的
转录、蛋白合成及结合活性都有显著变化[１４]ꎬ从而
调节不同的抗性反应ꎮ
２.４.２　 参与西瓜与枯萎病菌非亲和互作的激酶　 ＳＳＨ￣
ｃＤＮＡ 文库序列注释得到大量激酶的 ＥＳＴ(表 ２)ꎬ
例如ꎬ序列 ＣＨ０８５、ＣＨ２３６和 ＣＨ１５８代表的基因分
别与甘油激酶、酸性磷酸酶、钙调素酶基因同源ꎮ
蛋白激酶在蛋白质磷酸化过程中起中介和放大作
用ꎬ并帮助完成信号传递过程ꎮ 甘油激酶催化甘油
变成 ３￣磷酸甘油ꎬ甘油促进子和甘油激酶之间存
在着一种相互作用刺激激酶的活性[１５]ꎮ 酸性磷酸
酶是植物体和土壤中普遍存在的一种非常重要的
水解酶ꎬ在调控植物磷营养方面有着非常重要的作
用[１６]ꎮ ＣａＭ是一类重要的 Ｃａ２＋传感器蛋白ꎬ可以
通过与其下游的 ＣａＭ 结合蛋白(ＣａＭＢＰ)作用而
调节细胞的生理功能[１７]ꎮ
２.４.３　 防卫相关基因 　 类伸展蛋白( ｅｘｔｅｎｓｉｎ￣ｌｉｋｅ
ｐｒｏｔｅｉｎ)是植物细胞壁中主要的蛋白质成分ꎬ在防
卫反应中首先作为病原物质侵入和扩展的屏障ꎬ其
次参与植物防卫反应的细胞壁木质化过程[１８]ꎬ其
在病虫诱导的植物 ＳＳＨ文库中均有表达[１９ꎬ２０ꎬ２１] ꎮ
　 　 过氧化物酶(ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅꎬＰＯＤ)分布在植物组
织的不同细胞中ꎬ在细胞壁中比较丰富[２２]ꎬ它无直
接的抗菌活性ꎬ但它可以通过影响植物体内多种代
谢途径而在抗病中起间接作用[２３]ꎮ Ｓｙｓｔｅｉｎｅ
ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ(半胱氨酸蛋白酶) [２４]、ＤＥＡＤ ｂｏｘ ＲＮＡ
ｈｅｌｉｃａｓｅ(解旋酶) [２５]、ｐｏｌｙｕｂｉｑｕｉｔｉｎ(多聚泛素) [２６]、
ｐｒｏｌｉｎｅ￣ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ(富脯氨酸蛋白) [２７]、ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ
ｐｒｏｔｅｉｎ(锌指蛋白) [２８]均参与逆境胁迫响应ꎬ使植
物适应不同的逆境ꎮ
　 　 植物水通道蛋白( ａｑｕａｐｏｒｉｎꎬＡＱＰｓ)对于提高
植物抗逆性发挥着重要作用ꎮ 例如ꎬ接种根结线虫
后ꎬ烟草根液泡膜水通道蛋白基因 ＴｏｂＲＢ７ 在根系
取食位点被特异诱导表达ꎬ转基因表明其在取食位
点特定表达[２９]ꎮ
２.５　 水通道蛋白和过氧化物酶基因在不同时期的
ＲＴ￣ＰＣＲ 表达分析
　 　 水通道蛋白和过氧化物酶基因在接种后 ７２ ｈ
内均比 ０ ｈ 的表达量有不同程度增强ꎬ总体呈上升
趋势ꎬ并在 ７２ ｈ 时表达量均达到最大值ꎬ约为 ０ ｈ
的４.５倍(图５、６) ꎬ表明水通道蛋白和过氧化物酶
Ｆｉｇ. ５　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ａｑｕａｐｏｒｉｎ
ｇｅｎｅ ｉｎ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｒｏｏｔ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａ￣
ｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｒａｃｅ １ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲ
Ｆｉｇ. ６　 Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｌｅｖｅｌ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ
ｇｅｎｅ ｉｎ ｗａｔｅｒｍｅｌｏｎ ｒｏｏｔ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａ￣
ｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｗｉｌｔ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ
ｒａｃｅ １ ｂｙ ＲＴ￣ＰＣＲ
６２
　
　 １期 李 猷ꎬ等:西瓜与枯萎病菌非亲和互作相关基因的分离及表达分析
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植物病理学报 ４５卷
　
