全 文 ：书西北植物学报!
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基金项目$云南省科技厅项目" !"#!--"", #%中国烟草总公司项目" ##"!"#""!""# #%中国烟草总公司云南省公司项目" !"#"./"! ! !"##./", # 作者简介$李
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岩"
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#!女!硕士研究生!主要从事烟草分子生物学研究&
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通信作者$肖炳光!博士!研究员!主要从事烟草育种与生物技术研究& 0)1234$
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!,$;:?@ 基于 !!" 标记对 ## 份烟草材料的聚类分析 李 ! 岩#!!童治军!!焦芳婵!!吴兴富!!高玉龙!!姬广海#!肖炳光!" " # 云南农业大学!昆明 ,+"!"# % ! 云南省烟草农业科学研究院!昆明 ,+$#""
#
摘
!
要$利用与烟草赤星病抗性连锁的 , 对 AAB 标记和随机选取的 !# 对 AAB 标记!对$$份具有不同赤星病抗性 的烟草种质资源的遗传关系进行了分析&结果表明$基于
$个烟草赤星病抗性 CDE 两侧的 , 个 AAB 标记可以较 好地将抗病品种和感病品种区分开来&在遗传相似系数" !" #为 ";** 的水平上!可将$$个烟草品种分为 * 个类 群$具有净叶黄"国内#和
-?3:62F@)#"""
"美国#赤星病抗源的烟草品种聚为一类"
"
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系列烟草
品种聚为一类"
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关键词$烟草% AAB 标记%赤星病%聚类分析 中图分类号$
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$@872<<8W % AAB12F\?FW % 7F8[:W Z 8@ % <4OW@?F2:24 9 W3W !! 烟草赤星病的病原链格孢菌" -+.)/,/0+.)/1 ,. #属半知菌亚门真菌!其寄主范围较广!烟草棉 花花生大豆等多种作物均可浸染并产生病斑&目 前!赤星病病菌种群对不同品种的致病性因明显专 化性差异而区分为不同的两类生理小种$柑桔致病
性和柠檬致病性(#)&烟草赤星病自
#(%!
年首次报
道以来!给世界烟草产业带来重大经济损失&在中
国!其呈间歇式爆发!尤其
!"
世纪
("
年代至今!由
于烟草赤星病生理小种多变环境气候复杂烟草品
种抵抗力差等诸多影响因素!使其成为威胁中国烟
草安全生产的主要真菌病害之一(!)&虽然选育抗烟
草赤星病的优良品种是预防该病最经济有效的途
径!但因在育种上面临着对种质资源的挖掘力度不
够优质抗病资源匮乏及种质资源遗传背景狭窄等
问题($)而很难通过常规育种手段实现&利用分子标 记技术对烟草种质资源进行遗传多样性与亲缘关系 分析!已成为烟草遗传资源研究的重要内容!其研究 结果可为种质资源在烟草育种中的科学利用提供重 要的理论依据& 在分子水平上对栽培烟草种质资源的研究中! 国内外的报道绝大多数集中在利用非特异性标记 BJ^ _ ( *), ) ABJ^ ( & ) JQE^ ( )% ) KAAB ( #")#! )或 BJ^ _ 和 JQE^ 相结合(#$)#*)等对遗传多样性与亲缘关系
进行分析上!而在利用与抗性连锁标记对烟草种质
资源抗性遗传多样性分析方面的研究则较少&
PO438
等(%)利用已报道的分别与烟草
H^.
霜霉病和根黑
腐病抗性基因连锁的
JQE^
标记对其收集到的
%!
份烟草材料"
$( 份烤烟 !, 份白肋烟 #( 份晾晒烟 ( 份香料烟和 ! 份雪茄烟#的 H^. 霜霉病和根黑 腐病抗性资源进行了遗传多样性分析&迄今为止! 利用基于赤星病抗性连锁的分子标记对烟草种质的 遗传关系进行分析!在国内外尚未见报道& 本研究利用 D8: > 等(#+)已报道的与烟草赤星病 抗性基因连锁的 AAB 标记!首次对烟草材料进行遗 传多样性及其亲缘关系研究!为利用烟草抗赤星病 种质资源合理选配亲本等提供理论依据& # ! 材料和方法 @;@ ! 供试材料 参试的$$份烟草材料"表 # #!均由云南省烟草 农业科学研究院提供&其中!抗烟草赤星病的材料 "品种#有 !+ 份!分别属于$
个抗源$即 -?3:62F@) #""" "美国#净叶黄"中国#和香甜烟草" #$%&()*1
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#%烟草感赤星病材料有
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另一部分是在参照
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等(#,)所公布的烟草
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生物"大连#有限公司合成&
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编号
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品种名称
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中抗赤星病和
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抗赤星病和黑胫病
B?W3W@2:$D872<<8-F8[:A Z 8@2:YD872<<8 -42<\A62:源于美国 LF3 > 3:2@?YUF81SAJ !+ #$%&()*+),%
抗赤星病野火病
H^.
