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Ultrastructure of Pollen and Observation on Pollen Tube Growth in Cypripedium japonicum

扇脉杓兰花粉超微结构及花粉管生长的观察



全 文 :书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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&修改稿收到日期$
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基金项目$国家自然科学基金"
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#
作者简介$闫晓娜"
#&1&
#!女!在读硕士研究生!主要从事兰花生殖生物学研究
2)34.5
$
6
407.4804
(
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#,%+983
"
通信作者$田
!
敏!博士!副研究员!硕士生导师!主要从事野生兰保护生物学研究
2)34.5
$
:3.0##(
!
#,%+983
扇脉杓兰花粉超微结构及花粉管生长的观察
闫晓娜!田
!
敏"!王彩霞
"中国林业科学研究院亚热带林业研究所!浙江富阳
%##$""
#

!
要$为明确扇脉杓兰花粉形态结构及雄性生殖特性!利用扫描电镜)透射电镜和荧光显微镜对花粉形态和超微
结构及花粉管生长过程进行观察结果表明$"
#
#扇脉杓兰单粒花粉长球形!表面光滑无特征纹饰!有少量胶黏物
质!一些表面有
!
个或以上的深凹陷!凹陷内有球形突起的内容物"
!
#花粉壁分为由棒状的基柱小单元组成的外
壁和纤维素果胶组成的内壁!有覆盖层&生殖细胞近圆形!细胞核大而致密&营养细胞多弧形!核质分散&花粉粒细
胞质含有大量的线粒体)质体和小泡等细胞器!淀粉)蛋白质和多糖含量丰富"
%
#花粉管萌发后沿子房壁方向伸
长!授粉
!";
花粉管伸长生长并不明显!授粉
%";
伸长的花粉管中出现大量胼胝质塞!并且伸长方向转为胚珠中
间!花粉管逐渐接近胚珠!在授粉后
(";
基本完成受精作用研究认为!扇脉杓兰花粉发育正常!不阻碍有性生殖
过程
关键词$扇脉杓兰&花粉&超微结构&花粉管生长&荧光显微镜
中图分类号$
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文献标志码$
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兰科"
YI9J.;49H4H
#是单子叶植物中最大的科!
全世界约有
#"""

!""""
余种!广布全球*#+中
国具有丰富的兰花资源!其中以杓兰属"
!
"#
$%
#
&0
%()Z+
#为代表的多种野生兰花是世界级的花卉
名品杓兰属因花大艳丽!花形奇特而著称!唇瓣特
化为深囊状!具有极高的观赏价值*!+扇脉杓兰
"
!
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*
+
#
,-%.() AJK0N+
#为杓兰亚科
"
F
6O
I.
O
H;.8.;H4H
#杓兰属多年生草本植物!主要分
布于东亚!中国产浙江)安徽)江西)四川和台湾等
地!生于海拔
#"""
"
!"""3
的林下)灌木林缘或
草坡隐蔽处*%+!以根状茎和带根全草入药!可治疗跌
打损伤!是兼有药用价值和观赏价值的温带地生兰
自然状态下!扇脉杓兰主要依赖无性生殖繁衍
后代!结实率低下!有性生殖能力较差!实生苗稀少!
其野生居群处于濒危状态!在
#&&,
年,中华人民共
和国野生植物保护条例-中被列为
#
级保护植物
近几年!针对扇脉杓兰的濒危机制已开展传粉生态
学)居群生态学)遗传多样性)生殖生物学等层次的
研究*$)&+生殖生物学是濒危植物保护研究的一个
重要方面!其中花芽分化)繁育系统)性细胞生成)传
粉)受精)胚胎发生和种子形成等任一环节出现衰退
或削弱的现象!都会阻碍植物正常发育进程
种子植物的花粉是雄性遗传信息的载体花药
壁)膜系统)胞质)小孢子之间紧密联系!不仅保证营
养物质的流通!更提高了花粉活力!维持花粉的正常
发育*#"+兰科植物花粉通常在成熟时粘合成一个
整体...花粉块扇脉杓兰的花粉粘结为未蜡质化
的花粉块!是杓兰属中粘质花粉与蜡质花粉的中间
进化类型*!!&+本研究从雄配子体生成)传粉)受精
等生殖环节对扇脉杓兰花粉亚细胞结构和花粉管生
长过程进行了观察!旨在揭示其雄性生殖特性!观察
野生扇脉杓兰花粉发育过程中出现的退化或异常表
现!探究自然状态下有性生殖过程受限制的因素!为
进一步深入研究扇脉杓兰保育提供理论依据
#
!
材料和方法
:+:
!
试验材料
供试材料取自浙江省临安市境内天目山国家级
自然保护区内"
##&[!%\$*]
"
##&[!1\!*]2
!
%"[#1\%"]
"
%"[!$\((]?
#的
!
个野生扇脉杓兰居群!分别记为
居群
#