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　 １期 李 猷ꎬ等:西瓜与枯萎病菌非亲和互作相关基因的分离及表达分析
　
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９２
　
植物病理学报 ４５卷
基因均参与了枯萎病胁迫的响应ꎬ在对病原菌的防
卫过程中发挥着重要作用ꎮ
３　 讨论
　 　 本研究构建了枯萎病菌 １ 号生理小种诱导
Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ 的 ＳＳＨ 文库ꎬ通过对文库中部分
ＥＳＴｓ进行序列测定和分析ꎬ获得抗病信号传导、抗
病防卫、基础代谢、转录因子、次生代谢等基因ꎬ这
与枯萎病生理小种 １诱导野生西瓜 ＰＩ２９６３４１ 表达
的基因种类基本一致[２]ꎬ说明 Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ 与
ＰＩ２９６３４１对枯萎病菌侵染作出的反应均是全方位
多方面的ꎮ 由于部分测序结果所获得的信息不够
全面ꎬ所以我们还未获得核苷酸结合位点￣富含亮
氨酸重复序列( ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ ｒｅｐｅａｔ￣ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｂｉｎｄ￣
ｉｎｇ ｓｉｔｅꎬ ＬＲＲ￣ＮＢＳ)类、丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶
(ｓｅｒｉｎｅ / ｔｈｒｅｏｎｉｎｅ ｋｉｎａｓｅｓ)类和 ＬＲＲ ( ｌｅｕｃｉｎｅ ｒｉｃｈ
ｒｅｐｅａｔ)类抗病基因ꎬ但从这些有限的信息可以粗略
地了解 Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ与野生西瓜 ＰＩ２９６３４１在与枯
萎病生理小种 １互作中差异表达的基因ꎬ例如水通
道蛋白、Ｋｕｎｉｔｚ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ等是本研究特
有的ꎮ 有研究表明ꎬ在逆境条件下ꎬ转录水平以及
蛋白质水平上大多数水通道蛋白基因表达下降ꎬ水
通道活性下降甚至消失ꎬ 因而植物可以通过维持
水分平衡来增加对胁迫因子的耐受能力[４１]ꎮ 本研
究表明ꎬ水通道蛋白基因在接种后 ７２ ｈ内均比 ０ ｈ
的表达量有不同程度增强ꎬＯｐｐｅｒｍａｎ[２８]也发现根
结线虫胁迫可诱导烟草根液泡膜水通道蛋白基因
ＴｏｂＲＢ７在根系取食位点表达ꎬ说明水通道蛋白基
因可能在生物胁迫所导致的抗病反应过程中发挥
重要作用ꎮ Ｋｕｎｉｔｚ 型胰蛋白酶抑制剂属于典型的
丝氨酸蛋白酶抑制剂ꎬ其生理功能至少包括保护储
存蛋白、调节内源蛋白酶的活性、保护个体免受昆
虫和病原体的侵害[４２]ꎮ 据此推测这可能是
Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ 不同于 ＰＩ２９６３４１ 抗枯萎病机制的部
分因子ꎮ
　 　 在抗病反应中发现蛋白酶抑制剂的报道较多ꎬ
本研究中这类物质出现较少ꎬ却发现了出现次数多
的蛋白酶ꎬ如半胱氨酸蛋白酶达 １５次ꎬ该现象同样
在小麦抗白粉病 ＳＳＨ 文库有报道[４２]ꎬ可能与本研
究仅分析了约 ２０％序列有关ꎬ也有可能与 Ｃａｌｈｏｕｎ
Ｇｒａｙ 具有不同与 ＰＩ２９６３４１ 的抗病机制有关ꎮ 为
了更全面、 详尽地了解枯萎病生理小种 １ 侵染后
Ｃａｌｈｏｕｎ Ｇｒａｙ 基因表达模式ꎬ对 ＳＳＨ 文库的大规
模测序工作正在进行中ꎮ
　 　 致谢:国家蔬菜工程技术研究中心许勇研究员
惠赠西瓜专化型枯萎病菌 １ 号生理小种ꎬ 在此表
示感谢ꎮ
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ｃｕｌｔｉｖａｒ: ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇ ａｎａｌｙｓｉｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ
ｇｅｎｅｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ ｆｕｎｇａｌ ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ [ Ｊ] . Ｆｕｎｇａｌ
Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ ４１: ７３５－７５３.
