全 文 ：植物病理学报
ACTA PHYTOPATHOLOGICA SINICA　 41(1): 49-56(2011)
收稿日期: 2010-03-11; 修回日期: 2010-09-21
基金项目: 中国检验检疫科学研究院院所长基金(2009JK032)
通讯作者: 朱水芳,研究员,主要从事生物安全方面的研究; E-mail: zhushf@netchina. com. cn
高必达,教授,主要从事植物病理学方面的研究; E-mail: bdgao@yahoo. com. cn
第一作者: 陈玲娜(1985 - ),女,湖南邵阳人,硕士研究生,主要从事植物病毒学研究; E-mail: chenglingna@gmail. com。
利用黄瓜花叶病毒 M和 Fny株系
的假重组体分析致病关键因子
陈玲娜1*, 马云霞2, 高必达1*, 朱水芳2*
( 1湖南农业大学生物安全科技学院, 长沙 410128; 2中国检验检疫科学研究院, 北京 100029)
摘要: 用 RT-PCR扩增黄瓜花叶病毒 M株系(CMV-M)全长基因组 cDNA,成功构建 CMV-M RNA2 和 RNA3 侵染性克隆
后,与 CMV-Fny基因组 RNA交换得到 3 个假重组型病毒 (F1M2F3、F1F2M3、F1M2M3)。 用 F1M2F3、F1F2M3、F1M2M3
分别侵染白肋烟,产生坏死环斑、轻微绿斑驳、明脉、黄白化和叶尖线性化等症状。 根据假重组型病毒和野生型病毒的表观
症状,分析引起各种症状的关键因子,初步判定:CP基因是诱导花叶症状的关键因子,CMV-Fny RNA2 是诱导叶尖线性化
的关键因子,CMV-M RNA2 是诱导叶尖坏死斑关键因子。 实时荧光定量 PCR结果显示:野生株 CMV-M、CMV-Fny和假重
组体 F1M2F3、F1F2M3、F1M2M3 侵染烟草后引起的症状差异与病毒基因组 RNA累积没有直接关系。
关键词: 黄瓜花叶病毒; 侵染性克隆; 假重组; 实时荧光定量 PCR
Analysis of key virulent factors by pseudo-recombination between Cucumber mosaic
virus M and Fny strains　 CHEN Ling-na1,2, MA Yun-xia2, GAO Bi-da1, ZHU Shui-fang2 ( 1College
of Bio-safety Science & Technology , Hunan Agriculture University, Changsha 410128, China; 2 Institute of Animal and Plant
Quarantine, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100029, China)
Abstract: Using reverse transcription-PCR (RT-PCR), full-length cDNA clones of Cucumber mosaic virus
M strain (CMV-M) were constructed. Through pseudo-recombination between CMV-M (RNA2 and RNA3)
and CMV-Fny genomic RNAs, the pseudo-recombinants F1M2F3, F1F2M3 and F1M2M3 were successful ob-
tained. The seedings of Nicotiana tabacum cv. White Burley inoculated with pseudo-recombinants F1M2F3,
F1F2M3 and F1M2M3 showed symptoms of necrosis, chlorosis, vein clearing, labefaction, linearization of
leaf apex, etc. Based on comparison of symtoms between pseudo-recombinants and wild type virus, the key vir-
ulent factors were speculated. The key factor which induced mosaic was CP, while RNA2 of CMV-M and CMV-
Fny was involved with necrosis and linearization of leaf apex respectively. Real-time fluorescence quantitative PCR
(FQ-FCR) analysis indicated that symptom difference in N. tabacum cv. White Burley induced by CMV-M,
CMV-Fny, F1M2F3, F1F2M3 and F1M2M3 was not related to the accumulation level of CMV genomic RNAs.
