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Identification of the pathogen causing leaf spot disease on Boehmeria nivea

苎麻叶斑病病原菌鉴定



全 文 :植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA  44(3): 318 ̄322(2014)
收稿日期: 2012 ̄12 ̄30ꎻ 修回日期: 2014 ̄01 ̄23
基金项目: 大宗蔬菜产业技术体系建设专项(CARS ̄25)、农业部园艺作物生物学与种质创制重点实验室
通讯作者: 李宝聚ꎬ研究员ꎬ主要从事蔬菜病害综合防治研究ꎻE ̄mail:libj@mail.caas.net.cn
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研究简报
苎麻叶斑病病原菌鉴定
杨 苗#ꎬ 石延霞#ꎬ 杜公福ꎬ 高 苇ꎬ 谢学文ꎬ 郭英兰ꎬ 李宝聚∗
Identification of the pathogen causing leaf spot disease on Boehmeria nivea  YANG
Miaoꎬ SHI Yan ̄xiaꎬ DU Gong ̄fuꎬ GAO Weiꎬ XIE Xue ̄wenꎬ GUO Ying ̄lanꎬ LI Bao ̄ju  ( Institute of Vegeta ̄
bles and FlowersꎬChinese Academy of Agricultural SciencesꎬBeijing 100081ꎬChina)
Abstract: Leaf spot disease was observed on ramie ( Boehmeria nivea ( L.) Gaud) in the plantation in
Chongqing. It was confirmed that the pathogen of the disease was Corynespora cassiicola by morphological
characteristicsꎬ pathogenicity test and molecular identification. The pathogenicity was significantly different to
the 10 plants with higher pathogenicity to cowpea and bean. The sequencing of the translation elongation factor
1 alpha(EF ̄1α)of C. cassiicola from 10 host plantsꎬ together with the pathogenicityꎬ showed the relationship
between them to some extent.
Key words: ramie(Boehmeria nivea)ꎻ Corynespora cassiicolaꎻ morphological characteristicsꎻpathogenicityꎻ
sequencing
文章编号: 0412 ̄0914(2014)03 ̄0318 ̄05
    苎麻[Boehmeria nivea (L.) Gaud]属荨麻科
(Urticaceae)苎麻属(Boehmeria)ꎬ多年生宿根性草
本植物ꎮ 我国苎麻栽培历史悠久ꎬ病害及病原种类
多ꎮ 2010 年ꎬ在重庆璧山丁家镇高古村苎麻种植
区发现一种新病害ꎬ该病菌主要为害苎麻叶片ꎬ病
害蔓延迅速且危害严重ꎬ严重时病叶率达 50%以
上ꎬ给当地苎麻产业造成严重损失ꎮ 为了明确该病
害的病原菌种类ꎬ本文通过形态学鉴定和致病性测
定ꎬ结合分子生物学技术对病原菌进行系统鉴定ꎬ
确定该叶斑病的病原菌为多主棒孢(Corynespora
