全 文 ：书西北植物学报!
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"
#
#$
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!!
文章编号$
#""")$"!*
"
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#
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!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#"+(&"&
%
,
+-../+#""")$"!*+!"#$+"#+""&&
收稿日期$
!"#%)#")#&
&修改稿收到日期$
!"#%)##)!&
基金项目$福建省区域科技重大项目"
!"#%0%"#&
#
作者简介$杨
!
超"
#12&
#!女!硕士!助教!主要从事园艺植物遗传育种研究
3)45-6
$
77
88%!
!
#!&+894
"
通信作者$吴少华!硕士!博士生导师!教授!主要从事植物遗传育种研究
3)45-6
$
%$2!(11*%
!::
+894
中国水仙
1#!2$
基因的克隆与表达分析
杨
!
超!吴菁华!吴少华"
"福建农林大学 园艺学院!福州
%*"""!
#
摘
!
要$采用
;<)=>;
和
;?>3
技术!从中国水仙"
!"#$%&&&(")*(("@5A+$+%,*,&%&
#幼嫩花芽中分离得到
#
个与花
发育相关的
B?CD)E9F
基因!将其命名为
!(-.#
"
GH/I5/J
登录号为
K0("$%"$
#该基因全长
##**E
L
!含有
#
个
(&!E
L
的开放阅读框!编码
!*%
个氨基酸系统进化分析表明!该基因属于
-.#/0%1*
基因半定量
;<)=>;
分析
表明!该基因在水仙品种(金盏银台)和(玉玲珑)的花瓣*副冠*雄蕊和雌蕊中均有表达!且在雌蕊中的表达量最高
研究认为!该实验分离出的
!(-.#
基因在(玉玲珑)重瓣的形成过程中没有发挥重要的作用
关键词$中国水仙&花器官发育&
B?CD)E9F
基因&
!(-.#
基因
中图分类号$
M(2*
&
M(2&
文献标志码$
?
%&"()!*+
,
-(..#""/1#!2$0""&"
1
"2.
3((/-"41$("-3343#$5)##$5)-6"6-/)/3-3
N?0G>O59
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R
OS5
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PQDO59OS5
"
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H9TU9AV-8S6VSAH
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WS
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R
A-8S6VSAH5/XW9AH.VA
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7
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#
78.9-):9
$
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R
)AH65VHXB?CD)E9F
R
H/H/54HX!(-.#
"
GH/I5/J588H..-9/K0("$%"$
#
Z5.869/HX
TA94VOHT69ZHAESX9T!"#$%&&&(")*(("@5A+$+%,*,&%&S.-/
R
;<)=>;5/X;?>34HVO9X.+#**E
L
-/6H/
R
VOZ-VO5/9
L
H/AH5X-/
R
TA54H(&!E
L
ZO-8O-.85
L
5E6H9TH/89X-/
R
!*%54-/958-X.+=O
7
69
R
H)
/HV-85/56
7
.-.-/X-85VHXVO5VVOH
R
H/HEH69/
R
HXV9VOH-.0
%
-231T54-6
7
-.#6-/H5
R
H+;<)=>;AH@H56HX
VO5VVOHHF-.VH/8H9T!(-.#Z5.XHVH8V5E6H-/T69ZHA.
!
ZO-8OVOH6H@H6.ZHAHVOHO-
R
OH.V-/
L
-.V-6+.O9ZHXVO5VVOH!(-.#
R
H/HZO-8O869/HX-/VO-..VSX
7
X-X/9V
L
65
7
5/-4
L
9AV5/VA96H-/VOHT9A45V-9/
L
A98H..9TX9SE6HT69ZHA.9T
(
NS6-/
R
69/
R
)
+
;(
<
="-!.
$
!"#$%&&&(")*(("@5A+$+%,*,&%&
&
T69A569A
R
5/XH@H69
L
4H/V
&
B?CD)E9F
R
H/H
&
!(-.#
R
H/H
!!
