全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４５(２): １９８￣２０４(２０１５)
收稿日期: ２０１４￣０３￣２５ꎻ 修回日期: ２０１４￣１１￣１８
基金项目: 公益性(农业)行业科研专项(２０１００３０６５)ꎻ 国家自然科学基金资助项目(３１１７１８１４)
通讯作者: 周雪平ꎬ教授ꎬ主要研究方向为植物病理学ꎻ Ｔｅｌ:５７１８￣８９８２６８０ꎬＦａｘ:５７１８￣６９７１４９８ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｚｚｈｏｕ＠ｚｊｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
共同第一作者: 顾周杭ꎬ男ꎬ博士研究生ꎬ主要研究方向为植物病理学ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｈｚｇｕ＠ｚｊｕ.ｅｄｕ.ｃｎ
胡高洁ꎬ女ꎬ硕士ꎬ主要研究方向为植物病理学ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｚｊｕ＿ｈｇｊ＠１２６.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１５.０２.０１１
侵染扶桑和棉花的木尔坦棉花曲叶病毒侵染性
克隆构建及致病性测定
顾周杭＃ꎬ 胡高洁＃ꎬ 谢 艳ꎬ 周雪平∗
(浙江大学 农业与生物技术学院 生物技术所ꎬ杭州 ３１００５８)
摘要:从广东广州扶桑和广西南宁棉花中分离得到木尔坦棉花曲叶病毒(Ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｍｕｌｔａｎ ｖｉｒｕｓꎬ ＣＬＣｕＭＶ)的 ２个分
离物 ＧＤ３７和 ＧＸ０１ꎬ序列分析表明两分离物的基因组全序列同源性为 ９９.４％ꎬ卫星分子序列同源性为 ９９.２％ꎮ 构建了
ＧＤ３７和 ＧＸ０１的侵染性克隆ꎬ农杆菌接种表明 ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７能侵染本氏烟、心叶烟、三生烟、普通烟ꎬＧＤ３７和 ＧＤ３７β共
同接种产生叶片下卷、植株矮化等症状ꎬ但不能侵染棉花、番茄、矮牵牛ꎻ而分离自棉花的 ＣＬＣｕＭＶ ＧＸ０１能够侵染本氏烟ꎬ
ＧＸ０１和 ＧＸ０１β共同接种在本氏烟上产生叶片下卷皱缩等症状ꎬ但不能侵染棉花ꎮ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ￣ｂｌｏｔ结果表明在 ＧＤ３７单独侵
染或与 ＧＤ３７β共同侵染的植株中均能检测到相应 ＤＮＡ分子的积累ꎮ
关键词:木尔坦棉花曲叶病毒ꎻ 侵染性克隆ꎻ 致病性
Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｌｏｎｅｓ ｏｆ Ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ
Ｍｕｌｔａｎ ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓｉｎｅｎｓｉｓ ａｎｄ Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ ＧＵ Ｚｈｏｕ￣
ｈａｎｇꎬ ＨＵ Ｇａｏ￣ｊｉｅꎬ ＸＩＥ Ｙａｎꎬ ＺＨＯＵ Ｘｕｅ￣ｐｉｎｇ ( Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏ￣
ｇｙꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００５８ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ｔｗｏ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｍｕｌｔａｎ ｖｉｒｕｓ (ＣＬＣｕＭＶ)ꎬ ＧＤ３７ ａｎｄ ＧＸ０１ ｗｅｒｅ ｏｂ￣
ｔａｉｎｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａｓｉｎｅｎｓｉｓ ｉｎ Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ ｐｒｏｖｉｎｃｅ ａｎｄ Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ ｉｎ Ｇｕａｎｇｘｉ ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ ｒｅｓｐｅｃ￣
ｔｉｖｅｌｙ. Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ ａｎｄ ＣＬＣｕＭＶ ＧＸ０１ ｉｓ ９９.４％ꎬ ａｎｄ
ｔｈｅ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｈｅｉｒ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｂｅｔａｓａｔｅｌｌｉｔｅｓ(ＧＤ３７β ａｎｄ ＧＸ０１β)ｉｓ ９９.２％. Ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｌｏｎｅｓ ＧＤ３７
ａｎｄ ＧＸ０１ ｗｅｒｅ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｉｅｓ ｗｅｒｅ ｔｈｅｎ ｔｅｓｔｅｄ ｂｙ ａｇｒｏｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ. Ｉｔ ｗａｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ
ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ ｃｏｕｌｄ ｉｎｆｅｃｔ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａꎬ Ｎ. ｇｌｕｔｉｎｏｓａꎬ Ｎ. ｔａｂａｃｕｍ Ｓａｍｓｕｎ ａｎｄ Ｎ. ｔａｂａｃｕｍ ｐｒｏｄｕ￣
ｃｉｎｇ ｄｏｗｎｗａｒｄ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓꎬ ｂｕｔ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｉｎｆｅｃｔ ｃｏｔｔｏｎꎬ ｔｏｍａｔｏ ａｎｄ ｐｅｔｕｎｉａ. Ｃｏ￣ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＬＣｕＭＶ
ＧＸ０１ ｗｉｔｈ ｉｔｓ ｂｅｔａｓａｔｅｌｌｉｔｅ ＧＸ０１βꎬ ｗｈｉｃｈ ｗｅｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｃｏｔｔｏｎꎬ ｃｏｕｌｄ ｉｎｄｕｃｅ ｓｅｖｅｒｅ ｄｏｗｎｗａｒｄ
ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎ Ｎ. ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａꎬ ｂｕｔ ｃｏｕｌｄ ｎｏｔ ｉｎｆｅｃｔ ｃｏｔｔｏｎ. Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ ａｎａｌｙｓｉｓ ｓｈｏｗｅｄ ＣＬＣｕＭＶ
ＤＮＡ ｃｏｕｌｄ ｂｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｂｏｔｈ ＧＤ３７￣ ａｎｄ ＧＤ３７ ＆ＧＤ３７β￣ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｍｕｌｔａｎ ｖｉｒｕｓꎻ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｌｏｎｅꎻ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙ
中图分类号: Ｓ４３２.４４ 文献标识码: Ａ 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１５)０２￣０１９８￣０７
棉花曲叶病(ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｄｉｓｅａｓｅꎬ ＣＬＣｕＤ)
是一种在印度半岛地区(特别是印度和巴基斯坦
等地)严重危害棉花生产的病害[１ꎬ２]ꎮ ＣＬＣｕＤ 由
烟粉虱传播ꎬ典型的症状是植株叶片向上或向下卷
曲、叶脉颜色加深、叶背面叶脉膨大和耳突增生ꎬ形
成杯状侧叶ꎬ植株矮化ꎬ棉纤维低产ꎬ棉铃少结或不
２期 顾周杭ꎬ等:侵染扶桑和棉花的木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆构建及致病性测定
结ꎬ可造成严重减产ꎬ甚至绝收[３]ꎮ
木尔坦棉花曲叶病毒(Ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ Ｍｕｌｔａｎ
ｖｉｒｕｓꎬ ＣＬＣｕＭＶ)属双生病毒科(Ｇｅｍｉｎｉｖｉｒｉｄａｅ)中
的菜豆金黄花叶病毒属(Ｂｅｇｏｍｏｖｉｒｕｓ)ꎬ病毒粒子
为双联体颗粒形态ꎬ基因组为单链环状 ＤＮＡꎬ大小
约 １８~２０ ｎｍ×３０ ｎｍ[４]ꎮ 该病毒在印度和巴基斯
坦等地对当地棉花产业造成了毁灭性的破坏ꎮ
２００６年以来ꎬ我国已在广东的朱槿(扶桑) [５~７]、黄
秋葵[５ꎬ８ꎬ９]、垂花悬铃花[１０]、广西的朱槿[１１] 和棉
花[１２]等植物上分离到了 ＣＬＣｕＭＶꎬ而国内对于该
病毒的研究主要集中在病毒分离物基因组序列的
测定上[７ꎬ９~１１]ꎮ Ｈｅ等[１３]曾简要报道该病毒的侵染
性克隆ꎬ其工作主要是在本氏烟上开展ꎮ
本文测定了从广东扶桑和广西棉花上分离得
到的 ＣＬＣｕＭＶ分离物 ＧＤ３７ 和 ＧＸ０１ 及其伴随的
卫星 ＤＮＡ(ＤＮＡβ)的全基因组序列ꎬ构建 ＧＤ３７
和 ＧＸ０１的侵染性克隆ꎬ并测定了它们在多种植物
上的致病性ꎬ为今后对该病毒进一步的研究提供了
技术支持ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 毒源和病毒 ＤＮＡ提取
ＧＤ３７分离物为 ２００７年 ７月 １２日采自广东广
州地区的扶桑ꎬ病株表现为曲叶、叶片边缘上卷、脉
突和耳突等症状(图 １)ꎮ ＧＸ０１ 分离物为 ２０１０ 年
８月采自广西南宁地区的棉花ꎬ病株表现为叶片轻
微下卷症状ꎮ 采用 ＣＴＡＢ 法提取扶桑总 ＤＮＡꎬ利
用 Ｐｅｒｍｉｎｇｅａｔ 等人报道的方法[１４]提取棉花的总
ＤＮＡꎮ
１.２ 克隆和序列测定
以提取的 ＧＤ３７ 和 ＧＸ０１ 分离物感染的植株
总 ＤＮＡ为模板ꎬ以双生病毒通用引物 ＰＡ和 ＰＢ进
行 ＰＣＲ扩增ꎬ分别得到约 ５００ ｂｐ 左右片段ꎬ连接
到 ｐＧＥＭ￣Ｔ Ｅａｓｙ 载体上ꎬ进行测序ꎮ 根据测序结
果ꎬ分别设计针对 ＧＤ３７和 ＧＸ０１ 分离物的背向引
物 ＧＤ３７ｆｕｌｌＦ、ＧＤ３７ｆｕｌｌＲ及 ＧＸ０１ＡＦ、ＧＸ０１ＡＲ(表
１)ꎬ对相应分离物进行扩增ꎬ并构建到 ｐＧＥＭ￣Ｔ
Ｅａｓｙ 载体上ꎬ得到 ｐＧＥＭ￣Ｔ￣ＧＤ３７Ａ 和 ｐＧＥＭ￣Ｔ￣
ＧＸ０１Ａꎬ进行序列测定ꎮ
利用双生病毒卫星 ＤＮＡ分子通用引物 β０１和
β０２[１５]对 ２个分离物 ＤＮＡ 进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ所得片
段连接到 ｐＧＥＭ￣Ｔ Ｅａｓｙ载体上ꎬ分别得到 ｐＧＥＭ￣Ｔ￣
ＧＤ３７β和 ｐＧＥＭ￣Ｔ￣ＧＸ０１βꎬ进行序列测定ꎮ
１.３ 侵染性克隆构建
以提取的 ＧＤ３７分离物感染的扶桑总 ＤＮＡ为
模板ꎬ利用特异性引物 ＧＤ３７ＢａｍＨ Ｉ Ｆ / Ｒ(两端引
入酶切位点 ＢａｍＨ Ｉ)ꎬ通过 ＰＣＲ 方法扩增得到单
拷贝的病毒基因组全长 ＤＮＡꎬ连接至 ｐＧＥＭ￣Ｔ
Ｅａｓｙ载体上ꎬ得到 ｐＧＥＭＴ￣ＧＤ３７ꎬ序列经过测序验
证ꎮ 用 Ｘｂａ Ｉ 和 ＢａｍＨ Ｉ 对 ｐＧＥＭＴ￣ＧＤ３７ 进行双