cassiicola)ꎮ
1  材料与方法
1.1  病害调查及症状观察
    2010年 9月至 12 月ꎬ我国重庆璧山丁家镇高
古村苎麻种植区发现叶斑病ꎬ采集具典型特征的苎
麻叶片ꎬ观察并记录病害症状ꎮ
1.2  病原菌的分离、培养及形态特征观察
    采用组织分离法进行病原菌分离ꎬ纯化后
25℃黑暗培养 7 dꎬ观察并记录菌落培养特征ꎮ 观
察病原菌的显微形态ꎬ单孢分离后于 4℃保存ꎮ 同
时对实验室保存的黄瓜、甜瓜等 9 种寄主上的 19
株疑似多主棒孢进行形态学鉴定ꎮ
1.3  致病性测定
    选用 10 种供测植物:苎麻、黄瓜、甜瓜、苦瓜、
菜豆、豇豆、茄子、番茄、辣椒和莴苣ꎮ 将病原菌转
至 PDA平板 25℃黑暗培养 15 dꎬ用无菌水配成浓
度为 1×105个孢子􀅰mL-1的悬浮液ꎮ 苎麻 5 ~ 8 片
真叶ꎬ余者 2~3片真叶ꎬ喷雾接种ꎬ每个处理 20 株
幼苗ꎮ 接种后于 20 ± 5℃保湿培养ꎮ 观察病原菌
的侵染ꎬ调查各处理植株病情指数ꎬ评价其致病力
 
  3期 杨 苗ꎬ等:苎麻叶斑病病原菌鉴定
强弱ꎻ采用 SAS 软件进行方差分析ꎻ多重比较采用
Duncan’s 新复极差检验ꎮ
    调查分级标准:
    0级ꎬ无病斑ꎻ
    1级ꎬ病斑面积占整个叶面积的 5%以下ꎻ
    3级ꎬ病斑面积占 5%~25%ꎻ
    5级ꎬ病斑面积占 26%~50%ꎻ
    7级ꎬ病斑面积占 51%~75%ꎻ
    9级ꎬ病斑面积达 75%以上ꎮ
1.4  rDNA ̄ITS及翻译延长因子的序列分析
    利用改良 CTAB 法提取 20 株病原菌基因组
DNAꎬ分别采用 rDNA 通用引物 ITS1、ITS4 和翻
译延长因子(EF ̄1α)引物对 EF1 ̄728F(5′ ̄CATC ̄
GAGAAGTTCGAGAAGG ̄3′) 和 EF1 ̄986R ( 5′ ̄
TACTTGAAGGAACCCTTACC ̄3′) [1]进行 PCR 扩
增ꎮ PCR产物送至中国农业科学院作物科学研究
所测序ꎬ将 ITS和 EF ̄1α测序结果分别在 NCBI 进
行比对ꎬ确定病原菌分类地位ꎬ并利用 EF ̄1α 序列
构建系统发育树ꎬ结合致病性试验结果ꎬ探讨病菌
遗传多样性与其致病力差异的关系ꎮ
2  结果与分析
2.1  苎麻叶斑病为害及症状
    2010年 11 月在重庆璧山苎麻种植区调查发
现ꎬ苎麻叶斑病普遍发生ꎬ发病严重时病叶率可达
50%以上ꎮ 病害症状特点:主要为害叶片ꎬ下部叶
片先感病并逐渐向上部扩展ꎮ 发病初期出现暗褐
色小斑点ꎬ后扩展为近圆形或不规则形病斑ꎮ 病斑
叶两面生ꎬ直径 1~8 mmꎬ正面暗褐色ꎬ中央有灰白
色至灰褐色小点ꎬ具褐色晕圈ꎬ边缘颜色较深(图
1 ̄A)ꎻ病斑背面与正面形状相似ꎬ浅紫红褐色(图
1 ̄B)ꎮ
2.2  病原菌培养性状与形态特征
    病原菌在 PDA 平板培养 7 dꎬ菌落近圆形ꎬ菌
丝浓密ꎬ正面灰褐色ꎬ边缘灰白色(图 1 ̄D)ꎻ背面黑
褐色ꎬ边缘为白色(图 1 ̄E)ꎮ 分生孢子单生或串
生ꎬ倒棍棒形ꎬ直或弯曲ꎬ浅黄褐色ꎬ具 3 ~ 7 个假隔
膜ꎬ顶端钝圆ꎬ基部倒圆锥形ꎬ平截ꎬ基脐加厚ꎬ大小
(61.5~155.0) μm×(10.0 ~ 24.0) μm(图 1 ̄F)ꎻ分
生孢子梗单生ꎬ圆柱形ꎬ直立或弯曲ꎬ平滑ꎬ浅褐色ꎬ
Fig. 1  Field symptoms on leaves of Boehmeria nivea
and morphological charactristics of the pathogen
AꎬB: Lesions on the leafꎻ C: Symptom on ramie leaf by artificial inoculationꎻ DꎬE: Colony on PDAꎻ
F: Conidia(400×)ꎻ G: Conidiophores (400×)ꎻ H: Growth characteristics of the conidiophores.