０３
　
　 １期 李 猷ꎬ等:西瓜与枯萎病菌非亲和互作相关基因的分离及表达分析
[８] 　 Ｂｅｖａｎ Ｍꎬ Ｂａｎｃｒｏｆｔ Ｉꎬ Ｂｅｎｔ Ｅꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ １.９
Ｍｂ ｏｆ ｃｏｎｔｉｇｕｏｕｓ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｆｒｏｍ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ４ ｏｆ
Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ [ Ｊ] . Ｎａｔｕｒｅꎬ １９９８ꎬ ３９１: ４８５ －
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[９] 　 Ｂｙｒｎｅ Ｍ Ｅꎬ Ｂａｒｌｅｙ Ｒꎬ Ｃｕｒｔｉｓ Ｍꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ
ｌｅａｖｅｓ ｍｅｄｉａｔｅｓ ｌｅａｆ ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ ａｎｄ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ
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[１０] Ｗａｉｔｅｓ Ｒꎬ Ｓｅｌｖａｄｕｒａｉ Ｈ Ｒꎬ Ｏｌｉｖｅｒ Ｉ Ｒꎬ ｅｔ ａｌ. Ｔｈｅ
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ａｎｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＣａＭ￣ｌｉｋｅ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ
(ＢｏＣＭＬ４９) ｆｒｏｍ ｃａｂｂａｇｅ (Ｂｒａｓｓｉｃａ ｏｌｅｒａｃｅａ Ｌ. ｖａｒ.
ｃａｐｉｔａｔａ) ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ａｇｒｏｎｏｍｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ
(作物学报)ꎬ ２０１２ꎬ ３８(１２): ２１６２－２１６９.
[１８] Ｌｉｕ Ｊ Ｊꎬ Ｄｅｎｇ Ｚ Ｙ. Ｓｔｕｄｙ ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｏｆ ｔｈｅ ｅｘｔｅｎｓｉｎ ( ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ａｍｉｎｏ Ａｃｉｄｓ ＆Ｂｉｏｔｉｃ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ (氨基
酸和生物资源)ꎬ ２００３ꎬ ２５(３): ２０－２３.
[１９] Ｚｈａｉ Ｈꎬ Ｓｈａｎｇ Ｌ Ｌꎬ Ｌｉｕ Ｑ Ｃ. Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ＳＳＨ
ｃＤＮＡ ｌｉｂｒａｒｙ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ｄｉｔｙｌｅｎｃｈｕｓ ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ ｉｎ
ｓｗｅｅｔ ｐｏｔａｔｏ ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｉｔｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｔａｇｓ
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ￣
ｇｙ (农业生物技术学报)ꎬ ２０１０ꎬ １８ (１):１４１－１４８.
[２０] Ｌｅｇａｙ Ｙ Ｇꎬ Ｍａｒｏｕｆ Ｅꎬ Ｂｅｒｇｅｒ Ｄꎬ ｅｔ ａｌ. Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｎｔｉｏｎ
ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｄｕｒｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ
ｇｒａｐｅｖｉｎｅ ｗｉｔｈ Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ ｔｈｒｏｕｇｈ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ (ＳＳＨ) [ Ｊ] . Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒ￣
ｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ ２０１１ꎬ１２９:２８１－３０１.