酶切 ꎬ得到７ ８ ６ ｂｐ的条带 ꎬ插入植物双元表达
Ｆｉｇ. １ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｏｎ ａｂａｘｉａｌ (Ａ) ａｎｄ ａｄａｘｉａｌ (Ｂ) ｏｆ Ｈｉｂｉｓｃｕｓ ｒｏｓａ￣ｓｉｎｅｎｓｉｓ ｌｅａｆ
Ｅｎａｔｉｏｎｓ ａｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ａｒｒｏｗｓ.
９９１
植物病理学报 ４５卷
载体 ｐＢｉｎＰＬＵＳ 中ꎬ得到 ｐＢｉｎＰＬＵＳ￣０.３ＧＤ３７ꎮ 同
时对 ｐＧＥＭＴ￣ＧＤ３７ 进行 ＢａｍＨ Ｉ 单酶切ꎬ得到约
２.７４ ｋｂ 的条带ꎬ将其插入经 ＢａｍＨ Ｉ 单酶切的
ｐＢｉｎＰＬＵＳ￣０.３ＧＤ３７ꎬ从而获得含有 １.３ 个重复拷
贝的 ＧＤ３７ 侵染性克隆 ｐＢｉｎＰＬＵＳ ＧＤ３７ꎮ 以
ＧＤ３７ 感染的扶桑总 ＤＮＡ 为模板ꎬ引物 β０１ 和
β０５(不含 Ｋｐｎ Ｉ位点)进行 ＰＣＲ扩增ꎬ扩增产物同
样连接到 ｐＧＥＭ￣Ｔ Ｅａｓｙ 载体上ꎬ得到 ｐＧＥＭＴ￣
ＧＤ３７β０１０５序列经过测序验证ꎮ ｐＧＥＭ￣Ｔ￣ＧＤ３７β
经 Ｋｐｎ Ｉ 酶切后ꎬ插入到同样用 Ｋｐｎ Ｉ 酶切的
ｐＧＥＭＴ￣ＧＤ３７β０１０５ꎬ获得正向重复的两个拷贝的
克隆 ｐＧＥＭＴ￣２ＧＤ３７βꎮ 这一克隆经 ＥｃｏＲ Ｉ 酶切
后插入植物双元表达载体 ｐＢｉｎＰＬＵＳ 的相应酶切
位点中ꎬ得到含有正向重复的 ２ 个拷贝的 ＧＤ３７
ＤＮＡβ侵染性克隆 ｐＢｉｎＰＬＵＳ ＧＤ３７βꎮ
以 ＧＸ０１ 分离物感染的棉花总 ＤＮＡ 为模板ꎬ
分别利用 ＧＸＡ Ｓａｌ Ｉ Ｆ、ＧＸＡ Ｓａｌ Ｉ Ｒ和 ＧＸＡ Ｘｂａ Ｉ
Ｆ、ＧＸＡ Ｓａｌ Ｉ Ｒ两对特异引物ꎬ通过 ＰＣＲ方法扩增
分别得到 １个拷贝和 ０.８ 个拷贝的基因组片段ꎬ分
别连接至 ｐＧＥＭ￣Ｔ Ｅａｓｙ 载体上ꎬ得到 ｐＧＥＭＴ￣
ＧＸ０１ 和 ｐＧＥＭＴ￣０. ８ＧＸ０１ꎬ序列经过测序验证ꎮ
用 Ｓａｌ Ｉ 和 Ｓａｌ Ｉ、Ｘｂａ Ｉ 分别对 ｐＧＥＭＴ￣ＧＸ０１ 和
ｐＧＥＭＴ￣０.８ＧＸ０１进行酶切ꎬ分别得到 １ 个拷贝和
０.８个拷贝的基因组片段ꎬ先将 ０.８ 个拷贝的基因
组片段插入植物双元表达载体 ｐＣａｍｂｉａ２３００中ꎬ得
到 ｐＣａｍｂｉａ￣０.８ＧＸ０１ꎬ再对 ｐＣａｍｂｉａ￣０.８ＧＸ０１ 进行
Ｓａｌ Ｉ 单酶切后将全长基因组片段 ＧＸ０１ 插入
ｐＣａｍｂｉａ￣０.８ＧＸ０１ꎬ从而获得含有 １.８ 个重复拷贝
的 ＧＸ０１ 侵 染 性 克 隆 ｐＣａｍｂｉａ￣ＧＸ０１ꎮ ＧＸ０１
ＤＮＡβ的侵染性克隆构建采用了与 ＧＸ０１ ＤＮＡ￣Ａ
相同的策略ꎬ获得侵染性克隆 ｐＣａｍｂｉａ￣ＧＸ０１￣βꎮ
１.４ 农杆菌接种
将构建好的侵染性克隆 ｐＢｉｎＰＬＵＳ ＧＤ３７、ｐＢｉｎ￣
ＰＬＵＳ ＧＤ３７β、ｐＣａｍｂｉａ￣ＧＸ０１和 ｐＣａｍｂｉａ￣ＧＸ０１￣β通
过电击转化的方式导入农杆菌菌株 ＥＨＡ１０５中ꎬ分
别命名为 ＧＤ３７、ＧＤ３７β、ＧＸ０１ 和 ＧＸ０１βꎮ 浸润
接种前ꎬ用浸润缓冲液 ( １０ ｍＭ ＭｇＣｌ２ꎬ １０ ｍＭ
ＭＥＳꎬ２００ ｍＭ 乙酰丁香酮)将菌液 ＯＤ６００ 调整为
１.０左右ꎬ静置 ２ ~ ３ ｈ 后浸润植物ꎮ 共同接种时ꎬ
ＧＤ３７、ＧＤ３７β或者 ＧＸ０１、ＧＸ０１β 菌液以 １ ∶ １ 的
比例混合后ꎬ进行浸润ꎮ 浸润时ꎬ取一支不带针头
的 １ ｍＬ一次性注射器在 ５ ~ ６ 叶期植物叶片进行
叶背浸润ꎮ
１.５ 供试植物及培养条件
本氏烟、心叶烟、三生烟、普通烟、番茄、矮牵牛
由本实验室提供ꎮ 棉花品种浙农 ９０５、浙大 ３ 号、
ＴＭ￣１种子由浙江大学作物科学技术研究所祝水
金教授馈赠ꎮ 植物在温度 ２５℃ / １８℃ꎬ光照时间
１６ / ８ ｈ的温室中培养ꎮ
１.６ Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ
将提取的植物总 ＤＮＡ １０ μｇꎬ进行 ０.８％琼脂糖
凝胶电泳ꎬ转移到尼龙膜上ꎬ分别用 ＧＤ３７和 ＧＤ３７β
