全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$
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收稿日期$
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基金项目$国家自然科学基金项目"
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#&陕西省农业公关"
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作者简介$文添龙"
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#!男!在读硕士研究生!主要从事植物分子生物学方面的研究
3(45.6
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通信作者$俞嘉宁!博士!副教授!主要从事植物功能基因的表达调控研究
3(45.6
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高等植物胁迫诱导型启动子的研究进展
文添龙!刘雪梅!冀亚萍!俞嘉宁"
"陕西师范大学 生命科学学院!西安
,#"##*
#
摘
!
要$逆境胁迫严重影响植物生长发育!降低作物产量目前在植物抗逆基因工程中!大多使用组成型启动子驱
动目的基因表达!组成型启动子的表达虽然能提高转基因植株的抗逆性!但持续过量地表达转化的外源基因有时
会阻碍植物的生长且降低其产量因此!诱导型启动子的研究具有重要的应用价值该文对近年来植物在逆境胁
迫处理下!一些诱导型启动子的种类和功能!可能具有的顺式作用元件!反式作用因子及其研究方法进行了综述
关键词$启动子&诱导型启动子&胁迫诱导&转基因植物
中图分类号$
?,1*
文献标志码$
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!!
启动子是提供
TB@
聚合酶识别和结合的一段
UB@
序列和相关的调控元件!通常位于基因的上
游!驱动基因转录根据启动子的作用方式!可分为
组成型启动子)组织特异型启动子和诱导型启动子
组织特异型启动子驱动的基因表达常常只发生在某
些特定的器官或组织部位!表现出发育调节的特性
诱导型启动子通常不启动基因转录或转录活性很
低!在某些特定信号刺激下!转录活性能够显著提
高在转基因植物中!组成型启动子持续过量表达
外源基因会阻碍植物的生长且降低其产量*#+而选
用组织特异型启动子和诱导型启动子!可使外源基
因只在特殊的组织部位或诱导的情况下表达!而不
会因外源蛋白的持续表达影响植物正常生长!有很
好的应用价值本文就近年来高等植物中一些胁迫
诱导型启动子的种类和功能!可能具有的顺式作用
元件!反式作用因子及其研究方法进行了综述
#
!
高等植物胁迫诱导型启动子的类型
高等植物胁迫诱导型启动子根据诱导条件的不
同主要分为干旱诱导型启动子)低温诱导型启动子)
高温诱导型启动子)盐诱导型启动子和植物激素诱
导型启动子它们在胁迫的条件下均有显著的诱导
特性!可在植物特定的发育阶段和生长环境下!诱导
特定基因的表达!以保证植物正常生长&当胁迫解除
后!特定基因则停止表达这样不仅不会造成植物
体内资源的浪费!又可提高植物在胁迫条件下的
抗性
近年来!高等植物中已发现了不少胁迫诱导型
启动子"表
#
#其中
V
L@T2
是一个成熟和干旱诱导
的启动子!可驱动衰老相关的受体蛋白激酶表
达*!(%+
V
L@T2
启动子在农作物中表现出干旱响应的
特性*$()+
U9657;OO9
等*&+检测了
V
L@T2
驱动的转基
因烟草中
!"#
的表达活性!结果显示转
V
L@T2
#
WGL
的烟草在干旱处理条件下!开花期叶片中
WGL
表达量增加!但在正常生长的幼苗叶片中!
WGL
活性没有变化!证明了成熟和早衰的叶片中
V
L@T2
启动子在干旱胁迫下的活性更高
$%&&!
是编码玉米黄质环氧化酶的基因!
T5.
等*,+用
$%&(
&!
基因启动子融合
!"#
报告基因构建表达载体
转化玉米!在没有胁迫的条件下!转
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#
!"#
株系中
$%&&!
基因启动子驱动的
WGL
活性比对
照组低得多!而缺水处理后!含有
X/@Y@!
#
WGL
的转基因植物叶片在干旱处理
&>
后
WGL
表达量
显著增加!可达对照组的
)
倍!在第
1
天
WGL
表达
量轻微下降&而在转基因植物的根部
WGL
活性在
第
1
天仍然增加!是对照的
1
倍!表明
$%&&!