[２１] Ｔｉｒｕｍａｌａｒａｊｕ Ｓ Ｖꎬ Ｊａｉｎ Ｍꎬ Ｇａｌｌｏ Ｍ. Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｇｅｎｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｒｏｏｔｓ ｏｆ ｎｅｍａｔｏｄｅ￣ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ａｎｄ ｓｕｓｃｅｐｔｉ￣
ｂｌｅ ｐｅａｎｕｔ (Ａｒａｃｈｉｓ ｈｙｐｏｇａｅａ) ｃｕｌｔｉｂｖａｒｓ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ
ｔｏ ｅａｒｌｙ ｓｔａｇｅｓ ｏｆ ｐｅａｎｕｔ ｒｏｏｔ￣ｋｎｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ (Ｍｅｌｏｉｄｏ￣
ｇｙｎｅ ａｒｅｎａｒｉａ) ｐａｒａｓｉｔｉｚａｔｉｏｎ [ Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｓｉｏｌｏｇｙꎬ
２０１１ꎬ １６８(５): ４８１－４９２.
[２２] Ｓｏｎｇ Ｆ Ｍꎬ Ｚｈｅｎｇ Ｚꎬ Ｇｅ Ｘ Ｃ. Ｒｏｌｅ ｏｆ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｉｎ
ｔｈｅ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｏｆ ｃｏｔｔｏｎ ｓｅｅｄｌｉｎｇｓ ｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｏｘｙｓｐｏ￣
ｒｕｍ ｆ. ｓｐ. ｖａｓｉｎｆｅｃｔｕｍ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ (浙江农业大学学
报)ꎬ １９９７ꎬ (２): ３５－４０.
[２３] Ｄｅａｎ Ｒ Ａꎬ Ｋｕｃ Ｊ Ａ. Ｒａｐｉｄ ｌｉｇｎｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｐｏｎｓｅ ｔｏ
ｗｏｕｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ ａｓ ａ ｍｅｃｈａｎｉｓｍ ｆｏｒ ｉｎｄｕｃｅｄ
ｓｙｓｔｅｍｉｃ ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ [ Ｊ] . Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ １９８４ꎬ ３１: ６９－８１.
[２４] Ｇｏｎｇ Ｚꎬ Ｄｏｎｇ Ｃ Ｈꎬ Ｌｅｅ Ｈꎬ ｅｔ ａｌ. Ａ ＤＥＡＤ ｂｏｘ ＲＮＡ
ｈｅｌｉｃａｓｅ ｉｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｆｏｒ ｍＲＮＡ ｅｘｐｏｒｔ ａｎｄ ｉｍｐｏｒｔａｎｔ ｆｏｒ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ ｓｔｒｅｓｓ ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ [ Ｊ] .
Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌꎬ ２００５ꎬ １７: ２５６－２６７.
[２５] Ｂｏｖｉｅ１ Ｃꎬ Ｏｎｇｅｎａ Ｍꎬ Ｔｈｏｎａｒｔ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃＤＮＡｓ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ｔｏ ｇｅｎｅｓ
ａｃｔｉｖａｔｅｄ ｉｎ ｃｕｃｕｍｂｅｒ ｓｈｏｗｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍｉｃ ａｃｑｕｉｒｅｄ
ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ａｆｔｅｒ ＢＴＨ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ [ Ｊ ] . ＢＭＣ Ｐｌａｎｔ
Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００４ꎬ ４: １５.
[２６] Ｃｈａｉ Ｔ Ｙꎬ Ｚｈａｎｇ Ｙ Ｘ. Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ａ
ｐｒｏｌｉｎｅ￣ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｂｅａｎ ｕｎｄｅｒ ｂｉｏｔｉｃ ａｎｄ ａｂｉｏｔｉｃ
ｓｔｒｅｓｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ Ｂｏｔａｎｉｃａ Ｓｉｎｉｃａ (植物
学报)ꎬ １９９９ꎬ ４１(１):１１１－１１３.