!
居群
#

*"
株!地理坐标为
##&[!(%(+!]2
!
%"[#1\%"]?
!海拔
#"%%3
&居群
!
位置是
##&[(*\,+$]2
!
%"[%\%,+%]?
!海拔
#"#13
!约
("

于盛花期采集花粉块
!"
个!进行扫描电镜和透射电
镜的观察采样时间为
!"#$

$

!%
日!并于当
日进行人工授粉定期采集授粉后不同发育时期的
子房
*
个!进行花粉管生长的荧光显微观察
:+;
!
研究方法
:+;+:
!
扫描电镜观察
!
花粉块采集当天!经
B^)(
型离子溅射仪喷金后!置于
_.:49J.AC)#"""
型扫
描电镜中观察拍照
:+;+;
!
透射电镜观察
!
盛花期采集花粉块!置于
!+(`
戊二醛溶液中
$a
固定过夜!磷酸缓冲液冲洗
%
次后!
#`
的锇酸再固定
#
"
!J
!梯度酒精脱水!环
氧丙烷过渡!树脂浸透和包埋将处理好的样品先
用玻璃刀作半薄切片"厚
!
$
3
#确定位置!再用钻石
刀作超薄切片"厚
1"03
#!铜网收集!经醋酸双氧铀
("`
乙醇饱和溶液和柠檬酸铅双染!在
_.:49J._)
*,("
型透射电镜中观察并拍照
:+;+<
!
荧光显微镜观察
!
授粉后每
#";
采集
#

发育中的子房切成
%
"
(33
的小段!卡诺固定液
"
&(`
酒精
b
冰醋酸
c%b#
#
$a
固定
!
"
!$J
!经
1
385
/
Z
#
?4Y_
溶液透明和软化
$J
后!将样品置
于载玻片上用
"+#`
苯胺蓝溶液染色
#J
!
("`
甘油
溶液封片!镊子稍加压力!使子房展开!最后用
ZH.94
WC$"""^
荧光显微镜在紫外光源激发下观察花粉
管生长过程
:+;+=
!
组织化学染色
!
组织化学染色方法参照,植
物显微技术-!组织切片采用石蜡切片法*##+将取
回的花粉块用
P==
固定过夜!多糖鉴定采用
V=M
反应"高碘酸
)M9J.LL
反应#!颜色由无色变为紫红
色&淀粉采用碘
)
碘化钾法!变为紫色&蛋白质亦采用

)
碘化钾法!药品配方与前者不同!含蛋白质的细
胞呈现亮黄色&脂肪测定用苏丹
%
!颜色变为橙
黄色
!
!
结果与分析
;+:
!
花粉微形态观察
扇脉杓兰的花粉在扫描电镜下呈现不规则分布
状态!花粉粒间排列疏松!单粒花粉散落或几个单粒
花粉被粘性物质粘成花粉小块"图版
&
!
#
)
!
#花粉
形态各不相同!大小差异并不明显花粉近长球形!
"$$!
西
!

!

!

!

!

!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$

一些花粉表面有
!
个或更多的圆形深凹陷单粒花
粉外表面大多较为光滑!无特征纹饰!或无或有少量
胶粘物质而有深凹陷的花粉表面存在许多褶皱!
凹陷内部有球形突起的内容物"图版
&
!
%
"
,
#随
着花粉发育成熟!部分凹陷逐渐变浅
;+;
!
花粉粒的超微结构
;+;+:
!
花粉壁结构
!
扇脉杓兰花粉壁电子密度不
同!可明显区分为
!
层!即外壁和内壁外壁又分为
外层和内层!主要由孢粉素组成外壁外层较厚!具
覆盖层和棒状层!由棒状的基柱小单元组成外壁
内层是基足层!与棒联结内壁电子密度较低!一般
较薄!主要由果胶质和纤维素组成"图版
&
!
*
)
1
#
单粒花粉壁之间未发现有胞间连丝存在!花粉粒排
列并不连续!这与扫描电镜观察结果一致花粉粒
之间存在圆形的分泌物!其中含有一个大液泡和若
干分泌小泡等细胞器"图版
&
!
&
)
#"
#!这可能是绒毡
层降解的残留物或是联结相邻花粉粒的胶粘物质
;+;+;
!
生殖细胞和营养细胞
!
小孢子分裂完成后
进入配子体形成阶段此时!小孢子不均等分裂产
生生殖细胞和营养细胞!二者在形态和功能上高度
分化生殖细胞近圆形!细胞核相对较大!通常被染
色较深!常染色质和异染色质较为活跃!有明显的双
层核膜包围细胞核周围有少量的细胞质!内含高
尔基体!不含线粒体)内质网)质体等细胞器高尔
基体以囊状小泡的形式靠近胞壁分布!它们是与细
胞外发生物质交换的媒介"图版
&
!
1
#营养细胞体
积较大!染色较浅!呈现弧形或其他极不规则的形
状!这是生殖细胞逐渐向营养细胞中游离所导致的
这种弧形两端渐尖的结构有助于生殖细胞进入花粉
管营养细胞中核质分散!细胞器结构并不明显!未
见有小泡分布"图版
&
!
##
)
#!
#
;+;+<
!
花粉内含物
!
在营养细胞和生殖细胞周围
存在丰富的细胞质大量
!
嵴明显的线粒体分布其
中!为花粉发育提供能量来源质体体积不断增大!
淀粉粒不断堆积高尔基体和内质网等结构并不明
显!小泡分泌旺盛"图版
&
!
#%
"
#(
#组织化学鉴定
发现!花粉中含有大量的蛋白质和淀粉!脂质含量较
少"图版
#
!
#
"
%
#花粉壁的主要成分是多糖类物
质!与超微结构描述一致"图版
#
!
$
#这些内含物
为花粉萌发和花粉管生长提供必需的营养物质
;+<
!
花粉管生长过程观察
扇脉杓兰在开花期柱头可授性可持续
#$;
*
&
+