基
表
;
!
高等植物中诱导型启动子的类型)具有的顺式作用元件及应用
C5S69#
!
CM97
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K
O;4;79O/.0M.
D
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K
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KK
6.:57.;0
启动子
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典型顺式作用元件
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D
9694907
物种来源
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D
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应用
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V
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菜豆
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粳稻
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D
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受
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受
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强诱导!但受
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水稻
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)低温)干旱胁迫条件下上调&在高温胁迫下下调*%*+
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受非生物胁迫诱导上调*$"+
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旱稻
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受高盐和干旱诱导*$!+
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#
期
!!!!!!!!!!!!!!
文添龙!等$高等植物胁迫诱导型启动子的研究进展
因启动子是很好的干旱诱导型启动子!且在根部的
诱导效果更持久
)05#).
基因启动子是从拟南芥中分离出来!在
低温适应过程中能特异表达的一个典型的诱导型启
动子*1+植物对不同程度低温逆境的生理响应是不
同的*+!
)05#).
启动子区域"
%")
#
_,1S
K
#包含
了低温响应元件*#"+
A50
D
等*##+分析了
!"#
融合
+$@#).
启动子的转基因株系分别在低温"
!!`
#
$`
#和冷却"
!1`
#
!!`
或
!!`
#
#&`
#条件下
WGL
的表达情况!结果显示
!1`
#
!!`
的处理比
低温处理时
!"#
基因的表达更快!而
!!`
#
#&`
的冷却处理比低温处理时
!"#
基因的表达慢且弱
此外!植物为了抵御高温胁迫!一些基因可被高
温诱导表达
T[V
"
TFBW[FBW3TVTXC3FB
#具
有泛素连接酶的功能*#!+!在植物响应非生物胁迫中
扮演了重要角色*#%+
J=
等*#$+研究了中国野生葡
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;
%/2:05/8*)21.8.
#
<
;
@C,#
启动子对温度
的响应!将含有转
<
;
@C,#(!"#
融合基因的葡萄
叶片分别进行低温"
$`
#和高温"
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#处理低
温处理时!
<
;
@C,#
启动子驱动的
WGL
活性与内
参比较没有差异!而高温处理时!
<
;
@C,#
启动子
驱动的
WGL
活性比内参高
1
倍
盐胁迫诱导型启动子可以帮助植物改善生长条
件并提高产量对盐胁迫诱导型启动子的研究发现
其中一些启动子可显著提高转基因植物对盐胁迫的
响应从辽宁碱蓬"
#2./:.1*.082=
4
/=%*%2+
#中分
离的编码甜菜碱醛脱氢酶的
&DA
基因!受盐胁
迫的 诱 导 表 达*#)(#&+
aM50
D
等*#,+设 计 了
)
个
&DA
基因启动子的截短体"
#**%S
K
)
#$&&
S
K
)
#"1$S
K
)
),%S
K
和
%""S
K
#!融合报告基
因
!"#
后转入烟草用不同浓度
B5Q6
处理转基
因烟草叶片
$1M
后!通过
WGL
组织化学染色分析
和荧光定量分析检测!显示叶片中
WGL
活性与
B5Q6
的浓度成正比与对照比较!融合
%""S
K
启动子截短体的转基因植物在
$""44;6
%
E
的
B5Q6
处理下!
WGL
活性增强
&+%
倍最短的启动
子截短体"
%""
#
_&!S
K
#拥有重要的顺式作用元
件!是强
B5Q6
诱导的启动子
@.9
基因最早是从
水稻中分离出来的*#1+!其中
@.9#&&
编码脱水蛋
白!属于第二组
EF&
基因家族!受
@Y@
诱导!拥有
典型的
@Y@
响应元件"
@YT3
#和耦合元件
Q3(6.]9
序列!对盐胁迫具有一定的耐性*#*+
T;
<
QM;=>M=(
O
<
等*!"+通过土壤农杆菌转化法将
@.9#&&
启动子
驱动的
@.9#&&
转到烟草中获得了
C
!
