全 文 : 2013,39(2):196-200 Plant Protection
有害生物动态
Information of Pests
收稿日期: 2012-10-21修订日期: 2012-11-25
基金项目: 公益性行业(农业)科研专项(200903034);福建省科技厅重大项目(2006NZ0002)
* 通信作者 E-mail:wuzujian@126.com
福州市发生由木尔坦棉花曲叶病毒
引起的朱槿曲叶病
章松柏1,3, 夏宣喜1, 张 洁1, 张友军2, 吴祖建1*
(1.福建农林大学植物病毒研究所,福州 350002;2.中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京 100081;
3.长江大学农学院,荆州 434025)
摘要 棉花曲叶病是世界棉花生产上最具毁灭性的病毒病害,其主要病原木尔坦棉花曲叶病毒(Cotton leaf curl
Multan virus,CLCuMV)已经入侵我国广东、广西、海南等省多个地理区域,扩散危害范围日益加大。2011-2012
年调查发现福建省厦门、福州和宁德等多个城市绿化植物朱槿(Hibiscus rosa-sinensis)发生朱槿曲叶病的流行。应
用双生病毒通用引物以及烟粉虱生物型鉴定的通用引物,通过PCR扩增、序列分析等方法,分别检测或鉴定了福州
市朱槿曲叶病的病原、介体烟粉虱的生物型以及朱槿病株上烟粉虱的带毒率。结果显示:福州市朱槿曲叶病的病原
是木尔坦棉花曲叶病毒,与CLCuMV广东分离物和广西分离物的相似性高达99.6%以上;介体烟粉虱生物型为B
型,病株上烟粉虱的带毒率为100%。试验结果说明CLCuMV已经扩散至福建省,应警惕和控制木尔坦棉花曲叶
病毒的进一步扩散和危害。
关键词 朱槿曲叶病; 木尔坦棉花曲叶病毒; 烟粉虱
中图分类号: S 432.41 文献标识码: B DOI: 10.3969/j.issn.0529-1542.2013.02.040
A leaf curl disease on Hibiscus rosa-sinensis in Fuzhou
caused by Cotton leaf curl Multan virus
Zhang Songbai 1
,3, Xia Xuanxi 1, Zhang Jie1, Zhang Youjun2, Wu Zujian1
(1.Institute of Plant Virology,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350002,China;
2.Institute of Vegetables and Flowers,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Beijing 100081,China;
3.Colege of Agriculture,Yangtze University,Jingzhou 434025,China)
Abstract Cotton leaf curl is the most devastating virus disease to cotton production in the world and one of its
main pathogens,Cotton leaf curl Multan virus(CLCuMV),has invaded and spread in many areas of Guangdong,
Guangxi and Hainan Provinces.The investigation carried in 2011-2012 found that leaf curl disease on Hibiscus
rosa-sinensis plants generaly occurred in some cities of Fujian Province.With the specific primers for detecting
Geminiviruses or Bemisia tabaci biotype,the pathogen of leaf curl disease on H.rosa-sinensis,the biotype of B.
tabaci and its viruliferous ratio on infected plants were identified by PCR amplification and sequence analysis.The
results showed that the pathogen was CLCuMV,and its nucleotide sequence had more than 99.6%identity with
that of Guangdong isolate and Guangxi isolate.Whiteflies from China roses and tobaccos were identified as B bio-
type B.tabaci and the viruliferous rate of B.tabaci colected from infected plants was 100%.Al the results show
that CLCuMV has invaded Fujian Province and some measures must be taken to control its further spread.