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植物病理学报 44卷
可连续层出多次使孢子梗形成节节状ꎬ分节处颜色
加深ꎬ大小(135.0~260.0) μm×(9.0 ~ 12.5) μm(图
1 ̄G、H)ꎮ 将苎麻上的病原菌与 Ellis[2]报道的多主
棒孢进行比较ꎬ二者的形态分类特征及菌落培养性
状都极为相似ꎬ故从形态学将其鉴定为多主棒孢ꎮ
    多主棒孢寄主广泛ꎬ可侵染多种蔬菜ꎮ 本研究
针对已分离的 9个其他寄主来源的 19株多主棒孢
进行形态学鉴定ꎬ发现 19 个菌株的分类特征均符
合 Ellis[2]对多主棒孢的形态描述ꎬ故将以上菌株
均鉴定为多主棒孢(C. cassiicola)ꎮ
2.3  病原菌致病性测定
    病原菌喷雾接种的苎麻叶片ꎬ5~ 7 d 后开始表
现症状ꎬ9 d 时形成典型病斑ꎮ 发病初期ꎬ叶片出
现褐色小斑点ꎬ后扩展为近圆形至不规则形病斑ꎬ
病斑正面暗褐色ꎬ中央灰白色ꎬ具黄褐色晕圈ꎬ边缘
颜色较深ꎬ叶背病斑形状与正面相似ꎬ且与田间自
然发病症状一致(图 1 ̄C)ꎮ 从接种发病部位进行
病原菌分离ꎬ病菌与接种菌株形态一致ꎬ证明多主
棒孢为苎麻叶斑病的致病菌ꎮ
    病原菌接种黄瓜和甜瓜等 9种植物ꎬ4~ 5 d 后
感病植株叶片出现褐色病斑ꎬ调查发现病原菌可侵
染豆科(致病力最强ꎬ豇豆和菜豆的病情指数高达
59.17和 52.78)、葫芦科(黄瓜、苦瓜和甜瓜)和番
茄(表 1)ꎬ显症部位分离的菌株与接种菌株一致ꎮ
测定结果表明ꎬ苎麻上分离的多主棒孢可侵染多类
寄主ꎬ危害多种园艺作物ꎮ
2.4  病原菌分子生物学鉴定及遗传多样性分析
    对病菌 rDNA ̄ITS 区进行 PCR 扩增ꎬ得到长
度为 433 bp的目的片段ꎮ 测序结果与 NCBI 中的
基因序列进行比对ꎬ与多主棒孢的序列同源性为
100%ꎬ提交后登录号为 JX867271ꎬ进一步证明苎
麻叶斑病病原菌为多主棒孢(C.cassiicola)ꎮ 且将
其他寄主上分离的 19个菌株 ITS序列与 NCBI 进
行比对ꎬ与多主棒孢的一致性达 100%ꎬ进一步证
实这 19个菌株为多主棒孢ꎬ登录号为 KC870885 ̄
KC870903ꎮ
    从 NCBI选择已发表的多主棒孢 EF ̄1α 序列ꎬ
与本试验得到的序列一起建立系统发育树ꎬ发现分
离自苎麻的多主棒孢(ZM10110609)与分离自黄
瓜的菌株 (HN1)、甜瓜菌株 ( TG1)、苦瓜菌株
(KG6)及番茄菌株(FQ4、FQ2、FQ8 和 FQ10)在同
一组ꎬ且苎麻上分离到的菌株对以上 4种寄主均有
致病力ꎻ苎麻菌株与辣椒上分离的菌株(LJ1)亲缘
关系较远ꎬ且对辣椒无致病力ꎬ说明分子水平上的
差异与致病性相关ꎻ苎麻菌株与其中一株豇豆菌株
(JD2)聚在一类ꎬ与其他豇豆和菜豆菌株( JD1 和
SJD1)亲缘关系较远ꎬ但苎麻菌株对豇豆和菜豆的
致病力最强ꎻ苎麻菌株与 2个莴苣菌株亲缘关系较
Table 1  Pathogenicity of the pathogen from Boehmeria nivea on 10 tested plants
Families of the plant Species of the plant Leaf incidence Disease index
Urticaceae Boehmeria nivea 29.91 5.28D
Cucurbitaceae
Cucumis sativus 37.50 7.50C
C. melo 10.00 1.11E
Momordica charantia 5.00 0.56G
Fabaceaee
Phaseolus vulgaris 75.00 52.78A
Vigna unguiculata 87.50 59.17B
Solanaceae
Solanum lycopersicum 6.35 1.06F
S. melongena 0.00 0.00H
Capsicum frutescens 0.00 0.00H
Asteraceae Lactuca sativa 0.00 0.00H
  Note:Average disease indexes were analyzed by Duncan’s multiple new range test. Means in the same column with the same
letter were not significantly different at P < 0.01.