中国水仙"
!"#$%&&&(")*(("@5A+$+%,*,&%&
#是
石蒜科水仙属的多年生草本植物!原产地中海地区!
是法国多花水仙的一个重要变种目前栽培的品种
主要有两种$(金盏银台)和(玉玲珑)(金盏银台)
是单瓣花!(玉玲珑)是重瓣花!是由于(金盏银台)的
雄蕊发生瓣化而形成的
目前!关于重瓣花形成的分子机制主要基于花
发育的
?I>C3
模型研究其中!
>
功能基因的突
变被认为是重瓣花形成的主要原因!然而!邓新杰等
分别从(金盏银台)和(玉玲珑)中克隆了
>
类功能
基因
!4-2#
并对其进行了分析!初步认定重瓣水
仙(玉玲珑)的形成并非由该基因序列的变化或表达
量的下降而引起的+#,此外!吴菁华等从(金盏银
台)中克隆了
I
类基因
!(.5
!分析表明中国水仙重
瓣花产生的原因可能是该基因在雄蕊中表达量的减
少以及在花瓣中表达量的增加导致雄蕊发生瓣
化+!,考虑到
I
功能基因同时参与了花瓣和雄蕊
的发育!影响第
!
轮和第
%
轮花器官的形态建成!推
测
I
功能基因可能与其它基因一起起作用!影响重
瓣花的形成同时!
CSE9-.
等通过对重瓣玫瑰的研
究表明!
?
功能基因表达领域的拓展也会引起重瓣
花的发生+%,
在模式植物拟南芥中!
?
类功能基因主要包括
-.#
和
-.!
基因+$)*,!该类基因不仅参与花分生组
织的建立+&,!而且决定花器官的形成!调控萼片和花
瓣的正常发育+$!(,!同时也能激活
I
类功能基因+2,
到目前为止!已经从牡丹"
."*6,%"&
77
#(%$6&"
[+
#
+
1
,
*文心兰"
8,$%9%:
#
+
#"
,
*日本晚樱"
.#,&
0",,*&%","
#
+
##
,
*油菜花"
;#"&&%$","
<
&[+
#
+
#!
,
*太
行花 "
4"%+",
=
%"#
<
*&(#%&
#
+
#%
,
*风 信 子 "
>
?
"/
$%,(+,&6#%*,("0%&
#
+
#$
,
*马铃薯"
@60",:(A*#6&/
:
#
+
#*
,
*山核桃"
B"#
?
"$"(+"
?
*,&%&
#
+
#&
,
*白桦"
;*(/
0"
<
0"(
?<
+
?
00"
#
+
#(
,等多种植物中克隆了
?
类功能
基因!并对其表达模式和功能开展了相关的研究
为了进一步了解中国水仙花型变异的分子机
理!本研究利用
;<)=>;
和
;?>3
技术!从(金盏银
台)的幼嫩花芽中克隆了
?
类基因
!(-.#
!并对其
进行了表达分析
#
!
材料和方法
$+$
!
材
!
料
供试材料为中国水仙(金盏银台)和(玉玲珑)
!
个品种!种球来源于主产区福建漳州经过一段时
间的水培后!分别取其幼嫩的花芽*叶片和盛花期的
花瓣*副冠*雄蕊*雌蕊等各个花器官!液氮处理后置
于
2"保存备用
$+>
!
方
!
法
$6>6$
!
中国水仙
1#!2$
基因的克隆
!
利用北京百
泰克生物技术有限公司的多糖多酚植物总
;0?
快
速提取试剂盒!提取中国水仙(金盏银台)的花芽的
总
;0?
!并进行电泳检测和
]C
值的测定利用
DB?;<
;?>3 8C0? ?4
L
6-T-85V-9/
试 剂 盒
"
>9/VH8O
公司#!将所提取的(金盏银台)幼嫩花芽
的
;0?