Key words: Cucumber mosaic virus; infectious clone; psedo-recombination; real-time fluorescence quantita-
tive PCR
中图分类号: S432. 4　 　 　 文献标识码: A　 　 　 文章编号: 0412-0914(2011)01-0049-08
　 　 黄瓜花叶病毒 ( Cucumber mosaic virus,
CMV)是雀麦花叶病毒科(Bromoviridae)黄瓜花叶
病毒属(Cucumovirus)的典型成员。 CMV 是三分
体 RNA病毒,病毒粒体为球状正二十面体,其基
　
植物病理学报 41 卷
因组由 3 条正义单链 RNA 组成,共编码 5 种蛋白
质。 1a蛋白、2a 蛋白与一个或者多个寄主因子形
成病毒复制酶复合体[1]。 1a 蛋白除了具备甲基化
酶和解旋酶功能外,还能通过影响胞间运输和系统
运输的速率改变系统症状发展[1];2a 能与 MP(运
动蛋白)直接互作,在寄主防御和系统侵染方面起
着重要作用[2,3];2b 能抑制寄主的转录后基因沉
默,影响 CMV的系统运输和表达,参与致病[4 ~ 6];
MP与胞间连丝相互作用,携带 RNA 从一个细胞
运输到另一个细胞[7 ~ 9];CP(外壳蛋白)与寄主症
状直接相关,CP还可能通过改变 MP的构象,使其
更加容易与胞间连丝互作[9 ~ 11]。
Fny株系和 M 株系是 CMV 的两种具有不同
致病力的株系。 CMV-Fny 为弱毒株,接种白肋烟
后表现出轻微绿斑驳、叶尖线性化症状;CMV-M
为强毒株,接种白肋烟后表现出系统黄白化、花叶
症状。 本研究通过构建 CMV-Fny和 CMV-M的侵
染性克隆及其基因组 RNA 的假重组体,进一步观
察各重组体发病时间、发病症状和发病程度的差
异,确定各 RNA对病毒致病力的影响。
1　 材料和方法
1. 1　 材料
1. 1. 1 　 毒源和寄主 　 CMV-Fny 野生毒株和
CMV-Fny侵染性克隆 pF109、pF209、pF309 由苏格
兰作物所 Palukaitis 教授提供。 M-CMV 野生毒株
由澳大利亚 Adelaide 大学 Francki 博士提供;寄主
白肋烟(Nicotiana tabacum cv. White Burley)为动
植物检疫研究所双桥隔离苗圃保存。
1. 1. 2 　 酶和试剂 　 Ex DNA 聚合酶、载体质粒
pUC18、限制性内切酶 BamHⅠ、PstⅠ、EcoRⅠ、T4
DNA 连接酶、感受态细胞 DH5α 均购自大连
TaKaRa公司;Trizol 试剂购自美国 Roche 公司,
RNA酶抑制剂、M-MLV 逆转录酶、体外转录试剂
盒、Cap类似物购自美国 Promega 公司。 一步法实
时荧光试剂盒购自美国 ABI公司。
1. 2　 方法
1. 2. 1 　 cDNA 合成与克隆 　 取新鲜病叶组织
0. 1 g ,根据 Trizol试剂的厂家说明提取系统发病
叶片总 RNA,并以此为模板进行 RT-PCR,采用
M12F / M1R和 M1F / M123R(M12F: 5′-GGATCC-
TAATACGACTCACTATAGGTTTATTTACAAGA-
GCG-3′; M1R: 5-GTGAGGAAAAAGAATTC-
CTATTAAACTCTC-3′;M1F: 5-GAGAGTTTAAT-
CAGGAATTCTTTTTCCTCAC-3′; M123R: 5-CT-
GCAGTGGTCTCCTTTTAGAG-3′)引物对分段扩
增 CMV-M基因组 RNA1的 1 ~1 557 bp(RNA1up)
和 1 526 ~ 3 369 bp(RNA1down)两个片段基因,回
收扩增片段,以 RNA1up 和 RNA1down 为模板,用
M12F / M123R进行扩增,得到含有 RNA1 的全长
cDNA。 采用 M12F / M123R 对和 M3F / M123R
(M3F: 5′-GGATCCTAATACGACTCACTATAGG-
TAATCTTACCACTGTG-3′) 引 物 对 分 别 扩 增
CMV-M 基因组 RNA2 和 RNA3 全长 cDNA。
RNA1、 RNA2、 RNA3 全长 cDNA PCR 产物经
BamHⅠ和 PstⅠ酶切后,用 T4 DNA连接酶克隆到
相应酶切的 pUC18 载体,分别获得 RNA1、RNA2
和 RNA3 的阳性克隆(pM1、pM2、pM3)。
1. 2. 2　 序列测定与分析　 阳性克隆质粒由诺赛公