[２７] Ｘｉａｎｇ Ｊ Ｈꎬ Ｌｉ Ｌ Ｚ. Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｔｕｄｙ ｏｆ ａｂｉｏｔｉｃ
ｓｔｒｅｓｓ￣ｒｅｌａｔｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ( ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｎｕｃｌｅａｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ
１３
　
植物病理学报 ４５卷
(核农学报)ꎬ ２０１２ꎬ ２６(４):０６６６－０６７２.
[２８] Ｏｐｐｅｒｍａｎ Ｃ Ｈꎬ Ｔａｙｌｏｒ Ｃ Ｇꎬ Ｃｏｎｋｌｉｎｇ Ｍ Ａ. Ｒｏｏｔ￣
ｋｎｏｔ ｎｅｍａｔｏｄｅ ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａ ｐｌａｎｔ ｒｏｏｔ￣ｓｐｅ￣
ｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅ [Ｊ] . Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ １９９４ꎬ ２６３:２２１－２２３.
[２９] Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ Ｔꎬ Ｙａｍａｄａ Ｋꎬ Ｈｉｒａｉｗａ Ｎꎬ ｅｔ ａｌ. Ｖａｃｕｏｌａｒ
ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ ｉｓ ｕｐ￣ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｌｙｔｉｃ ｖａｃｕｏｌｅｓ
ｏｆ ｖｅｇｅｔａｔｉｖｅ ｔｉｓｓｕｅｓ ｄｕｒｉｎｇ ｓｅｎｅｓｃｅｎｃｅ ａｎｄ ｕｎｄｅｒ
ｖａｒｉｏｕｓ ｓｔｒｅｓｓｅｄ ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ [ Ｊ] . Ｔｈｅ Ｐｌａｎｔ Ｊｏｕｒｎａｌꎬ
１９９９ꎬ １９(１)ꎬ ４３－５３.
[３０] Ｋｙａｉｎｇ Ｍ Ｓꎬ Ｇｕ Ｌ ＪꎬＣｈｅｎｇ Ｈ Ｍ. Ｔｈｅ ｒｏｌｅ ｏｆ ｎｉｔｒａｔｅ
ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ａｎｄ ｎｉｔｒｉｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ｉｎ ｐｌａｎｔ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ)
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[３１] Ａｒｓｅｎｉｊｅｖｉｃ￣Ｍａｋｓｉｍｏｖｉｃ Ｉꎬ Ｂｒｏｕｇｈｔｏｎ Ｗ Ｊꎬ Ｋｒａｕｓｅ Ａ.
Ｒｈｉｚｏｂｉａ ｍｏｄｕｌａｔｅ ｒｏｏｔ￣ｈａｉｒ￣ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｅｘ￣
ｔｅｎｓｉｎ ｇｅｎｅｓ[Ｊ] . Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｌａｎｔ￣Ｍｉｃｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓꎬ
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[３２] Ｃｈｅｎｇ Ｙ Ｘꎬ Ｙａｎｇ Ｒ. Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＮＡＤＰ￣ｍａｌｉｃ ｅｎｚｙｍｅ
ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ Ｐｏｐｕｌｕｓ ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ Ｔｏｒｒ. ＆ Ｇｒａｙ ( ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ Ｊｏｕｒｎａｌ(植物生理学
报)ꎬ ２０１１ꎬ ４７ (３): ２４９－２５５.
[３３] Ｌｉｕ Ｄ Ｑꎬ Ｗａｎｇ Ｊ Ｌꎬ Ｇｅ Ｆꎬ ｅｔ ａｌ. Ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ ｔｈｅ
ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ ( ｉｎ Ｃｈｉ￣
ｎｅｓｅ)[Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｙ (生物学杂志)ꎬ ２００９.