霜霉病白粉病和
D`HB?W3W@2:$D8) 72<<8-F8[:A Z 8@ ! D872<<8R34YQ3F? ! H^. ! _8[: 9 3`4Y?[ ! 8^[) Y?F 9 3`4Y?[2:YD`H 源于澳大利亚东南部沿海地区 LF3 > 3:2@?YUF81@6?<82W@24 2F?28UW8O@6?2W@JOW@F3432 !, 长脖黄 G62: > 786O2: > 感赤星病黑胫病青枯病和根结线虫病 AOW?<brZ @374?$
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D^,#+&$JJGJDIIIJIIJJGJJDGJJJ DDJIDIIIGGJIDDIGDDDG ++ DJ #(( @A# ! !!" 反应 烟草基因组 _/J 的提取采用 GDJ- 大量法! 提取纯化及检测方法参照 _?B3?等(#&)并作适当 修改& G^B 反应体系为 !" & E !其中 !" +": > * & E _/J 样品 #;+ & E #"a G^BF?2<@38:-OUU?F " ` > !e Z 4OW # ! & E !+1184 * EY/D^ W#;+ & E #" & 184 * E 正反向引物各 #;+ & E F2 3 ";&+S !最后用 YYb ! L 补足至 !" & E & G^B 扩增在 0 ZZ ?:Y8FU 2`W@?F< 9 ) <4?F Z F8A 上进行!反应程序为 %*d 预变性 +13: % %*d 变性$"W
!退火"退火温度随引物的不同而改
变!表
!
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个循环!
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延伸
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#!最后参照许绍斌
等(#()的方法进行银染检测&
@;C
!
数据分析
扩增产物按同一迁移位置上条带在各个材料中
的有"记为
#
#无"记为
"
#和缺失"记为
!
#进行统
计&参试的每
!
份材料间的遗传相似系数"
IA
#用
/?3
等(#%)的公式计算&利用
/DA.A
Z
!;##
软件(!")按照类平均法"
S^ I`J
#进行聚类分
析!构建分子进化系统树&
!
!
结果与分析
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!!"
标记的多态性分析
利用分布在
!*
个连锁群上共计
!&
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物!对
$$份具有不同赤星病抗性的烟草种质资源进 行 G^B 扩增!扩增产物的分子量均符合预期目标 " #"" $""7 Z #"图 # $ #& !& 对 AAB 引物在$$
份
烟草材料中共扩增出
#+%
个多态性条带"即在
!&
个
AAB
位点上共检测到
#+%
个等位基因#!每对
AAB
+&%#
#"
期
!!!!!!!!!!!!!
李
!
岩!等$基于 AAB 标记对$$份烟草材料的聚类分析 引物可检测的等位基因数为 ! ## 个!平均为 +;(% 个&其中!分布在$
个连锁群上且与烟草赤星病抗
性连锁的
,
对
AAB
引物在
$$份烟草材料中共扩增 出 +$ 个多态性条带!每对 AAB 引物可检测的等位 基因数为 * ## 个!平均为 (;($ 个%分布在另外 !# 条连锁群上的 !# 对 AAB 引物在$$
份烟草材料中
共扩增出
#",
个多态性条带!每对
AAB
引物可检测
的等位基因数为
!

%
个!平均为
+;"+
个&表明
AAB
标记在检测烟草基因组遗传多态性上有十分
显著的检出效率&
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!