特异性探针进行 Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ 检测ꎮ 具体参见
Ｒｏｃｈｅ ＤＩＧ Ｈｉｇｈ Ｐｒｉｍｅ Ｌａｂ / Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ说明书ꎮ
２ 结果与分析
２.１ ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ 和 ＧＸ０１ 的分离鉴定和序
列分析
序列测定发现ꎬＧＤ３７ 和 ＧＸ０１ 全长基因组均
为 ２ ７３８ 个核苷酸(ｎｔｓ) (ＧｅｎＢａｎｋ 登录号分别为
ＪＮ９６８５７３和 ＪＱ３１７６０３)ꎮ ＢＬＡＳＴ 比对发现 ＧＤ３７
和 ＧＸ０１的全基因组序列与 ＣＬＣｕＭＶ的同源性均
大于 ９７.１％ꎬ表明 ＧＤ３７和 ＧＸ０１是 ＣＬＣｕＭＶ的 ２
个分离物ꎬ而 ＧＤ３７ 与 ＧＸ０１ 之间的同源性达
９９.４％ꎮ 选择 ＧＤ３７分离物进行基因组结构分析ꎬ
ＧＤ３７ 具有典型的单组份双生病毒基因组结构特
征ꎬ共编码 ６个 ＯＲＦｓꎬ分别为 ＡＶ１(外壳蛋白)、ＡＶ２
(运动蛋白)、ＡＣ１(复制蛋白)、ＡＣ２(转录激活子)、
ＡＣ３(复制增强子)和 ＡＣ４ꎮ ＩＲ 区位于 ２ ５８８ ~ １１６
ｎｔｓꎬ含有茎环结构和保守的九核苷酸序列 ＴＡ￣
ＡＴＡＴＴ / ＡＣ[１６]ꎻＴＡＴＡ￣ｂｏｘ位于 ２ ６５３~２ ６５６ ｎｔｓꎻ核
心重复序列 ＧＧＡＧＡ位于 ＴＡＴＡ￣ｂｏｘ ５’端的 ２ ６０３
~２ ６０７ ｎｔｓ、２ ６３６~２ ６４０ ｎｔｓ和 ２ ６４３~２ ６４７ ｎｔｓꎮ
ＧＤ３７ 和 ＧＸ０１ 均含有卫星 ＤＮＡ(ＧＤ３７β 和
ＧＸ０１β)ꎬＧＤ３７β和 ＧＸ０１β 基因组全长均为 １ ３４７
ｎｔｓ(ＧｅｎＢａｎｋ登录号 ＪＮ９６８５７４和 ＪＱ３１７６０４)ꎮ 经过
ＢＬＡＳＴ比对发现ꎬＧＤ３７β和ＧＸ０１β与 ＣＬＣｕＭＶ伴
随的 ＤＮＡβ 同源性大于 ９８. ９％ꎬ表明 ＧＤ３７β 和
ＧＸ０１β 均属于 ＣＬＣｕＭＶ 卫星 ＤＮＡβ(Ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ
ｃｕｒｌ Ｍｕｌｔａｎ ｂｅｔａｓａｔｅｌｌｉｔｅꎬ ＣＬＣｕＭＢ)ꎬ而 ＧＤ３７β 与
ＧＸ０１β之间同源性达９９ .２％ ꎮＧＤ３７β和ＧＸ０１β
００２
２期 顾周杭ꎬ等:侵染扶桑和棉花的木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆构建及致病性测定
Ｔａｂｌｅ １ Ｐｒｉｍｅｒｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇꎬ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ ａｎｄ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｃｌｏｎｅｓ
Ｐｒｉｍｅｒ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ (５′￣３′) ａ
Ｆｏｒ ＣＬＣｕＭＶ ＤＮＡ
ＰＡ ＴＡＡＴＡＴＴＡＣＣＫＧＷＫＧＶＣＣＳＣ
ＰＢ ＴＧＧＡＣＹＴＴＲＣＡＷＧＧＢＣＣＴＴＣＡＣＡ
ＧＤ３７ＢａｍＨ Ｉ Ｆ ＧＧＡＴＣＣＡＴＴＧＴＴＡＡＡＣＧＡＡＴＴＴＣＣ
ＧＤ３７ＢａｍＨ Ｉ Ｒ ＧＧＡＴＣＣＣＡＣＡＴＧＴＴＴＧＡＡＴＴＴＧＡ
ＧＤ３７ｆｕｌｌＦ ＡＣＡＣＣＡＡＣＣＧＴＧＴＴＧＣＴＧＴＣＣ
ＧＤ３７ｆｕｌｌＲ ＡＴＧＧＧＴＴＧＣＣＧＡＡＧＴＴＣＡＧＡＣ
ＧＸ０１ＡＦ ＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＧＴＴＧＴＡ
ＧＸ０１ＡＲ ＡＣＧＴＣＧＡＣＣＣＧＣＡＴＴＴＣＣＴＣＡＡＡ
ＧＸＡ Ｓａｌ Ｉ Ｆ ＧＧＴＣＧＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＴＧＡＣＧＴＴＧＴＡ