司(北京)测序,每个序列测定 3 个克隆。 将 CMV-
M的核苷酸序列通过 DNAMAN 软件与标准株系
CMV-Fny进行相似性比较分析。
1. 2. 3 　 体外转录 　 克隆 pF109、 pF209、 pF309、
pM1、pM2 和 pM3 经 PstⅠ酶切,并用 Klenow酶补
平;获得线性化 DNA 作为体外转录模板,进行全
长 RNA体外转录,体外转录方法参考试剂盒使用
说明书。
1. 2. 4 　 各重组体接种及其生物活性测定 　 用
50 mmol / L pH9. 2 磷酸缓冲液将克隆 pF109、
pF209 、pF309、 pM1、pM2 和 pM3 的体外转录产物
稀释至 200 mg / L,各取 1 μL 进行基因组 RNA1、
RNA2 和 RNA3 的重组,由此获得 6 个假重组体病
毒 M1M2F3、M1F2M3、M1F2F3、F1F2M3、F1M2F3
和 F1M2M3。 以上转录 RNA混合物加 DEPC水至
10 μL,接种于 4 ~ 5 叶期白肋烟,重复接种一次。
接种植物在 28℃、光照 14 h植物培养箱中培养。
1. 2. 5　 标准品制备及标准曲线制备　 1. 2. 3 中体
外转录产物 DNase 37℃消化 15 min 后,按照 RNA
纯化试剂盒方法进行纯化。 纯化产物 10 倍梯度稀
释后作为标准模板,采用试剂盒建议体系及方法进
行 TaqMan探针荧光定量 PCR,得到各自的循环阈
值(Ct),以 Ct 值为纵坐标,以起始模板浓度的对
数为横坐标,制作标准曲线。
05
　
　 1 期 　 　 陈玲娜,等:利用黄瓜花叶病毒 M和 Fny株系的假重组体分析致病关键因子
1. 2. 6 　 病毒基因组 RNA 浓度检测 　 分别取
CMV-M野生株、CMV-Fny 野生株和各假重组体
病毒接种 10、15、20 d的烟草新生幼片 0. 1 g,根据
Trizol试剂的厂家说明提取植物总 RNA。 以提取
出来的植物总 RNA为模板,按照一步法实时荧光
试剂盒建议体系及方法对病毒基因组 RNA1、
RNA2、RNA3 和 RNA4 进行检测,每个样品 3 个重
复。 引物及其 TaqMan 探针序列见表 1。 根据
1. 2. 5 中标准曲线的斜率(x)和截距(y),得出浓
度与 Ct 值之间的线性关系曲线表达式: Ct =
- x Ig(copy number) + y,而待测样品的 Ct 值可
以从仪器中读取,把待测样品的 Ct 值代入表达式
就可以算出它的初始浓度。
Table 1 　 Sequences of primers and probes
for FQ-PCR
Name Sequences(5′- 3′)
primer1a-F GCTTGTGTGAAACTCTCGATTGTC
primer1a-R CAAGGGGAACAGCAGTGTACG
Probe1a TCCCTTCATCAGGTCTGCGGCAGGAC
primer2a-F GGTCCCGAACGTCTGGATTTG
primer2a-R AAACACGGGCACTGGTACATG
Probe2a CGCCGCCCATTTGTGAAGCGTGCGAC
primerCP-F GTGTCCTGTGTGAGTTGATACAG
primerCP-R GCTTACTAAAACCAGATGTGTTCC
ProbeCP TCAACACGGCATCGCGTCACAGATGT
primerMP-F CCCAGTCTGATTCCGTGTTCC
primerMP-R AGTTTATAGCAGAACTGCCAACTC
ProbeMP ATCCTCCCTCCGATCTCTGTGGCGGG
2　 结果与分析
2. 1　 CMV-M RNA2、RNA3 全长 cDNA 克隆和
假重组体构建及其侵染活性分析
以接种 CMV-M 15 d 的白肋烟叶片组织的总
RNA 为模板,进行 RT-PCR 扩增,得到 CMV-M
RNA1、RNA2、RNA3 的全长序列和全长 cDNA 克
隆 pM1、pM2 和 pM3。 将 CMV-M RNA 与已报道
的 CMV-Fny RNA 序列进行比较,分析结果显示
RNA1、RNA2 和 RNA3 的一致性分别为 91. 95% 、
98. 83%和 98. 33% (表 2)。
　 　 pM1、pM2 和 pM3 经酶切线性化后,进行体外
RNA转录,获得理想的线性化 RNA(图 1)。 体外
转录产物重新组合(组合方式见表 3),RNA 混合
物接种白肋烟。 RNA 组合体 F1F2M3、F1M2M3、
F1M2F3 接种的烟草于接种后 5 d,F1F2F3 接种的