代转基因植
株!在高盐)
@Y@
和
V3W
诱导的条件下!转基因植
物叶片中
T5S#&@
蛋白质积累!渗透产物!如$还原
糖)脯氨酸和多聚胺等也增加!与野生型植株相比对
盐的耐受性明显增加
除此之外!还有些受激素诱导的启动子!如$纤
维素合成酶基因启动子"
!-+/%&$
#是从陆地棉
"
!0%%
6;
*2>-*5%282>
#中分离出的一个全长为
#$1!S
K
的启动子转基因烟草中
!-+/%&$
启动
子可被植物激素诱导表达*!#+有证据表明许多植
物激素响应元件"
@=NT3
#是由
CWCQCQ
序列和它
的反向序列
W@W@Q@
组成*!!+
A=
等*!#+把
!-+(
/%&$
启动子连到烟草的报告基因
!"#
上!形成了
转基因烟草"
K
WMQ9/@$
#
WGL
#然后对生长
%
周
的
C
#
代转基因烟草进行各种胁迫处理!发现
B@@
处理的
WGL
活性比对照处理的高
#+1&
倍!然而
@Y@
)干旱和
W@
处理仅表现出轻微的
WGL
活性
对
B@@
处理的时间和剂量研究发现!
WGL
活性在
#
$
4;6
%
EB@@
处理后逐渐增加!在
*M
达到最高
水平!并可以维持到
!$M
!但是在没有
B@@
处理的
培养期间不显示任何改变
,%,@#"
启动子是从白
松"
,*=2%%85092%
#中分离出的!该基因可在根中诱
导表达*!%(!$+!
H=
等*!)+构建了一系列
,%,@#"
"
#&1#
S
K
#启动子
)b
端截短体融合
!"#
报告基因!转入烟
草后分析了非生物逆境胁迫下
V,*&
"
,*&
#
_&*
#
对根特异性的调控结果显示!用
B5Q6
)甘露醇和
V3W(&"""
处理转
V,*&(!"#
植株的根部!
WGL
活
性比空白对照高
%
倍!用
L@
)
@Y@
和
I@
处理
WGL
活性更高
上述研究结果表明!胁迫诱导型启动子都可通
过胁迫诱导改善植物生长条件的功能!且其诱导条
件和不同诱导型启动子的诱导效果均会有所差异
大多数研究是通过融合报告基因
!"#
或
/!C,
后
构建成植物表达载体!用农杆菌介导的方法转到其
他植物中形成转基因植物!在转基因植株中进行一
系列的胁迫处理!研究对各个胁迫的响应情况一
般情况下!胁迫诱导型启动子可以响应多种胁迫!但
是!诱导型启动子通常只对特定的胁迫有强的诱导
效果这可能与不同启动子作用在不同植物和其自
身上游所含的顺式作用元件有密切关系!不同顺式
作用元件可结合不同的反式作用因子来改善胁迫的
影响!因此研究各类胁迫诱导型顺式作用元件及其
互作的反式作用因子!有助于更好地解析胁迫诱导
型启动子的作用机制
1"!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
!!
顺式作用元件和反式作用因子
<+;
!
顺式作用元件
除核心启动子外!诱导型启动子上游还有很多响
应不同胁迫的顺式作用元件目前常见的胁迫响应
顺式作用元件主要有
UT3
)
ZJY
)
ZJQ
)
@YT3/
)
\L3/
)
ECT
和
WQQ(S;N
等"表
!
#
UT3
元件是
#**$
年
J545
D
=:M.(LM.0;c5].