ＧＸＡ Ｓａｌ Ｉ Ｒ ＡＣＧＴＣＧＡＣＣＣＧＣＡＴＴＴＣＣＴＣＡＡＡ
ＧＸＡ Ｘｂａ Ｉ Ｆ ＣＣＴＧＡＡＡＧＡＴＣＣＴＧＴＣＴＡＧＡＴＴＴＧＣＡＴ
Ｆｏｒ ＣＬＣｕＭＶ ｂｅｔａｓａｔｅｌｌｉｔｅ
ＧＸｂｅｔａ Ｓａｌ Ｉ Ｆ ＡＣＡＧＴＣＧＡＣＧＴＴＣＧＣＡＴＣＡＴＧＡＣ
ＧＸｂｅｔａ Ｓａｌ Ｉ Ｒ ＡＡＣＧＴＣＧＡＣＴＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＣＴＣ
ＧＸｂｅｔａ Ｈｉｎｄ ＩＩＩ Ｒ ＣＴＴＧＡＡＡＧＣＴＴＴＡＴＡＣＡＴＧＧＧＴＴＴＧＴＡＣＣ
β０１ ＧＧＴＡＣＣＡＣＴＡＣＧＣＴＡＣＧＣＡＧＣＡＧＣＣ
β０２ ＧＧＴＡＣＣＴＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣ
β０５ ＧＡＡＡＣＣＴＡＣＣＣＴＣＣＣＡＧＧＧＧＴＡＣＡＣ
ａＢ＝Ｃꎬ Ｔ ｏｒ Ｇꎻ Ｋ＝Ｇ ｏｒ Ｔꎻ Ｒ＝Ａ ｏｒ Ｇꎻ Ｓ＝Ｃ ｏｒ Ｇꎻ Ｖ＝Ａꎬ Ｃ ｏｒ Ｇꎻ Ｗ＝Ａ ｏｒ Ｔꎻ Ｙ＝ Ｃ ｏｒ Ｔ. Ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｓｉｔｅｓ ａｒｅ
ｕｎｄｅｒｌｉｎｅｄ.
在 １ ２４８~１５ ｎｔｓ之间含有一个长 １１５ ｎｔｓ的卫星保
守区ꎬ包括一个茎环结构和一个高度保守的九核苷
酸序列 ＴＡＡＴＡＴＴ / ＡＣꎮ ７６５ ~ ９６４ ｎｔｓ 之间含有一
个 Ａ￣ｒｉｃｈ区ꎬＡ含量约为５６.４％ ꎬ互补链编码一个
βＣ１蛋白ꎮ
２.２ ＣＬＣｕＭＶ致病性测定
对构建的 ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ 侵染性克隆进行致
病性测定发现ꎬＧＤ３７单独接种 ７ ｄ后ꎬ能在本氏烟
上引起轻微的曲叶症状ꎬ而在心叶烟、普通烟和三
生烟上没有明显症状ꎮ ＧＤ３７ 和 ＧＤ３７β 共同接种
本氏烟 ７ ｄ 后ꎬ植株新叶开始出现叶片下卷ꎬ３０ ｄ
时叶片下卷严重(图 ２￣Ａ)ꎬ５０ ｄ 时叶背出现耳突ꎬ
植株严重矮化ꎮ ＧＤ３７ 和 ＧＤ３７β 共同接种的普通
烟在接种 ３０ ｄ 后新叶开始表现出明显的叶片卷
曲ꎬ新叶和顶端严重卷曲ꎬ叶柄呈现严重扭曲(图
２￣Ｂ)ꎬ接种后 ５０ ｄ普通烟植株明显矮化ꎮ ＧＤ３７和
ＧＤ３７β共同接种三生烟在接种 ３０ ｄ 后ꎬ表现出新
叶下卷ꎬ茎杆扭曲(图 ２￣Ｃ)ꎮ 而 ＧＤ３７ 和 ＧＤ３７β
共同接种的心叶烟在接种 ３０ ｄ 后ꎬ只是出现新叶
下卷的症状(图 ２￣Ｄ)ꎮ
统计接种植株的 ＰＣＲ 检测结果ꎬ本氏烟上
ＧＤ３７单独接种或与 ＧＤ３７β 共同接种的侵染效率
均达到 １００％ꎻ心叶烟、三生烟、普通烟上共同接种
的效率较单独接种的高ꎬ分别达到 ８３.３３％、７８.１８％
和 ５２.０８％(表 ２)ꎮ
Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明ꎬＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ ＤＮＡ
单独接种或与 ＧＤ３７β 共同接种 ３０ ｄ 后的本氏烟
和心叶烟植物样品中均能检测到了 ＧＤ３７ ＤＮＡ或
ＧＤ３７β分子ꎮ 在心叶烟中ꎬ与 ＧＤ３７β 共同接种时
ＧＤ３７ ＤＮＡ的积累量明显高于 ＧＤ３７ ＤＮＡ单独接
种的植株ꎬ而在本氏烟中 ＧＤ３７β 接种与否对
ＧＤ３７ ＤＮＡ的积累量没有明显的区别(图 ３)ꎮ
１０２
植物病理学报 ４５卷
Ｆｉｇ. ２ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ ＤＮＡ (ＧＤ３７) ｏｒ ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ ＤＮＡ ｔｏｇｅｔｈｅｒ
ｗｉｔｈ ＧＤ３７ ＤＮＡβ (ＧＤ３７＋ ＧＤ３７β) ｉｎ ａｇｒｏ￣ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ (Ａ)ꎬ Ｎ.