烟草于接种后 7 ~ 8 d出现症状反应。 在上述组合
体接种 7 d后的烟草接种叶和 21 d后系统叶中,利
用实时荧光定量 PCR(FQ-PCR)方法都成功检测
到各 RNA 组分,表明构建的 CMV-M RNA2 和
RNA3 全长 cDNA 克隆有侵染活性,并成功获得
F1M2F3、F1F2M3、F1M2M3 三个假重组体。
M1M2M3、M1F2F3、M1M2F3 和 M1F2M3 四
种 RNA 组合体侵染的烟草没有表现明显症状。
用 FQ-PCR 的方法检测,尽管能同时检测到
RNA1、RNA2 和 RNA3,但其中 RNA2 和 RNA3 的
浓度非常低 (结果未显示)。 由此推断 CMV-M
RNA1 全长 cDNA克隆侵染活性低,还需要改进。
Table 2　 Nucleotide and amino acid difference between genomic RNAs of CMV-M and CMV-Fny
RNA1
5′
UTR 1a
3′
UTR
RNA2
5′
UTR 2a 2b
3′
UTR
RNA3
5′
UTR MP
intergenic
region CP
3′
UTR
Length(nt) CMV-M 95 2 982 291 85 2 560 333 249 121 840 297 657 301
CMV-Fny 94 2 982 281 86 2 560 333 249 119 840 297 657 303
Mutation
difference
Nucleotide 3 243 25 3 16 3 13 6 7 4 14 6
Amino acid 27 6 1 3 7
15
　
植物病理学报 41 卷
Fig. 1　 Electrophoresis analysis of RNA transcribed from CMV-M
genomic cDNA clones with 0. 8% agarose gels
A: PstⅠlinearized fragment of pM1 (1), pM2 (2) and pM3 (3); B: RNA transcripts of pM1 (1),
pM2 (2) and pM3 (3) . M: 1 kb DNA Ladder.
2. 2　 假重组体接种后症状
野生型 CMV-M、CMV-Fny 及组合体 F1F2F3
和假重组体 F1M2F3、F1F2M3、F1M2M3 侵染性体
外转录产物摩擦接种烟草 15 d后症状如图 2-A所
示。 烟草在接种 CMV-M野生株后第 4 d 时发病,
第一片新叶(接种后最先长出的幼叶,按长出的时
间先后排序)上出现大面积白化区域,第二片新叶
除了叶尖部分是绿色外,其他部分完全白化,第三
片新叶上没有明显症状,只有叶尖部分白化;
CMV-Fny野生株接种的烟草发病时间相对 CMV-
M野生株要晚,第一片新叶上没有明显症状,接种
7 ~ 8 d 时第二片新叶上出现轻微的绿斑驳,第三
片新叶上绿斑驳症状消失了,但却出现了明显的叶
尖线性化症状;F1M2F3 侵染烟草后,导致第一片
新叶出现坏死环斑或严重坏死症状,第二至五片新
叶上没有任何明显症状,第六片新叶上出现轻微绿
斑驳症状;烟草接种 F1F2M3 和 F1M2M3 后表现
的症状与 CMV-M 野生株相似,但有些许的差别。
F1F2M3 接种的烟草中第一片新叶呈现明脉症状,
第二片新叶几乎完全白化,第三片新叶上症状基本
恢复,只有叶尖出现线性化和白化。 F1M2M3 接
种的烟草的前两片新叶症状与 F1F2M3 相同,但第
三片新叶上没有线性化趋势,只是叶尖有些许白化
区域(表 3)。
Table 3　 RNA composition, pathogenicity rate of pseudo-recombinants between
CMV-M and CMV-Fny, and symptom expression on seedlings of Nicotiana
tabacum cv. White Burley induced by inoculation
Pseudo-recombinant RNA composition 　 　 Pathogenicity rate Symptom on N. tabacum cv. White Burley
F1M2F3 RNA1,RNA3(Fny); RNA2(M) 　 100% Necrosis,chlorosis
F1F2M3 RNA1,RNA2(Fny); RNA3(M) 　 100% Vein clearing,yellow mosaic,linearization of leaf apex