##
份具有不同赤星病抗性烟草种质的遗传相
似性
基于
,
对与烟草赤星病抗性连锁的
AAB
标记
分析结果!计算
$$份参试烟草材料间的遗传相似系 数"表 $ #!供试材料间的遗传相似系数在 ";"% #;"" 之间!平均为 ";++ &其中属于野生烟草的香甜 烟草" #$%&()*+),% #与其他 $! 份材料间的遗传相 似系数最低!平均为 ";"% %而具有净叶黄赤星病抗 性的+庆胜 ! 号,+襄颖 # 号,和+许金 & 号,之间及 同属于 GH 系列且具有赤星病抗性的+ GH&$ , + GH(+ ,+ GH(& ,和+ GH(% ,间的遗传相似系数!达 到 #;"" &说明此$$
份具体不同赤星病抗性烟草材
料的遗传相似性相对较低!变异范围较大!亲缘关系
较远&
基于剩余
!#
个连锁群上随机选取的
!#
个
AAB
标记分析结果!计算
$$份参试烟草材料间的遗传相 似系数"表 $ #!供试材料间的遗传相似系数在 ";"* #;"" 之间!平均为 ";+! &其中属于野生烟草的香 图 # ! 基于烟草赤星病抗性连锁标记 D #`"+(% 的扩增结果 `;#""7 Z _/J42YY?F % #$$ ;
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标记对
$$份烟草材料的聚类分析 甜烟草" #$%&()*+),% #与其他 $! 份材料间的遗传 相似系数最低!平均为 ";"* !这与基于 , 对连锁标 记分析的结果一致%而+长脖黄,+ /G(! ,和+ GH&() * ,!+许金 + 号,和+ %#*& ,!+许金 ( 号,和+千金黄,! + GH&$ ,和+ GH(% ,及+净叶黄,和+ I#*" ,之间的遗 传相似系数达到 #;"" &同样也说明此$$
份烟草材
料的遗传相似性相对较低!变异范围较大!亲缘关系
较远&
上述结果表明!供试的
$$份烟草品种间存在着 较丰富的变异!遗传基础相对比较宽!遗传差异性较 显著& B;# ! 具有不同赤星病抗性的烟草品种的聚类分析 根据遗传相似性系数矩阵按 S^ I`J 方法构 建$$
份具有不同赤星病抗性烟草种质的聚类图"图
*
#&基于赤星病抗性连锁的
AAB
标记聚类结果显
示$在遗传相似系数为 ";** 的水平上!可以明显地 将$$份烟草材料划分为 * 个类群!即!属于野生烟 草的香甜烟草" #$%&()*+),%
#单独成一类"
%
类#!
与香甜烟草具有独特的赤星病抗性一致%+净叶黄,
的衍生品种大都与+净叶黄,聚在一个类群"
"
类#!
此类群中除+龙江
%##
,和+
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,外共有
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份具有+净叶黄,来源的赤星病抗性%
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及+中烟
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,聚为一类"
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类#%剩余的+
I#*"
,
+
I!(
,和+长脖黄,等聚为一类"
$类#!此类群中除 地方品种+塘蓬,中抗烟草赤星病外!其余 ( 份材料 与+长脖黄,一样属于高感烟草赤星病的材料"图 * ! 2 #&该聚类结果说明!利用与烟草赤星病抗性连锁 的 AAB 标记可以很好地将赤星病感病品种与抗性 品种区分开!同时也能很好地将抗病品种中$
个不
同烟草赤星病抗源区分开!+
-?3:62F@)#"""
,和
GH
系列品种"美国#!+净叶黄,"中国#和香甜烟草&利
用其余
!#
条连锁群上随机选取的
!#
对
AAB
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对此
$$份烟草材料的聚类结果则显示$在遗传相似 系数为 ";#% 的水平上!可以明显将$$
个品种划分
为两大类群!即!野生烟草类群"
#
类#与栽培烟草类
群"
"
类#&因此!利用随机选取的
AAB
标记的聚类
结果则看不出与烟草赤星病抗性的关系"图