ｔａｂａｃｕｍ (Ｂ)ꎬ Ｎ. ｔａｂａｃｕｍ Ｓａｍｓｕｎ (Ｃ)ꎬ Ｎ. ｇｌｕｔｉｎｏｓａ (Ｄ) ａｔ ３０ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ￣ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
Ｓｈｏｔｓ ｔｗｉｓｔｅｄ ａｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ ｂｙ ａｒｒｏｗｓ.
Ｔａｂｌｅ ２ Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙ ａｎｄ ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ ＤＮＡ (ＧＤ３７)
ｏｒ ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ ＤＮＡ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ＧＤ３７ ＤＮＡβ (ＧＤ３７＋ ＧＤ３７β)
Ｐｌａｎｔ
Ｉｎｆｅｃｔｉｖｉｔｙａ Ｓｙｍｐｔｏｍｂ
ＧＤ３７ ＧＤ３７＋ＧＤ３７β ＧＤ３７ ＧＤ３７＋ＧＤ３７β
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ４３ / ４４ ６０ / ６０ ＬＣ(ｍｉｌｄ) ＬＣꎬ Ｓｔ
Ｎ. ｔａｂａｃｕｍ １４ / ４１ ２０ / ３８ Ｎｏ ＬＣꎬ Ｓｔ
Ｎ. ｔａｂａｃｕｍ Ｓａｍｓｕｎ １６ / ２８ ３２ / ４１ Ｎｏ ＬＣꎬ Ｓｔ
Ｎ. ｇｌｕｔｉｎｏｓａ １２ / ２５ １９ / ２３ Ｓｔ ＬＣꎬ Ｓｔ
Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ ｃ.ｖ. Ｚｈｅｎｏｎｇ９０５ ０ / ８５ ０ / ８９ Ｎｏ Ｎｏ
Ｇ. ｈｉｒｓｕｔｕｍ ｃ.ｖ. Ｚｈｅｄａ３ ０ / ６７ ０ / ６４ Ｎｏ Ｎｏ
Ｇ. ｈｉｒｓｕｔｕｍ ｃ.ｖ. ＴＭ￣１ ０ / ７２ ０ / ５８ Ｎｏ Ｎｏ
Ｓｏｌａｎｕｍ ｌｙｃｏｐｅｒｓｉｃｕｍ ０ / ８０ ０ / ７８ Ｎｏ Ｎｏ
ａ Ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔ / ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ ｐｌａｎｔꎻ ｂＬＣ＝ ｌｅａｆ ｃｕｒｌｉｎｇꎬ Ｓｔ＝ｓｔｕｎｔｉｎｇꎬ Ｎｏ＝ｎｏ ｓｙｍｐｔｏｍｓ.
２０２
２期 顾周杭ꎬ等:侵染扶桑和棉花的木尔坦棉花曲叶病毒侵染性克隆构建及致病性测定
Ｆｉｇ. ３ Ｖｉｒｕｓ ＤＮＡ ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ ｉｎ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ( ｌｅｆｔ) ａｎｄ Ｎ. ｇｌｕｔｉｎｏｓａ
(ｒｉｇｈｔ) ａｔ ３０ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ￣ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ ＤＮＡ (ＧＤ３７) ｏｒ ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７
ＤＮＡ ｔｏｇｅｔｈｅｒ ｗｉｔｈ ＧＤ３７ ＤＮＡβ (ＧＤ３７＋ＧＤ３７β)
.