F1M2M3 RNA1(Fny); RNA2,RNA3(M) 　 100% Vein clearing,yellow mosaic
M1F2M3 RNA1,RNA3(M); RNA2(Fny) No
M1M2F3 RNA1,RNA2(M); RNA3(Fny) No
M1F2F3 RNA1(M); RNA2,RNA3(Fny) No
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　 1 期 　 　 陈玲娜,等:利用黄瓜花叶病毒 M和 Fny株系的假重组体分析致病关键因子
2. 3　 系统侵染的烟草中各假重组体基因组 RNA
的绝对定量结果
观察症状发现,CMV-M野生株、CMV- Fny 野
生株和假重组体 F1M2F3、F1F2M3、F1M2M3 接种
烟草后, 烟草的前三片新叶分别于接种后第 10、
15、20 d 完全展开,它们呈现出来的症状差异明
显、稳定、有规律。 所以,我们分别检测了各野生
株、假重组体病毒接种烟草后第 10、15、20 d 完全
展开叶中病毒基因组 RNA 的累积水平,以明确症
状差异的机制。
FQ-PCR 检测结果显示: CMV-M 野生株、
CMV-Fny 野生株和假重组体 F1M2F3、F1F2M3、
F1M2M3 接种烟草后,叶片组织中病毒基因组
RNA累积量随时间延长的变化趋势各不相同,具
体变化趋势见表 4。
　 　 CMV-M 野生株接种的烟草中,病毒基因组
RNA含量随时间变化明显,RNA1、RNA2、RNA3
和 RNA4 在症状最严重的第二片新叶中含量都是
最低,RNA1 和 RNA4 在第一片新叶中含量最高,
RNA2和RNA3在第三片新叶中含量最高。F1F2M3
Fig. 2　 Symptoms on seedlings of Nicotiana tabacum cv. White Burley induced by
inoculation with pseudo-recombinants of CMV-M and CMV-Fny
A: Symptoms developed at 15 days post-inoculation (dpi) in healthy control (1), Mock inoculation (2), and CMV-Fny virion
(3), CMV-M vireo (4), F1F2F3 (5), F1M2F3 (6), F1F2M3 (7), F1M2M3 (8) inoculated N. tabacum cv.
White Burley; B: Necrosis on N. tabacum cv. White Burley 15 days after F1M2F3 inoculation;
C: Symptom on the third leaf unfolded after inoculation with CMV-Fny virion (1), F1F2F3 (2),
F1M2F3 (3), F1F2M3 (4), F1M2M3 (5) and CMV-M virion (6); D:Symptom on the second
leaf unfolded after inoculation with F1F2M3 (1), F1M2M3 (2) and CMV-M virion
(3); E:Chlorosis and mosaic symptom inoculated with CMV-Fny virion at
15 dpi (1), F1F2F3 at 15 dpi (2) and F1M2F3 at 30 dpi.
35
　
植物病理学报 41 卷
接种的烟草新叶上症状从明脉到完全白化,然后症
状恢复,变化明显,但烟草叶片组织中 F1F2M3 基
因组 RNA含量稳定,随时间变化不大。 以上结果
表明,CMV-M 野生株和 F1F2M3 接种的烟草中,
病毒基因组 RNA 累积水平与症状严重程度没有
直接相关性。
CMV-Fny接种的烟草中,RNA1 和 RNA2 的
含量都随时间延长而逐渐下降,RNA3 和 RNA4 含
量是第一片新叶 > 第三片新叶 > 第二片新叶。
CMV-Fny侵染后,烟草新叶上先后出现绿斑驳和
线性化两种不同类型的症状,由于无法比较症状的
严重程度,也就无法判断病毒基因组 RNA 累积水
平与症状严重程度的相关性。
F1M2F3 和 F1M2M3 接种的烟草中,病毒基因
组 RNA的累积水平从某种程度上与症状严重程
度一致。 F1M2F3 接种的烟草中出现坏死环斑的