人工自花授粉后!自交亲和性良好组织切片显示
授粉当天有部分花粉管萌发"图版
#
!
(
#随着雌蕊
柱头逐渐凋萎!萌发的花粉管穿过柱头乳突向下沿
子房壁生长!同一子房内花粉管萌发和生长时间并
不同步荧光显微镜观察子房压片表明!授粉后
!"
;
多数花粉管未发生明显的伸长生长!花柱的管状
分子荧光现象明显此时胚珠处于快速生长期!形
态清晰可见!在胚珠中间未发现有花粉管存在!花粉
管沿着垂直胚珠的方向伸长"图版
#
!
,
)
*
#&授粉后
%";
花粉管中出现大量黄绿色荧光的胼胝质塞!胼
胝质塞阻碍花粉管伸长!花粉管开始延伸至胚珠中
间径向生长"图版
#
!
1
"
#"
#!这时有些花粉管停止
生长!异常发育的花粉管出现自身螺旋盘绕和顶端
膨大的现象"图版
#
!
##
)
#!
#&授粉后
$";
!花粉管粗
大且内部胼胝质反应明显!开始朝胚珠方向定向生
长!逐渐到达胚珠接近珠孔的位置"图版
#
!
#%
)
#$
#&
授粉后
(";
!胚囊完全成熟!大多数花粉管从珠孔进
入胚囊完成受精作用!胚囊发出较亮的荧光"图版
#
!
#(
)
#,
#!这与刘芬等*1+报道的胚胎发育时间一
致此后花粉管降解消失
%
!

!

<+:
!
花粉微形态
兰科植物的花粉块是雄性生殖单元!其形态和
结构与传粉密切相关*#!+
R4S4;4
*
#%
+报道了杓兰亚
科有许多较为原始的特征!单粒花粉!或单沟或表面
腐烂!近球形!或光滑或有网纹
K^I0/)^458
Q
J
等*#$+也认为杓兰属花粉通常为单孢子!具有较深的
单沟!表面光滑!少纹饰这与本试验中扇脉杓兰的
花粉形态基本一致但是扇脉杓兰单粒花粉表面并
无明显的单沟!而存在
!
个或以上的深凹陷!这与陈
丽飞等*#(+对
(
种杓兰属花粉的扫描电镜观察结果
相似花粉表面的胶粘物不仅利于花粉块的形成!
更便于粘附柱头传粉随着花粉不断发育!内容物
逐渐填充花粉内部!部分深凹陷也随即变浅消失
因此!在扫描电镜中可同时观察到有深凹陷和无凹
陷的不同状态花粉而深凹陷所导致的花粉表观的
畸形!也不能视为花粉败育的原因
<+;
!
花粉超微结构
在兰科植物中!花粉壁的结构对花粉粘合至关
重要花粉粘合成花粉块主要有以下方式$"
#
#内壁
的桥!即相邻两花粉的内壁联结&"
!
#花粉之间胞质
连通&"
%
#形成不完全的细胞壁&"
$
#花粉外壁有胶黏
物质*#,)#*+本研究中扇脉杓兰花粉间无胞壁连通现
象!扫描电镜观察到单粒花粉外有粘性物质附着!它
使花粉粘合在一起任玲等*#1+认为花粉中的粘结
#$$!
#!