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  3期 杨 苗ꎬ等:苎麻叶斑病病原菌鉴定
Fig. 2  Phylogenetic tree of EF ̄1α gene sequences of 20 isolates
of cassiicola isolated from Boehmeria nivea and 9 other plants
AꎬB: Lesions on the leafꎻ C: Symptom on ramie leaf by artificial inoculationꎻ DꎬE: Colony on PDAꎻ
F: Conidia(400×)ꎻ G: Conidiophores (400×)ꎻ H: Growth characteristics of the conidiophores.
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植物病理学报 44卷
近ꎬ但对莴苣无致病力ꎮ 表明依据 EF ̄1α 基因测
序结果与致病性分析仍有一定差异ꎬ并不能完全依
据分子水平结果判断其致病力强弱ꎮ
3  讨论
    1960年ꎬJohnston报道多主棒孢可侵染马来西
亚的苎麻引起棒孢叶斑病[3]ꎬ之后 Minter 等[4]于
2001年在西印度群岛发现由该菌引起苎麻同科植
物剑麻(Agave sisalana)的棒孢叶斑病ꎬThaung[5]
于 2008年在缅甸的剑麻(A. sisalana)上也发现该
病害ꎮ 迄今为止ꎬ我国尚无该菌引起苎麻病害的相
关报道ꎮ
    多主棒孢(C. cassiicola)是一种寄主范围广且
世界性分布的重要植物病原菌ꎬ能侵染热带及亚热
带地区近 530 余种植物ꎬ包括橡胶、番茄、黄瓜、棉
花、豇豆、芝麻等ꎮ 1950 年ꎬWei 等[6]首先在我国
发现了多主棒孢引起的豇豆叶斑病ꎮ 近年来ꎬ棒孢
叶斑病在黄瓜、番茄和茄子主产区及海南和云南的
橡胶种植区大面积发生ꎬ造成巨大经济损失ꎬ成为
制约农业生产的重要病害ꎮ
    多主棒孢寄主广泛、侵染力强、传播途径多、易
变异及缺乏有效防治措施ꎬ导致棒孢叶斑病由次要
病害上升为主要病害ꎬ成为制约农业发展的重要因
素ꎮ 农业生产中ꎬ不及早进行诊断和防治ꎬ极易与
其他作物产生交叉感染ꎬ导致病害蔓延ꎬ造成严重
经济损失ꎮ
    本研究通过病原菌形态观察、致病性测定和分
子生物学手段ꎬ证明苎麻叶斑病的病原菌为多主棒
孢ꎮ 回接试验表明苎麻上的多主棒孢对葫芦科、豆
科和番茄均有致病力ꎮ 因此ꎬ生产中建议将苎麻种
植区与豇豆等敏感作物隔离ꎬ以有效控制病害ꎮ 前
期研究表明ꎬ多主棒孢的遗传多样性与菌株致病力
分化有关ꎬ对黄瓜、番茄等多种寄主植物上的多主
棒孢进行交互接种试验表明病原菌可交互侵染ꎬ但
致病力存在一定差异(未发表)ꎮ 本试验中 20 株
多主棒孢 EF ̄1α 基因片段的遗传多样性分析表
明ꎬ其遗传多样性与致病性有一定相关性ꎬ与前期
研究结果一致ꎮ
参考文献
[1]   Carbone Iꎬ Kohn L M. A method for designing primer
sets for speciation studies in filamentous ascomycetes
[J] . Mycologiaꎬ 1999ꎬ 91(3): 553-556.
[2]   Ellis M B. Some species of Corynespora [J] . Myco ̄
logical Papersꎬ 1957ꎬ 65(9): 1-15.
[3]   Johnston A. A supplement to a host list of plant disea ̄
ses in Malaya [J] . Mycological Papersꎬ 1960ꎬ 77: 1-
30.
[4]   Minter D Wꎬ Rodríguez Hernández Mꎬ Mena Portales
J. Fungi of the Caribbeanꎬ an annotated checklist
[M] . UK:PDMS Publishingꎬ 2001. 1-946.
[5]   Thaung M M. A list of hypomycetes(and agonomyce ̄
tes) in Burma [J] . Australas. Mycol. 2008ꎬ 27: 149-
172.
[6]   Wei J C.Notes on corgnespora[ J] . Mycological Pa ̄
persꎬ1950ꎬ 34: 1-9.
责任编辑:曾晓葳
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