反转录成
8C0?
!作为
=>;
反应的模板
通过对
GH/I5/J
中单子叶植物的
-.#/0%1*
基
因家族成员的序列进行比较!查找*分析保守区序
列!应用
C0?B?0
软件设计
#
对简并引物
?=#
和
?=!
"表
#
#!
=>;
扩增目的片段根据所获得的
!(-.#
基因保守区
8C0?
的测序结果!设计
%^)
;?>3
的上游引物"
?=%
和
?=$
#和
*^);?>3
的下
游引物"
?=*
和
?=&
#!并进行槽式
=>;
反应"表
#
#反应结束后!
#_
琼脂糖凝胶电泳!回收符合预
期大小的目的片段!连接至
=BC
#2
)<
载体后!转化
到大肠杆菌
CU*
"
感受态细胞!送至上海博尚生物
技术有限公司测序
将已克隆并测序正确的中国水仙
!(-.#
基因
保守区!
%^
端和
*^
端的
8C0?
序列进行拼接整合!得
到中国水仙
!(-.#
基因全长
8C0?
序列!在该序
列起始密码子和终止密码子位置分别设计引物
?];W#
和
?];W!
"表
#
#!扩增
!(-.#
基因的
];W

$+>+>
!
生物信息学分析
!
利用
3F=?DN
的
=A9V)
=5A54
工具分析
!(-.#
基因的
8C0?
序列及其所
编码的蛋白质的结构特点"
OVV
L
$%%
ZZZ+HF
L
5.
7
+
9A
R
%
V996.
%
L
A9V
L
5A54+OV46
#&利用
0>I`
的
>9/)
.HA@HXC945-/DH5A8O
软件分析
!(-.#
基因的氨
基酸序列&并在
0>I`
上进行
E65.V
搜索!再利用
C0?B?0
软件分析
!(-.#
基因氨基酸序列的同
源性!构建系统进化树
$6>6?
!
中国水仙
1#!2$
基因的组织表达分析
!
为
了研究
!(-.#
基因在单瓣和重瓣两种水仙不同组
织器官中的表达特性!本研究利用
;<)=>;
技术进
行半定量分析分别提取(金盏银台)和(玉玲珑)的
表
$
!
引物序列
<5E6H#
!
DH
:
SH/8H9T
L
A-4HA.
目的条带扩增
?4
L
6-T-85V-9/9TTA5
R
4H/V
引物
=A-4HA
退火温度
<4
%
保守区
>9/.HA@HXAH
R
-9/
?=#
$
?"
G
%
<
#"
?
%
>
#
G
"
?
%
G
%
>
%
<
#
GG
"
?
%
>
#
?
"
?
%
G
#
GG?=!
$
>?<>>??G
*&
%^);?>3
第一轮
$
GG?GG?GG?G?<G???G>> &"
第二轮
$
G>???><>G<><<>G>>?<>G &$
*^);?>3
第一轮
$
>?<>>??G *&
第二轮
$
G?<<> *&
];W
?];W#
$
??G??];W!
$
<<><>?GG>>??G>
*&
(&
#
期
!!!!!!!!!!!!!
杨
!
超!等$中国水仙
!(-.#
基因的克隆与表达分析
花瓣*副冠*雄蕊*雌蕊和叶片的
;0?
并逆转录成
8C0?
!以中国水仙
-$(%,
基因"
GH/I5/J
登录号
K0
!"$1#!
#为内参!引物为
-$(%,@C
"
*^)G?)%^
#和
-$(%,DC
"
*^)
G>?><<>??G#
调整
8C0?
用量和循环数!使内参基因的表达量一
致!以调整后的
8C0?
模板量进行
!(-.#
基因的
=>;
分析!引物为
?IC[DN
"
*^)>>??><>?<)
G><??<)%^
#和
?IC[aN
"
*^)G<)
??><><>>>>>)%^
#
!
!
结果与分析
>6$
!