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[３４] Ｌｉｕ Ｄ Ｌ. Ｈｅａｔ￣ｓｈｏｃｋ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｆｕｎｃ￣
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[３５] Ｗａｎｇ Ｆꎬ Ｄｏｎｇ Ｌꎬ Ｌｉｎ Ｂꎬ ｅｔ ａｌ. Ｐｌａｎｔ ａｑｕａｐｏｒｉｎｓ ａｎｄ
ｔｈｅｉｒ ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ (安徽农业科学 )ꎬ
２００８ꎬ ３６(５): １７６３－１７６６.
[３６] Ｅｄｍｏｎｄｓ Ｂ Ｔꎬ Ｗｙｃｋｏｆｆ Ｊꎬ Ｙｅｕｎｇ Ｙ Ｇꎬ ｅｔ ａｌ. Ｅｌｏｎｇａ￣
ｔｉｏｎ ｆａｃｔｏｒ￣１ａ ｉｓ ａｎ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ａｃｔｉｎ ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ
ｉｎ ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ ｒａｔ ｍａｍｍａｒｙ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ. Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ
Ｃｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅꎬ １９９６ꎬ １０９: ２７０５－２７１４.
[３７] Ｌｉ Ｆ Ｍꎬ Ｇａｉ Ｘ Ｍ. Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｙｓｔａｔｉｎ
( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｈｕｉ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｓｃｉ￣
ｅｎｃｅｓ (安徽农业科学)ꎬ ２０１０ꎬ ３８(１０): ４９７２－４９７４.
[３８] Ｚｈａｎｇ Ｙ Ｇꎬ Ｈｕａｎｇ Ｙꎬ Ｓｏｎｇ Ｙ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ
ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｋｕｎｉｔｚ ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｉｎ ｐｌａｎｔｓ ( ｉｎ
Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ (生物技术通
报)ꎬ ２０１１ꎬ (１２):１０２－１０７.
[３９] Ｓｔｒａｃｋｅ ＲꎬＷｅｒｂｅｒ Ｍꎬ Ｗｅｉｓｓｈａａｒ Ｂ. Ｔｈｅ Ｒ２Ｒ３￣ＭＹＢ
ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ ｉｎ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ｔｈａｌｉａｎａ [ Ｊ ] . Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ Ｐｌａｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙꎬ ２００１ꎬ ４: ４４７－４５６.
[４０] Ｔｈｅｏｌｏｇｉｓ Ａꎬ Ｅｃｋｅｒ Ｊ Ｒꎬ Ｐａｌｍ Ｃ Ｊꎬ ｅｔ ａｌ. Ｓｅｑｕｅｎｃｅ
ａｎｄ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ １ ｏｆ ｔｈｅ ｐｌａｎｔ Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ
ｔｈａｌｉａｎａ [Ｊ] . Ｎａｔｕｒｅꎬ ２０００ꎬ ４０８(６８１４):８１６－８２０.
[４１] Ｌｕｏ Ｙ Ｊꎬ Ｌｉ Ｂꎬ Ｓｈｕ Ｈ Ｐꎬ ｅｔ ａｌ. Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｄｖａｎｃｅｓ ｉｎ
Ｋｕｎｉｔｚ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｃｈ￣ｅｍｉｃａｌ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ (中国生化药
物杂志)ꎬ ２０１２ꎬ (３): ３１６－３１９.
[４２] Ｌｕｏ Ｍꎬ Ｋｏｎｇ Ｘ Ｙꎬ Ｈｕｏ Ｘ Ｎꎬ ｅｔ ａｌ. Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ ｒｅｌａｔｅｄ ｔｏ ｐｏｗｄｅｒｙ ｍｉｌｄｅｗ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ｗｈｅａｔ
ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ ｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅ ｈｙｂｒｉｄｉｚａ￣
ｔｉｏｎ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [Ｊ] . Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ(科学
通报)ꎬ ２００２ꎬ ４７(１６):１２３７－１２４１.
责任编辑:李晖
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