等*$%+首次发现!其核心序列
为
C@QQW@Q@C
!在干旱)高盐和低温处理条件下能
驱动下游基因的表达
@YT3/
是
#*1*
年
Z5O:;779
等*$$+鉴定得到!核心序列是
@QWC
!只有在依赖
@Y@
的基因表达中起作用!可与
SaFV
类转录因子结合!调
控下游基因的表达!提高植物的抗盐性
\L3
一般
位于
C@C@(S;N
上游!参与基因的表达调控其余
的胁迫响应元件均可与相应的转录因子结合!共同调
控基因的表达鉴于胁迫响应元件的重要功能!从基
因中确定特定响应元件的数量和位置显得尤为重要
如$胁迫处理条件下!小的热激蛋白"
/\LV/
#在保护
新合成的蛋白质中具有重要的作用在
/\LV!&
启
动子中
Q@@C(S;N
连着热激元件"
\L3/
#!
Q@@C(S;N
元件在转录中起着协同
\L3/
的作用*!1+
a5M=O
等*$)+从棉花"
!0%%
6;
*2>.5905/2>
#基因组
UB@)b
编
码区 分 离 了
!A#,!&
启 动 子 序 列 "
VW\LV!&
!
!1#%S
K
#!通过
VE@Q3
软件分析了
VW\LV!&
启
动子响应各种环境信号的顺式作用元件!显示出位
于
,&S
K
处的
ZJY
结合位点与干旱胁迫有关!两
个
@Y@
响应元件类似基序"
@QWCW
#与干旱胁迫
时的基因表达有关!两个干旱响应元件
QY[
和
@YT3
分别位于
1*1S
K
和
,%&S
K
!位于
)1!
S
K
ZT3(6.]9
序列"
CWQ@WWQ
#可被重金属诱导
@)A#,#,+1
是
/\LV/
家族的启动子!从蔷薇
属植物月季中分离得到的!包含
!
个
/\LV
保守结
构域*$&+!在植物中
/\LV/
过表达可以增强对非生
物胁迫的耐受性*%$+
aM50
D
等*$,+用
V6507Q@T3
软
件分析了
@)A#,#,+1
启动子区的顺式作用元件!
@)A#,#,+1
启动子在
!&S
K
到
%!S
K
上游片段
之间含有
C@C@(S;N
"
C@C@@@C
#!有对热激
"
\L3
#)低温"
ECT
#和乙烯"
3T3
#响应的顺式作用
元件!
%
个
\L3
位于
$#S
K
)
1,S
K
和
1!#S
K
处! 个
ECT
位于
#!,S
K
和
&*!S
K
处将
@)A#,#,+1
翻译起始密码子上游
#*#"S
K
的序列
和
)
个启动子截短体结合到
!"#
报告基因上!转到
拟南芥中!结果显示
WGL
染色出现在植物所有的
器官中!尤其是热处理后的维管组织中在转基因
拟南芥中!热休克状态下的全长启动子驱动的
WGL
表达量更高!但是在其他非生物胁迫中没有检查到
WGL
活性截短体分析表明
@)A#,#,G1
的
#,1
S
K
到
,,#S
K
区域是启动子响应高温所必需的
<+<
!
反式作用因子
植物基因启动子序列包含多种重要的顺式作用
元件!而其在转录水平的调控是与反式作用因子相
互作用实现的"表
!
#!通过调控下游相应基因的表
达!使植物能够适应复杂多变的生长环境因此转
录因子与植物抗逆性密切相关!其编码产物参与信
号传递途径和基因表达调控过程!主要分为
@Va
%
3T3YV
)
ZJY
)
SaFV
)
AT2J
和
B@Q
类
)
个家族
其中!碱性亮氨酸拉链"
SaFV
#转录因子参与种子贮
藏基因表达)植物生长发育)光信号转导)病害防御)
生物和非生物胁迫响应以及
@Y@
敏感性等各种信
号的反应&干旱响应元件结合转录因子"
UT3Y
#可
特异地识别并结合干旱响应元件"
UT3
#!进而参与
逆境信号的传递!调控下游逆境响应基因的表达!提
高植物在逆境条件下的适应性和耐受能力
UT3Y
是可特异性识别并结合
UT3
顺式作用
元件的反式作用因子
UT3Y#@
%
Y
%
Q
和
UT3Y!