中国水仙
1#!2$
基因的克隆
以中国水仙(金盏银台)花芽总
;0?
逆转录成
的
8C0?
为模板!经
=>;
扩增!
=>;
扩增产物如图
#
所示!回收
=>;
产物并对其进行连接*转化和测
序!测序结果表明$扩增到的
!(-.#
基因的保守区
片段大小为
($&E
L
&
%^);?>3
片段大小为
*#$E
L
!
与保守区有
!"$E
L
的重叠区域!出现的第一个终止
密码子是
!在
%^
端有
#
个包含
#2
个
?
的多聚
腺苷尾巴"
L
69
7
?
#!在
L
96
7
?
之前
%!1E
L
处出现加
尾信号
??&
*^);?>3
的片段大小为
%11E
L
!
与保守区有
!&#E
L
的重叠区域!在第
#%1
位的
?上游还有长
#%2E
L
的
*^
端非编码区用
C0?B?0
软件拼接整合后发现!
!(-.#
基因的
8C0?
全长
##**E
L
!其中开放阅读框为
(&!E
L
!编
码
!*%
个氨基酸!
*^
非编码区为
#%2E
L
!
%^
非编码区
为
!**E
L

对
!(-.#
基因的
];W
进行
=>;
扩增!结果
表明!所扩增的片段大小为
(&!E
L
!利用
C0?B?0
序列比对可知该核苷酸序列与所拼接的
8C0?
全
长序列一致将该基因命名为
!(-.#
基因!在
GH/I5/J
中登录!登录号为
K0("$%"$

>+>
!
生物信息学分析
利用
3F=?DN
的
=A9V=5A54
工具分析中国水
仙
!(-.#
基因所编码的氨基酸序列!结果表明$该
蛋白的分子量是
!22(!+&C5
!理论等电点
1+%2
!总
原子数
$"*"
!原子组成为
>
#!%2
U
!"%2
0
%($
]
%1"
D
#"
!
2"
/4
处的消光系数为
!$"(*
!脂肪系数
2#+(2
!不稳
定系数
&$+!!
!说明该蛋白是一个不稳定蛋白!总平
均亲水性
"+($!
!说明该蛋白是一个亲水蛋白
利用
0>I`
的
>9/.HA@HXC945-/DH5A8O
软件
对中国水仙
!(-.#
基于的氨基酸序列进行分析!
得到
!
个保守结构域!在氨基酸序列的
!
#
(&
位处
图
#
!
中国水仙
!(-.#
基因
=>;
扩增产物
B+C[!"""
&
?D+
保守区&
?D%^+%^);?>3
&
?D*^+*^);?>3
&
?];W+];W
W-
R
+#
!
=>;
L
A9XS8V9T!(-.#
R
H/HTA94!"#$%&&&(")*(("@5A+$+%,*,&%&
B+C[!"""
&
?D+>9/.HA@HXAH
R
-9/
&
?D%^+%^);?>3
&
?D*^+*^);?>3
&
?];W+];W
表
>
!
用于进行系统进化分析的基酸序列
<5E6H!
!
:
SH/8H.ZO-8OV9EH45XH
L
O
7
69
R
H/HV-8VAH..
类别
>65..
氨基酸序列
?4-/958-X.H
:
SH/8H
?
华山姜
-.#
*油棕
-.#
*麝香百合
-.#
*石斛兰
-.#
*郁金香
-.#
*蕙兰
-.#
*金鱼草
-.#
*烟草
-.#
*拟南芥
-.#-0
<
%,%"
6A06,
=
%
7
60%"
"
?ID2%**2
#!
E0"*%&
=
%,**,&%&
"
??M"%!!#
#!
3%0%:06,
=
%
7
06#:
"
?C<(2*2%
#!
F*,9#6A%: ,6A%0*
"
?IM"2*(%
#!
40%
<
"
=
*&,*#%","
"
I?K"1$*!