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$$份烟草品种聚类图 2; 基于与赤星病抗性连锁的 AAB 标记的聚类图% 7; 基于随机选取的 AAB 标记的聚类图%$$
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卷
$! 讨 ! 论 #A@ ! 基于抗性连锁的 !!" 标记在烟草种质资源研 究中的应用 利用 AAB 标记对烟草种质资源遗传多样性的 研究报道较少&直到 !""& 年! -3:Y4?F 等(!#)才首次 报道了利用 AAB 标记揭示 #, 份普通烟草品种的亲 缘关系&随后! 8`8: 等(!!)!*)利用 -3:Y4?F 等(!#)释 放的烟草 AAB 引物对分别属于 #+ 个种的 +# 份烟 草材料进行了遗传多样性分析! *, 对 AAB 引物在 +# 份材料中共检测到 +!% 个多态性位点!平均每对 引物可检测出 ##;+ 个等位位点&而利用与抗性连 锁的 AAB 标记对烟草种质资源进行聚类分析的研 究!迄今尚未见报道& PO438 等(%)利用与烟草霜霉 病 H^. 和根黑腐病抗性连锁的 JQE^ 标记对 %! 份烟草材料进行了聚类分析! ## 个 JQE^ 组合共获 得 +!* 个扩增片段!其中$$个片段"约 ,;$f
#为多
态性片段&此
$$个多态性片段能较好地将分别具 有烟草霜霉病 H^. 和根黑腐病抗源的烟草材料划 分开!并成功地将其中与抗烟草 H^. 连锁的 JQE^ 扩增片段转化成 AGJB 标记&本研究中!分别利用 与烟草赤星病抗性连锁的 , 个 AAB 标记和随机选 取的 !# 个 AAB 标记!在$$
份烟草材料中分别扩增
出
+$和 #", 个多态性条带!每对 AAB 引物可检测 的等位基因数分别为 * ## 和 ! % 个!平均为 (;($
和
+;"+
个&相较于随机挑选的
!#
对
AAB
引物!与
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,
个标记在检测
$$份具有 不同赤星病抗性的烟草种质资源遗传多态性上具有 更高的效率& #;B ! 基于赤星病抗性连锁标记的烟草品种聚类分析 基于分子标记进行烟草种质资源聚类的相关报 道已有很多!但已有研究仅仅是针对烟草材料进行 选择!如烟草核心种质资源聚类分析($!+),!##)栽培种 聚类分析(&)晾晒烟聚类分析(#*)烤烟品种聚类分 析(*!#"!#!)等!均未针对烟草特定性状进行&本研究 利用 D8: > 等(#+)已报道的烟草赤星病抗性 CDE 分 析获得 $ 个 CDE 两侧的 , 个 AAB 标记对长脖黄 净叶黄净叶黄衍生系感赤星病品种和不同赤星病 抗源的$$
个烟草品种进行聚类分析!得到了基于赤
星病抗性连锁标记的聚类图!其结果显示$利用与烟 草赤星病抗性 CDE 连锁的 AAB 标记不仅可将烟草 赤星病抗感品种区分开!而且还能有效地将具有不 同赤星病抗源的品种划分开&感赤星病的烟草品种 虽然遗传背景有很大差异!但基于赤星病抗性基因 连锁标记的分析!其差异度大大降低!故将此类聚在 一起"$
类#%具有净叶黄"国内#和
-?3:62F@)#"""
"美国#抗源的烟草品种聚为一类"
"
类#%具有不明
抗源的
GH
系列烟草品种"田间的赤星病表型通常
为中抗#聚为一类"
#
类#%明显不同于上述栽培烟草
抗源的香甜烟草单独聚为一类"
%
类#&而用随机选
取的
AAB
标记的聚类结果则看不出与烟草赤星病
抗性的关系&究其原因!可能为$当利用与抗性 CDE 连锁的标记进行聚类分析时!针对的是特定的 染色体区域!聚类结果主要取决于参试材料是否抗 病及抗病基因的来源!故感病品种聚在一类!而不同 的抗源聚在不同的类别%当利用随机的 AAB 标记进 行聚类分析时!并未针对特定的染色体区域!聚类结 果主要取决于参试材料全基因组水平上的遗传差 异!故$!
份普通烟草品种聚为一类!香甜烟草属于
不同烟草种单独聚为一类&这一结果间接反映了
已报道的烟草赤星病
CDE
定位的准确性!也为下
一步开展烟草抗赤星病的分子标记辅助育种工作奠
定了基础&
基于赤星病抗性连锁的
AAB
标记不仅可将烟
草赤星病抗感品种区分开!而且还能有效地将具有
不同赤星病抗源的烟草品种划分开&
参考文献!
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