第一片新叶中病毒基因组 RNA 含量最高,随后没
有表现明显症状的第二、三片新叶中病毒基因组
RNA含量逐渐降低。 F1M2M3 接种的烟草中,病
毒基因组 RNA 含量是第二片新叶 >第一片新叶
>第三片新叶,与叶片表现的症状严重程度成正
相关。
CMV-M野生株和假重组 F1F2M3、F1M2M3
接种的烟草叶片组织中病毒基因组 RNA1、RNA2、
RNA3 和 RNA4 含量最小值的数量级分别是 10 -5、
10 -3、10 -3、10 -5 mg / mL。 其中 CMV-M 野生株基
因组 RNA2 含量相对较低,最小值的数量级为
10 -4 mg / mL;F1F2M3 基因组 RNA4 含量相对较
高,最小值的数量级为 10 -4 mg / mL。 CMV-Fny 接
种的烟草叶片组织中病毒基因组 RNA1、RNA2、
RNA3 和 RNA4 含量最小值的数量级分别是 10 -5、
10 -3、10 -2、 10 -2 mg / mL,其中基因组 RNA3 和
RNA4 的含量非常高,分别是其他检测病毒的基因
组 RNA3 和 RNA4 含量的 10 倍和 1 000 倍。
F1M2F3 接种的烟草叶片组织中,F1M2F3 基因组
RNA1、RNA2、RNA3 和 RNA4 的含量都很低,分别
是 CMV-M野生株和假重组 F1F2M3、F1M2M3 接
种的烟草叶片组织中病毒基因组 RNA1、RNA2、
RNA3 和 RNA4 含量最小值的 1 / 10 ~ 1 / 100
(表 5)。
Table 4　 Ratio of accumulation level of virus genome RNAs in the seedlings of Nicotiana
tabacum cv. White Burley at 10,15 and 20 days post-inoculation
Virus RNA1 RNA2 RNA3 RNA4
CMV-M 15. 7:1. 00:12. 8 3. 00:1. 00:4. 5 3. 50:1. 00:10. 4 17. 0:1. 00:3. 70
CMV-Fny 8. 20:3. 10:1. 00 2. 30:1. 15:1. 00 2. 98:1. 00:1. 83 2. 93:1. 00:1. 67
F1M2F3 3. 16:1. 32:1. 00 1. 56:1. 00:1. 68 6. 48:2. 41:1. 00 4. 81:1. 80:1. 00
F1F2M3 1. 17:1. 00:1. 02 2. 03:1. 00:1. 62 1. 03:1. 00:1. 47 1. 07:1. 00:1. 04
F1M2M3 4. 72:4. 49:1. 00 1. 31:3. 27:1. 00 2. 79:6. 00:1. 00 2. 02:12. 3:1. 00
Table 5　 The minimum cumulant of virus genome RNAs in the seedlings
of Nicotiana tabacum cv. White Burley
Virus RNA1(mg / mL) RNA2(mg / mL) RNA3(mg / mL) RNA4(mg / mL)
CMV-M 1. 61 -5 1. 69 -4 1. 73 -3 3. 63 -5
CMV-Fny 7. 60 -5 1. 34 -3 2. 21 -2 1. 36 -2
F1M2F3 4. 81 -6 8. 45 -5 2. 21 -4 5. 94 -7
F1F2M3 7. 32 -5 5. 35 -3 4. 39 -3 1. 58 -4
F1M2M3 2. 56 -5 4. 69 -3 6. 06 -3 5. 90 -5
45
　
　 1 期 　 　 陈玲娜,等:利用黄瓜花叶病毒 M和 Fny株系的假重组体分析致病关键因子
3　 讨论
本研究中 CMV-M RNA1 的体外转录产物侵
染烟草后能自身复制,但侵染率低,这可能是与
CMV 基因组 RNA1 的强毒性有关。 CMV RNA1
对细胞有致死作用,克隆了 CMV RNA1 的重组质
粒转化细菌后,杀死了大部分细胞,导致转化成功
率低(和苏格兰作物研究所 Palukaitis 教授通讯结
果)。 强毒株 CMV-M 的 RNA1 对细菌的致死作
用表现得尤为明显,普通菌株无法成功转化有它的
重组质粒,而必须采用低拷贝的菌株减轻其毒害作
用才能转化成功。 我们猜想 CMV-M RNA1 对烟
草细胞也有强毒性,且 CMV-M RNA1 侵染烟草细
胞后激活了某种植物防御机制,抑制了 CMV-M