#!
B
?
:A%9%:
7
"A*#%
"
?G3#*$1&
#!
-,(%##+%,::"
G
&
"
>??$*!!2
#!
!%$6(%/
","("A"$:
"
??C"#$!#
#!
-#"A%96
<
&%&(+"0%","
"
>??(21"1
#
I
拟南芥
=` -#"A%96
<
&%&(+"0%","
"
0=#1(*!$
#
>
拟南芥
?G-#"A%96
<
&%&(+"0%","
"
0=*&(*&1
#
C
拟南芥
@4H
*拟南芥
@>.#
*拟南芥
@>.!-I(+"0%","
"
0=2$1%*#
#!
-I(+"0%","
"
0=""#"(2%##
#!
-I(+"0%","
"
0=2*"%((
#
3
拟南芥
-23%
*拟南芥
-231
*拟南芥
@E.#
*拟南芥
@E.!-I(+"0%","
"
=!1%2%
#!
-I(+"0%","
"
??I&(2%!
#!
-I(+"0%","
"
0=*&2%!!
#!
-I(+"0%","
"
0=#2&22"
#
2&
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
存在
#
个高度保守的
B?CD)B3W!)6-JH
结构域!在
1"
#
#&2
位处存在
#
个
b)E9F
结构域!说明所克隆
的基因属于典型的
B?CD)E9F
家族基因
为了研究中国水仙
!(-.#
基因与其它
B?CD)
E9F
基因的关系!选取
B?CD)E9F
基因家族中的
*
个
亚家族基因"
?
*
I
*
>
*
C
*
3
类功能基因!表
!
#!利用
C0?B?0
软件!构建系统进化树"图
!
#!结果显示!
所克隆出的基因属于
?
类功能基因此外!
?
类基
因明显分为单子叶和双子叶两个分支!中国水仙与百
合*郁金香等单子叶植物聚为一支!亲缘关系较近
经
I65.V
分析发现!所克隆的
!(-.#
基因编码的
氨基酸序列与其它物种中已知的
-.#/0%1*
基因氨基
酸序列具有较高的相似性!其中与华山姜"
-0
<
%,%"
6A06,
=
%
7
60%"
!
?ID2%**2
#的相似性为
2#_
!与油棕
"
E0"*%&
=
%,**,&%&
!
??M"%!!#
#的相似性为
2"_
!与
麝香百合"
3%0%:06,
=
%
7
06#:
!
?C<(2*2%
#的相似性
为
(2_
!与石斛兰"
F*,9#6A%:,6A%0*
!
?IM"2*(%
#*
郁金香"
40%
<
"
=
*&,*#%","
!
I?K"1$*!
#*蕙兰"
B
?
:/
A%9%:
7
"A*#%
!
?G3#*$1&
#的相似性均为
((_

将它们的氨基酸序列进行多重比对分析!结果
图
!
!
中国水仙
!(-.#
基因系统进化树
W-
R
+!
!
=O
7
69
R
H/HV-8VAHH9TVOH!(-.#
R
H/HTA94!"#$%&&&(")*(("@5A+$+%,*,&%&
图
%
!
不同植物
-.#/0%1*
氨基酸多重序列比对分析
W-
R
+%
!
BS6V-
L
6H56-
R
/4H/V9T
L
AHX-8VHX54-/958-X.H
:
SH/8H.9T-.#/0%1*TA94X-TTHAH/V
L
65/V.
1&
#
期
!!!!!!!!!!!!!
杨
!
超!等$中国水仙
!(-.#
基因的克隆与表达分析
图
$
!
!(-.#
基因在(金盏银台)"
?
#和(玉玲珑)"
I
#不同花器官中的表达
?+
金盏银台$
#+
花瓣&
!+
副冠&
%+
雄蕊&
$+
雌蕊&
*+
叶片&
I
玉玲珑$
#+
花瓣&
!+
副冠&
%+
外层瓣化雄蕊&
$+
内层瓣花雄蕊&
*+
雌蕊&
+
叶片
W-
R
+$
!