类转录因子参与不依赖于
@Y@
的低温)干旱或高
盐等胁迫响应途径&而
UT3Y#U
%
QY[$
则参与依赖
@Y@
的干旱或高盐等响应途径
QY[
是低温快速诱导的转录因子拟南芥中
@D!*&
启动子可被干旱)高盐和低温诱导*$1+
@D!*&
启动子含有
!
个干旱响应元件"
UT3
#!在调
控基因表达中起到重要的作用*$*+转录因子
UT3Y#@
可与
UT3
相互作用诱导耐胁迫基因表
达*#+在
@D!*&
控制下!为了降低非生物胁迫的
影响!植物体可靶向运输干旱响应调节因子*!&+
J545
D
=:M.(LM.0;c5].
等*$%+发现
@D!*&
包含
#
个
*
S
K
的
UT3
"
C@QQW@Q@C
#!与干旱和高盐的胁迫
有关!这个元件称为同向重复序列
#
"
UT#
#!
UT#
是
@D!*&
驱动的干旱诱导表达中的调控元件
E.
等*!,+用组成型的
+.H<%)#
启动子和
@D!*
启动
子分别驱动
B.FI,!%
基因转化烟草
%)#
#
B.FI,!%
转基因烟草在正常生长状况下!其生长
与发育发生改变!例如!苗期的生长速度快)开花和
成熟早)株高比野生型短等然而!
@D!*
#
B.FI(
,!%
转基因烟草比野生型对干旱胁迫的耐受性
强表明胁迫诱导型启动子
@D!*
可以提高植物对
干旱胁迫的耐性
L7;:].0
D
9O
等*)"+通过酵母单杂
交技术!从拟南芥
:UB@
文库中首次分离得到转录
*"!
#
期
!!!!!!!!!!!!!!
文添龙!等$高等植物胁迫诱导型启动子的研究进展
表
<
!
高等植物诱导型启动子具有的顺式作用元件及与其互作的反式作用因子
C5S69!
!
+*%(5:7.0
D
9694907/50>7M9.O.079O5:7.0
D
85.=%(5:7.0
D
R5:7;O/;R.0>=:.S69
K
O;4;79O.0M.
D
M9O
K
6507
顺式作用元件
+*%(5:7.0
D
9694907
序列
L9
d
=90:9
反式作用因子
B5.=%(5:7.0
D
R5:7;O
对胁迫响应
L7O9//:;0>.7.;0
W(S;N Q@QWCW \J)
!
WY[!
!
VF[%
光
E.
D
M7
F(S;N W@C@@ E9ZJYF
光
E.
D
M7
W@@CCQ9694907 W@@CCQ \L[
高温
\.
D
M794
K
9O57=O9
\L3 @@W@@CCCQ \/R/
高温
\.
D
M794
K
9O57=O9
A(S;N
"
C
#"
C
#
CW@Q
"
Q
%
C
#
AT2J
干旱%
@Y@UO;=
D
M7
%
@Y@
ECT3 WWQQW@QWC 3T[
%
@V!
低温%干旱
;7M9O4.5
%
>O;=
D
M7
QTC CWWQQW@Q QY[
低温%干旱
;7M9O4.5
%
>O;=
D
M7
ZJQ(6.]9 Q@CWCW B@Q
干旱%高盐%低温%
@Y@UO;=
D
M7
%
/567
%
M
;7M9O4.5
%
@Y@
UT3 C@QQW@Q@C 3T[
%
@V!
!
UT3Y
低温%干旱
;7M9O4.5
%
>O;=
D
M7
ZJYT CWWCC@W ZJY
干旱%高盐%低温%
@Y@UO;=
D
M7
%
/567
%
M
;7M9O4.5
%
@Y@
@YT3 @QWCWWQ SaFV @Y@
%高盐%干旱
@Y@
%
/567
%
>O;=
D
M7
Q3# CWQQ@QQWW 3T[
%
@V! @Y@
Q3% @QWQWCWQQCQ 3T[
%
@V! @Y@
ZJQT Q@Q@CW S\E\ @Y@
%干旱%低温
@Y@
%
>O;=
D
M7
%
M
;7M9O4.5
WQQ(S;N C@W@@WQQWQQ 3T[
乙烯
37M
<
6909
因子
QY[#
"即
D@F#
基因#!