!!!!!!!!!!!!
闫晓娜!等$扇脉杓兰花粉超微结构及花粉管生长的观察
物是脂类物质!而在扇脉杓兰中胶粘物质的具体成
分还不能确定杓兰属植物花粉壁由许多小柱结构
组成*#%+!外壁是吸收水分的通道花粉的聚联程度
及外壁的消失被认为是花粉进化的趋势大多数杓
兰物种不形成外壁*#$!#&+!而扇脉杓兰具有清晰的外
壁可见!扇脉杓兰花粉并不是高度进化的类群
在盛花期扇脉杓兰小孢子进行活跃的有丝分
裂!产生的生殖细胞核内发生基因重组!这有利于遗
传信息的变异和传递与生殖细胞核质有明显界限
不同!营养细胞核质分散花粉细胞质中分布大量
的线粒体)质体和小泡等细胞器和蛋白质)淀粉及多
糖等营养物质!其细胞组成和结构与
1
#
%&-$()
2.(3&44+
的研究结果十分相似*!"+!这不仅维持了细
胞骨架!保证能量和营养的供应!同时也完成了物质
的代谢和交换!保障正常的生命进程在同属植物
!
"#
$%
#
&%()
5
+2.%.(4+3()
花粉的超微结构中发
现!细胞分裂过程中有微管存在虽然不同于蝴蝶
兰属"
67+4+&-,
#
2%2
#形成生殖细胞端的微管系
统*!#+!但在花粉发育早期细胞核周围微管较致密!
并逐渐延伸至生殖核极端*#&+微管是植物细胞骨
架的主要组成成员!它的存在使胞质形成连续的系
统!在生殖发育过程中胞内活动主要依赖细胞骨架
的相互作用*!!+扇脉杓兰中是否存在微管及细胞
骨架的变化!还需要对其花粉不同发育阶段进行详
细研究
<+<
!
花粉管生长
扇脉杓兰花粉活力从开花到凋谢一直维持在较
高水平*&+组织切片显示花粉管在授粉当天已有部
分萌发!表明扇脉杓兰花粉管具有很强的萌发能力
成熟兰花花粉没有萌发孔!花粉管释放的部位是授
粉后决定的花粉内和孢子外空间高度液泡化!花
粉粒逐渐伸出花粉管!通常花粉块中间的花粉管较
早萌发*!%+李冬妹等*!$+报道了鹤顶兰*
67+%(2
3+-8&$9%44&+&
"
=.:80
#
5^+
+花粉管在子房中生长的
%
个阶段!即沿子房壁轴向生长)沿子房径向生长和朝
珠孔定向生长阶段扇脉杓兰的花粉管生长也同样
历经这几个阶段!大多数花粉管能正常完成伸长过
程!只有极少量花粉管会出现扭曲盘绕等异常生长
的情况
受精过程所经历的时间因物种不同而异!较为普
遍的时间在
#"
"
$1J
之间*!!+如授粉后大花香水月
季"
:,2+,,$+3+MUHH:S4I+
;
%
;
+-3&+GHJ;+H:D.5/+
#

%"
"
$"J
*
!(
+
!菊花"
<&-$+-37&)+),$%
5
,4%()
#
!$
J
*
!,
+
!香石竹"
<%+-37(2.+$
"
,
#
7
"
44(2
#
!$
"
$1J
*
!*
+
!有
些植物时间或更短但是兰科植物传粉到受精的间
隔期通常要
%"
"
,";
或更长*!!+扇脉杓兰在授粉
后大约
(";
基本完成受精作用!这主要是其生物学
特性所决定的扇脉杓兰胚珠原基只有在授粉后才
开始发育!成熟胚囊形成于
%"
"
$"W=V
!花粉管只
有在雌配子体完全成熟时才会伸入胚囊而在胚囊
类型极度简化的天麻"
=+23$,%+&4+3+ 5^+
#中!双受
精也很简单!授粉后
#!J
花粉管开始发育并伸入子
房腔!在授粉后
*!J
就准备完成受精作用*!1+兰
科植物受精作用具有特殊性和多变性而受精作用
所历经的较长时间也未影响扇脉杓兰的花粉管行为
和受精过程
可见!在生殖过程中扇脉杓兰雄配子体发育正
常!花粉管生长状况良好!并不阻碍有性生殖过程
因此!花粉发育正常!不是生殖发育过程中的限制因
素刘芬等*1+对雌配子体和种胚的研究中表明!虽
然胚囊出现异常发育现象!但是在正常败育率范围
内!也不是限制发育进程的原因扇脉杓兰种胚发
育滞后!种子萌发率较低!胚胎发生和种子结构是否
制约了生殖和发育还有待进一步的研究
参考文献!
*
#
+
!
陈俊愉
+
中国花卉品种分类学*
C
+
+
北京$中国林业出版社!
""#
$
!1*!11+
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