R
H/HHF
L
AH..-9/-/X-TTHAH/V
L
5AV.9TT69ZHATA94
(
K-/YO5/
7
-/V5-
)"
?
#
5/X
(
NS6-/
R
69/
R
)"
I
#
?+K-/YO5/
7
-/V5-
$
#+=HV56
&
!+>9A9/5
&
%+DV54H/
&
$+=-.V-6
&
*+W96-5
R
H
&
I+NS6-/
R
69/
R
$
#+=HV56
&
!+>9A9/5
&
%+]SVHA.V54H/
&
$+`//HA.V54H/
&
*+=-.V-6
&
+W96-5
R
H
"图
%
#可以看出!中国水仙
!(-.#
基因与其它物种
的
B?CD)E9F
基因相似性较高!中国水仙
!(-.#
基因在
*^
端保守性较强!且在
>
末端具有典型的单
子叶植物的
-.#
基序"
[==PB[
#!说明所克隆的
基因属于
B?CD
基因家族的
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功能基因
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基因在不同组织器官中的表达模式
为了分析
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基因是否参与重瓣水仙(玉
玲珑)的形成!本试验以中国水仙
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基因为内
参!采用半定量
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方法!分析
!(-.#
基因在
单瓣水仙和重瓣水仙中的组织特异性表达!结果"图
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*
I
#表明!该基因在(金盏银台)和(玉玲珑)的叶
片中都没有表达!但在花瓣*副冠*雄蕊*雌蕊中都有
表达!其中!在雌蕊中的表达量最高!在副冠中的表
达量最低
%
!
讨
!
论
B5/XH6
等的研究表明!
-.#
基因能够通过
JK8
基因控制
-.%
和
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等
I
功能基因的表达区
域!以转录激活因子的方式决定花瓣的特异性+&,
基于吴菁华等的研究!中国水仙重瓣花的产生可能
与
I
类功能基因
!(.5
有关+!,为了了解
-.#
类
基因在中国水仙花发育过程中的作用!本研究克隆
了一个中国水仙
?
类基因!经过
I65.V
比对分析*系
统进化分析得出!该基因属于
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基因!并将
其命名为
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基因
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等的研究表明!在拟南芥中!
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功能基
因主要参与萼片和花瓣的发育!只有当
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基因拓展
到第
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轮花器官中表达时!雄蕊发育成花瓣!心皮
发育成萼片!从而产生花中花的重瓣形态+#2,吕山
花从太行花"
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#中克隆了一个
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基因!构建该基因的过量表达载体!转基因拟
南芥的雄蕊发生瓣化+#%,然而!在本研究中!
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-.#
基因在中国水仙的各轮花器官中均有不同程
度的表达!这与经典的
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模型不完全一致!意味
着在中国水仙中!
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类基因存在功能多样性!这
种表达模式在其它植物中也存在在日本晚樱
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基因在四轮花器官
中表达!且表达情况基本一致+##,荷花玉兰"
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同源基因在花朵的各个
器官和组织以及叶片中都有不同程度的表达+#1,
在文心兰中!
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同源基因
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在萼片*花
瓣*唇瓣*合蕊柱以及叶片*花茎中均有表达!其中!
在合蕊柱中的表达量最高+#",在石斛兰中!
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基
因参与各轮花器官的形成!且在蕊柱中高丰度表
达+!",这说明在很多情况下!
?=#
类基因的表达与
模式植物拟南芥存在一定的差异!推测中国水仙
0V?=#
基因可能参与决定花瓣*副冠以及雌雄蕊原
基的特性此外!由于该基因在(金盏银台)和(玉玲
珑)中的表达模式完全一致!可认为本研究分离到的
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基因在中国水仙重瓣的发生中没有发挥重要
的作用
参考文献!
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