QY[#
是单拷贝或
低拷贝基因!它编码
#
个
UT3
结合因子!含有
#
个
@Va
区!此区域是一个由
&"
个氨基酸组成的
UB@
结合域!其保守的结合域序列是
@
%
WQQW@Q
!
@Va
区包含特异的残基!能够决定它们结合
UT3
%
Q(O9(
K
957
元 件 的 能 力*)#+
W=7M5
等*%,+研 究 了 水 稻
"
$5
6
7.%.8*3.//
K
+*=:*).
#
$%D@F#
基因启动子
在渗透胁迫)氧化胁迫)水杨酸)
@Y@
和低温胁迫下
UT3Y#Y
产物的作用!结果显示转基因烟草在甘露
醇作用的条件下可以改善种子萌发)根的生长)膜的
稳定性和
!
!
(
二苯基
(#(
三硝基苯肼"
UVV#的抗自
由基活性
UT3
和
QTC
元件都包含了核心序列
QQW@Q
!它们普遍存在于低温)高盐或干旱胁迫响
应基因的启动子中!统称
QTC
%
UT3
"
Q(O9
K
957
%
>9(
M
<
>O57.;0O9/
K
;0/.P99694907
#元件!
UT3Y
转录因
子在胁迫条件下可与启动子中的
QTC
%
UT3
顺式
作用元件特异结合!可以激活许多逆境诱导基因的
表达!从而增强植物对逆境胁迫的耐受力
近年来的研究表明!顺式作用元件两端的侧翼
序列对启动子的诱导活性有重要影响!如$
E.
等*)!+
通过生物信息学分析了从拟南芥分离出的
)05#).
和
)05#)9
启动子!显示出含有
!
个
QTC
%
UT3
的
)05#)9
启动子比含有
#
个的
)05#).
启动子活性强&
进一步通过构建启动子截短体和交换顺式作用元件
两端侧翼序列!结果显示出侧翼序列严重影响启动
子的强度因此诱导型启动子的诱导活性不仅与启
动子上的顺式作用元件的类型有关!还与顺式作用元
件的数量)元件之间的侧翼序列有关&除此而外还与
与其互作的反式作用因子有关反式作用因子与顺
式作用元件的结合有强弱之分!结合强的有助于启动
下游基因的表达!结合弱的!下游基因的表达水平降
低*)%+!而且顺式作用元件上下游的侧翼序列!甲基化
修饰也影响反式作用因子与其结合*)$+!影响下游基
因的表达也有文献报道!转录因子保守结构域的序
列组成直接影响到蛋白的亲%疏水性)亚细胞定位)二
级结构和三级结构的形成等!进而决定其生理功能的
发挥因此!应用生物信息学方法可以对已知蛋白序
列进行比对)分析!推断和预测其结构和功能!可为选
择合适的试验方法提供理论参考!为胁迫诱导型基因
启动子的功能研究提供理论依据*))+
%
!
高等植物胁迫诱导型启动子的研究
方法
!!
高等植物胁迫诱导型启动子常用的研究方法主
要有生物信息学分析与预测)瞬时转化分析)缺失突
变分析)点突变)凝胶阻滞技术"
3ZL@
#)酵母单杂
交技术等近年来!一些新的研究方法也用于启动
子研究
=+;
!
生物信息学分析与预测
生物信息学分析与预测是目前研究启动子最常
用的方法获得启动子序列后!首先通过生物信息
学方法对启动子序列进行初步的预测和分析!分析
序列中可能含有的顺式作用元件目前常用的植物
启动子预测的相关数据库和软件资源有
3VU
"
9=(
"#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
]5O
<
;7.:
K
O;4;79O>575S5/9
#
*
)&
+
)
CTTU
"
7O50/:O.