RNA1 的活性。 我们接下来将通过对 RNA组合体
M1M2M3、M1F2M3、M1M2F3 和 M1F2F3 在烟草
中的基因表达进行监测来验证以上猜测;并通过增
减保护碱基进一步改进 CMV-M RNA1 cDNA 克
隆的侵染活性。
同种病毒侵染寄主后诱导的症状的显现时间
及发展趋势,会因为受到外界环境中多种因素影响
而表现出细小差别,但总体上呈现一致性,且主要
取决于致病机制。 我们根据各重组体接种的烟草
表现不同症状、发病程度和发病时间,进一步分析
了各 RNA 对致病力的影响。 在野生型侵染过程
中,接种 CMV-M的烟草在接种后 5 d 表现出黄白
花叶或明脉症状,8 ~ 10 d 症状最严重,叶片全部
白化;接种 CMV-Fny的烟草在接种 15 d后表现出
轻微绿斑驳和叶尖线性化。 在重组体 F1F2M3 侵
染过程中,黄白化和绿斑驳、叶尖线性化症状先后
于 7 d和 15 d 在被侵染的烟草上出现(图 2-A、2-
C)。 即黄白化和叶尖线性化在症状发展周期中出
现的时间是有明显先后顺序的,由此我们可以初步
断定,黄白化和叶尖线性化症状是由不同致病机制
引发的,且可能是由不同致病因子诱导的。 假重组
体研究结果进一步支持这一推断:首先,如图 2-C
示,Fny野生株和 F1F2M3 在烟草寄主上引起典型
的叶尖线性化症状, 而 F1M2F3、 F1M2M3 和
CMV-M 野生株侵染的烟草却没有明显畸形的表
现和趋势。 由此,我们推断诱导叶片畸形的关键因
子是 CMV-Fny RNA2。 其次,Michael 等[10]、Shin-
taku等[11]报道,突变 CP的第 129 个碱基导致寄主
症状在褪绿、黄化和坏死三种症状间转换。 本研究
中 F1F2F3、F1M2F3 都只表现出轻微的褪绿症状,
F1F2M3、F1M2M3 和 CMV-M 野生株都引起明显
的黄白化症状 (图 2-A、2-D、2-E),该结果证明
RNA3 的置换引起了烟草褪绿、黄白化症状的转
换。 所以,我们初步确定 CMV CP 是花叶症状的
决定因子。 并且可能由于 CMV-M CP的致病力比
CMV-Fny CP的致病力强,所以 CMV-M诱导烟草
呈现严重黄白化,而 CMV- Fny 只能引起轻微绿
斑驳。
我们还发现了一个很有意思的现象:F1M2F3
接种的烟草在侵染前期出现许多细小的坏死斑
(图 2-A),严重的甚至叶尖坏死 (图 2-B),即
CMV-M RNA2 的置换引起了坏死症状。 然而,
CMV-M野生株和 CMV-Fny野生株系统侵染烟草
后都不曾诱导坏死症状。 对此现象相关研究工作
者认为,某些植物病毒的沉默抑制子能诱导寄主产
生类似于过敏性反应的症状,如坏死环斑[12,13],进
而导致病毒粒子及病毒 RNA 在叶片中的运输受
到限制。 Liao 等[14]也曾报道 CMV-CB7 的 2b 基
因与心叶烟坏死反应有关。 FQ-PCR 结果显示,
F1M2F3 接种的烟草中病毒基因组 RNA含量非常
低,是其他野生株和假重组体接种的烟草中病毒基
因组 RNA 含量的 1 / 10 ~ 1 / 100,且呈逐渐下降的
趋势(表 5)。 该结果表明 F1M2F3 在系统侵染烟
草的过程中的确受到了抑制。
为了明确野生株和假重组体侵染烟草后诱导
不同症状的原因,我们分别检测了各病毒接种烟草
后第 10、15、20 d 完全展开叶中病毒基因组 RNA
的累积水平。 令人惊讶的是,CMV-M 野生株和假
重组体 F1F2M3、F1M2M3 侵染烟草后诱导的症状
发展基本相似,但烟草叶片组织中病毒基因组
RNA含量的变化趋势却各不相同。 而 F1M2F3 在
系统侵染的烟草中病毒基因组 RNA 累积水平却
能充分解释其症状的变化发展。 由此我们推测,症
状的严重程度并不单纯受病毒基因组 RNA 累积
量影响,而是症状发展和病毒基因组 RNA 在烟草
中的复制表达都决定于病毒蛋白与烟草的互作,并
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植物病理学报 41 卷
受到病毒蛋白的调控。
为进一步明确是否是沉默抑制子 CMV-M 2b
诱导的坏死症状,CMV-M 2a 和 2b 对坏死症状的
影响以及 CMV-M和 CMV-Fny各基因对病毒致病
力的影响及症状差异的关键机制,我们将利用片段
置换重组的方式来研究 2a、2b、CP、MP 基因对症
状的影响,并结合基因表达监控和蛋白互作研究,
深入研究各个基因的功能。
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