Ｆｉｇ. ４ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ｉｎｄｕｃｅｄ ｂｙ ＣＬＣｕＭＶ ＧＸ０１ ａｎｄ ＧＸ０１β ｉｎ
ａｇｒｏ￣ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ ａｔ ３０ ｄａｙｓ ｐｏｓｔ￣ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
ＧＸ０１ 和 ＧＸ０１β 共同接种本氏烟 １０ ｄ 后ꎬ植
株新叶出现叶片下卷ꎻ３０ ｄ 时ꎬ茎杆出现扭曲ꎬ植
株严重矮化(图 ４)ꎮ 通过 ＰＣＲ能检测到接种植株
中的 ＣＬＣｕＭＶ ＧＸ０１ 和 ＧＸ０１β 组分ꎮ 但分离自
棉花的 ＧＸ０１ 侵染性克隆却同样不能侵染浙农
９０５、浙大 ３号、ＴＭ￣１这 ３个棉花品种ꎮ
３ 讨论
我们对采自广东和广西的感染了双生病毒的
植物样品 ＧＤ３７ 和 ＧＸ０１ 进行分子鉴定ꎬ鉴定
ＧＤ３７和 ＧＸ０１为 ＣＬＣｕＭＶ 的分离物ꎮ 序列比对
发现ꎬＧＤ３７和 ＧＸ０１ 全基因组序列具有 ９９.４％的
同源性ꎬ而其伴随的卫星 ＤＮＡ ＧＤ３７β 和 ＧＸ０１β
之间同源性为 ９９.２％ꎮ Ｍａｏ等[７]最早于 ２００６年从
我国扶桑上分离到该病毒ꎬ２０１０ 年ꎬＣａｉ 等[１２]报道
在广西棉田中发现了该病毒ꎮ 目前对于我国发生
的木尔坦棉花曲叶病毒的来源并不清楚ꎮ
ＣＬＣｕＭＶ 很可能是随着我国与印度、巴基斯坦等
ＣＬＣｕＭＶ 发病地区外贸活动的加强ꎬ带毒的烟粉
虱或者植株等从广州一带上岸进入中国ꎬ最先感染
扶桑等锦葵科植物ꎬ然后随着带毒烟粉虱的扩散ꎬ
自东向西传至广西ꎬ侵染棉花ꎮ
本研究构建了 ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ 和 ＣＬＣｕＭＶ
ＧＸ０１的侵染性克隆ꎮ 致病性测定表明ꎬＣＬＣｕＭＶ
ＧＤ３７能侵染本氏烟、普通烟、三生烟、心叶烟ꎬ其
中在本氏烟上侵染效率最高ꎬ达到 １００％ꎬ在卫星
３０２
植物病理学报 ４５卷
ＤＮＡ存在的情况下ꎬ能引起严重曲叶和植株矮化ꎬ
但 ＣＬＣｕＭＶ ＧＤ３７ 不能侵染棉花ꎮ 我们又构建了
分离自棉花的 ＣＬＣｕＭＶ ＧＸ０１ 的侵染性克隆ꎬ
ＣＬＣｕＭＶ ＧＸ０１能侵染本氏烟ꎬ但也不能侵染棉
花ꎮ 据报道ꎬＢｒｉｄｄｏｎ等[１７]曾通过基因枪轰击使得
棉花曲叶病毒(Ｃｏｔｔｏｎ ｌｅａｆ ｃｕｒｌ ｖｉｒｕｓꎬ ＣＬＣｕＶ)侵
染性克隆成功侵染棉花ꎬ但目前尚无 ＣＬＣｕＭＶ 侵
染性克隆农杆菌接种棉花的成功报道ꎬ其原因不
明ꎮ 农杆菌接种方式可能并不适合 ＣＬＣｕＭＶꎬ棉花
必须依赖昆虫介体烟粉虱来传播 ＣＬＣｕＭＶꎮ
ＣＬＣｕＭＶ已在巴基斯坦、印度等地对棉花生产构成
了极大的威胁ꎬ虽然目前仅在中国南部广西广东地
区发现了该病毒ꎬ这些地区也并非我国传统的棉花
产区ꎬ但由于该病毒的介体烟粉虱近年来在中国大
面积扩散ꎬ为该病毒的传播扩散提供了条件ꎮ 因此ꎬ
如何科学防控该病毒在中国的传播蔓延ꎬ将成为下
一阶段工作的重点ꎮ 作者建议ꎬ首先加强检验检疫ꎬ
严防外来病原再次进入我国ꎻ其次应及时消灭疫区
发病棉花或扶桑等植物宿主ꎬ减少病毒来源ꎬ从而降
低该病毒在我国棉花上爆发成灾的风险ꎮ
致谢:棉花样品由广西农业科学院植物保护研
究所蔡建和研究员惠赠ꎬ特此致谢ꎮ
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２４３.
责任编辑:李晖
４０２