K
(
7.;0O9
D
=657;O
<
O9
D
.;0/>575S5/9
#
*
),
+
)
CT@BL[@Q
"
7O50/:O.
K
7.;056O9
D
=657.;0RO;4
K
5779O0/7;
K
O;(
R.69/
#
*
)1
+
)
VE@Q3
"
K
6507)*%(5:7.0
D
O9
D
=657;O
<
UB@
9694907/
#
*
)*
+和
V6507Q@T3
"
K
6507)*%(5:7.0
D
O9
D
=(
657;O
<
9694907/
#
*
&"
+
)
种其中
VE@Q3
和
V6507(
Q@T3
为分析植物
UB@
序列上顺式作用元件常用
的数据库!可预测并提供顺式作用元件的位置)序列
和在特异启动子上的独立位点等信息
近年来!计算机预测法也开始用于推测基因组
UB@
序列的调控基序和保守序列
Z5
等*&#+提出
了一个不依赖于同源基因启动子序列比对的
Z;7.R
F0>9N9O
方法!它是用单个计数的原理!检索每
1(
49O
或每
#!(49O
寡聚核苷酸的存在!可应用于所有
拟南芥基因启动子和胁迫诱导表达的基因中!用于
研究基因组
UB@
的调控序列和识别表达基因的保
守基序
=+<
!
缺失突变和点突变分析
在确定某一段
UB@
序列为启动子之后!通常
通过
)b
端缺失)
%b
端缺失和中间缺失构建一系列启
动子序列缺失的截短体!然后构建截短体连接报告
基因的表达载体!并转化植物!根据转化植株中报告
基因的表达情况分析启动子诱导元件的作用常用
的报告基因有
%
(
葡聚糖酸醛苷酶"
%
(
D
6=:=O;0.>5/9
!
WGL
#)氯霉素乙酰转移酶"
:M6;O54
K
M90.:565:97
<
6
7O50/R9O5/9
!
Q@C
#)荧光素酶"
6=:.R9O5/9
!
EGQ
#和绿
色荧光蛋白"
D
O990R6=;O9/:907
K
O;79.0
!
W[V
#
点突变分析是研究启动子的特定核苷酸序列常
用的方法!一般是利用转座子插入突变或者是限制
性酶切除某一特定启动子元件!并通过该插入或缺
失启动子转化植物来确定特定序列的功能此方法
是研究启动子最常用的方法!如
C@C@
框和
Q@@C
框等都是运用此方法分析得到
=+=
!
瞬时转化分析
当外源基因导入植物细胞中以后!在瞬时表达
状态的基因转移中!引入细胞的外源
UB@
和宿主
细胞染色体
UB@
并不发生整合这些
UB@
一般
随载体进入细胞后
#!M
内就可以表达!并持续约
1"
M
左右瞬时转化技术是将一段启动子序列与报告
基因融合构建表达载体!一般通过农杆菌介导法转
化植物!并进行报告基因的分析检测*&!+瞬时转化
分析是确定一个启动子是否具有启动活性最常用的
方法!并不能说明启动子是否具有诱导性瞬时转
化分析常用于检测缺失突变和点突变
=>?
!
凝胶阻滞技术和
@A&%B
足迹分析法
凝胶阻滞实验"
969:7O;
K
M;O97.:4;S.6.7
<
/M.R7
5//5
<
!
3ZL@
#是一种简单快速检测蛋白质与特异
UB@
序列结合的技术*&%+!可用于体外研究启动子
与蛋白质的结合情况!以确定启动子的核心顺式作
用元件其原理为$在凝胶电泳中!由于电场的作
用!小分子
UB@
片段比其结合了蛋白质的
UB@
片
段向阳极移动的速度快!根据电泳迁移率的变化可
以确定蛋白质与核酸分子的结合情况因此!可以
将双链
UB@
片段的一端用同位素或地高辛标记!
再与蛋白质提取物混合后电泳!如果目的
UB@
与
特异性蛋白质结合!则其向阳极移动的速度受到阻
滞!通过放射性自显影技术!就可找到
UB@
结合蛋
白的样品
UB5/9
&
足迹分析法"
UB5/9
&
R;;7
K
O.07.0
D
#和
凝胶阻滞技术类似!都是用来研究顺式作用元件与
蛋白质结合的一种方法*&$+!该方法能确定与蛋白质
结合的
UB@
长度及序列其基本原理是用
UB5/9
&
部分水解已用单链末端标记的待测双链
UB@
!在
聚丙烯酰胺凝胶上形成以相差一个核苷酸为梯度的
UB@
条带&当
UB@
片段与其特异性蛋白结合后!
结合蛋白的区域受到蛋白的保护!免受
UB5/9
&
的
攻击!因此形成梯度中的空白区域再结合
UB@
化学测序法!就可知该结合的碱基序列
=+C
!
酵母单杂交技术
酵母单杂交"
J95/7;09(M
<
SO.>
#技术最早是
#**%
年由
E.
等从酵母双杂交技术发展而来*&)+!通
过对报告基因的表型检测!分析
UB@
与蛋白之间
的相互作用!用以研究真核细胞内的基因表达调控
由于酵母单杂交方法检测特定转录因子与顺式作用
元件专一性相互作用的敏感性和可靠性!现已被广
泛用于克隆细胞中含量微弱的)用生化手段难以纯
化的特定转录因子理论上!在单杂交检测中!任何
靶元件都可被用于筛选一种与之有特异结合区域的
蛋白
$
!
展望
逆境是一个长期存在的世界性难题植物处于
非生物胁迫时各种生理生化过程和营养状况受到不
同程度的伤害!严重影响着植物的生长和作物的产
量培育出新的抗逆作物!提高作物的产量已经成
为目前研究的热点用胁迫诱导型启动子与特定基
因融合!使植物在诱导条件下表达相应外源蛋白!既
节约能量!也不影响植物的正常生长发育!最终可以
##!
#
期
!!!!!!!!!!!!!!
文添龙!等$高等植物胁迫诱导型启动子的研究进展
避免外源基因对植物的不良效应"如转基因植株的
生长延迟和畸形发育#!显著提高作物在诱导条件下
外源基因的表达能力
YO50>56./9
等*&&+从咖啡
:U(
B@
中克隆了编码异黄酮还原酶类似蛋白的启动子
Q5FTE
!然后转化到烟草中!转基因烟草在机械损伤
叶片中
WGL
表达增强&
2M=O505
等*!1+把高温胁迫
启动子
/\LV/
转到拟南芥中!对其在高温胁迫条件
下进行组织化学分析!观测所有幼苗
WGL
表达情
况!结果显示转基因植物中
WGL
高水平表达
目前虽然对胁迫诱导型启动子有了较多的研
究!但大多还处于实验阶段!相比组成型启动子和组
织特异性启动子!诱导型启动子用于生产实践的还
很少!其原因!一是对诱导型启动子的研究起步晚&
二是诱导型启动子在非诱导条件下不启动转录或转
录活性很低!只有受到特定信号的刺激时才能使转
录活性显著提高一些胁迫诱导型启动子采用基因
工程的手段使部分作物的抗逆性有所提高!但对植
物的胁迫应答和抗逆性分子机制却完全不清楚对
于新的诱导型启动子的研究仍然是今后研究的热
点!将功能明确的胁迫诱导型启动子或人工合成的
嵌合型诱导启动子与抗虫)抗病或品质相关基因相
连接后转到植物中表达!使转基因植物根据需要在
合适的胁迫处理或外界诱导条件下诱导外源基因的
定时定量表达!是植物基因工程的研究方向之一
尽管一些诱导型启动子研究取得了一定的进展!但
至今仍有部分胁迫诱导转录因子及其大量的下游诱
导基因未被发现因此!胁迫诱导信号是如何传递
的!转录因子又是如何调控各种胁迫基因的表达!各
种胁迫基因又是如何发挥抗逆境胁迫活性等问题尚
需深入研究
参考文献!
*
#
+
!
2@LGW@Z
!
EFG?
!
ZFGT@L
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