Key words Hibiscus rosa-sinensis leaf curl disease; Cotton leaf curl Multan virus; Bemisia tabaci
棉花曲叶病(cotton leaf curl disease)是世界棉
花生产上最具毁灭性的病毒病害,已在巴基斯坦、印
度、苏丹、埃及和南非等国棉花产区广泛流行,仅在
1992-1997年期间就造成巴基斯坦经济损失累计
39卷第2期 章松柏等:福州市发生由木尔坦棉花曲叶病毒引起的朱槿曲叶病
达50亿美元[1-4]。棉花曲叶病是多种双生病毒引
起,这些双生病毒都属于双生病毒科(Geminiviri-
dae)菜豆金色花叶病毒属(Begomovirus)成员[3,5-6],
皆由烟粉虱[Bemisia tabaci(Genn.)]以持久方式
传播,也可以嫁接传播,但不能通过机械摩擦接种传
播和种子带毒传播;其基因组仅含有 DNA-A 组分,
并伴随卫星β分子
[3-4]。鉴于棉花曲叶病的危害性,
2007年5月28日正式发布实施的《中华人民共和
国进境植物检疫性有害生物名录》中,再次将其列入
植物检疫对象。尽管如此,棉花曲叶病的主要病原
之一,木尔坦棉花曲叶病毒,还是很快在我国朱槿
(Hibiscus rosa-sinensis Linn.)植物上被发现[7],经
过不到8年的扩散,该病毒已经在我国广东、广西、
海南等省多个地理区域的多种植物上流行危害,其
他省市,包括我国长江流域、黄河流域和西北内陆三
大棉花产区尚未发现棉花曲叶病[7-11]。因此,密切
监视和防控CLCuMV引起的病害扩散是各级植保
植检部门和科研工作者的重要任务。2011-2012
年,实验室科研人员先后于福建省厦门、福州、宁德
等市公路绿化带发现朱槿曲叶病疑似病株,并详细
调查了该病在福州市的发生情况。经过调查发现福
州市城市道路、公园、工厂、学校、政府机关等多数存
在朱槿植物的绿化带以及位于市郊的绝大多数苗圃
基地皆存在疑似病株,经过分子检测和序列比较,证
实该病害病原为木尔坦棉花曲叶病毒,传毒介体为
B型烟粉虱,现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
植物样品:朱槿曲叶病疑似病株叶片和健株叶
片采集于福州市郊区苗圃基地,液氮速冻后保存于
-70℃超低温冰箱中备用,阳性对照样品为已经鉴
定的苎麻花叶病毒病病株。
介体昆虫:烟粉虱种群分别采自福州市郊区朱
槿健株和疑似病株以及烟草上,收集于含75%乙醇
的1.5mL离心管中,保存于-70℃超低温冰箱或
-20℃冰箱中备用。
1.2 实地调查和症状观察
调查福州市种植朱槿的公园、道路、单位和苗圃
基地,走访苗圃基地花农,记录朱槿曲叶病的发生时
间和可能的传入途径;对照健康植株,观察发病朱槿
植株叶片是否畸形和黄化,叶片大小是否变化,叶背
有无耳突,叶脉是否增厚等,植株是否矮化等。
1.3 植物总DNA和烟粉虱DNA的提取
采用周雪平等报道的CTAB提取法[12]提取朱
槿叶片中的总DNA(总共有14份植物样品,包括病
叶样品12份、健叶样品1份,对照样品1份)。
烟粉虱生物型的鉴定使用多头昆虫(30~50
头)提取的DNA,方法如下:将烟粉虱置于1.5mL
离心管中,液氮速冻后,用研磨棒研磨成粉状,加入
含200μL 碱裂解液(50mmol/L Tris-HCl,pH
8.0,20mmol/L NaCl,1mmol/L EDTA,1%SDS)
和1μL蛋白酶K(终浓度1μg/mL),55℃水浴锅
中水浴2~3h;离心(12 000r/min,下同)5min后
取上清,加入200μL 24∶1的氯仿/异戊醇抽提,重
复1次;离心5min后取上清,加入等体积的异丙
醇,-20℃放置20min;离心10min,去上清,沉淀
用70%乙醇洗1次,然后将DNA沉淀室温晾干,
加入60μL ddH2O溶解后即可用于PCR反应。烟
粉虱带毒率监测使用朱槿曲叶病病株上采集的烟
粉虱,单头烟粉虱总 DNA的提取方法参照潘慧
鹏等[13]。
1.4 PCR扩增和电泳
利用 Shatters等[14]基于B型和 Q 型烟粉虱
mtDNA COⅠ基因片段设计的PCR扩增特异性引
物来鉴定烟粉虱的生物型是B型还是Q型;利用谢
艳等[15-16]设计的双生病毒通用引物来检测福州朱槿
曲叶病是否由双生病毒引起,并在序列分析的基础
上设计扩增DNA-A余下片段的引物。PCR热循环
程序为:94℃4min,94℃20s,55℃20s,72℃
30s,共35个循环,最后72℃延伸10min。PCR产
物用1.0%琼脂糖(0.5×TBE)电泳检测,BioRad凝
胶成像仪观察,记录结果。
1.5 检测片段克隆和序列分析
双生病毒通用引物PCR扩增所得的检测片段
连接pMD 18-T(TaKaRa),转化克隆验证后委托南
京金斯瑞生物科技有限公司测序。运用DNAMAN
软件(Lynnon Biosoft Inc.)对所获序列进行加工整
理和同源性分析。
2 结果与分析
2.1 福州市朱槿曲叶病危害现状
通过与苗圃基地花农们座谈得知,福州朱槿苗
木最初由广东调运而来,随后经过枝条扦插繁殖而
扩大种植;朱槿疑似曲叶病最早发生于2009年,当
时只有零星苗圃发生,经过3年时间已经扩散至福
州市各苗圃基地、多数绿化带以及周边县市。因此,
推测该病随苗木调运而传入福州地区。福州市朱槿
曲叶病发病症状和已报道的朱槿曲叶病症状一致,
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2013
如封面所示:发病朱槿植株和枝条都明显矮化;新叶
黄化明显;叶片畸形,变小,老叶和新叶皆向上卷曲,
呈杯状或勺状;叶脉增大、明脉或脉突,叶片背面粗
糙不平且于叶脉处产生耳突;较大的朱槿病株都能
正常开花,但花较健康略小,但较小的苗木多数不能
正常开花。
2.2 朱槿曲叶病的PCR检测和鉴定
应用双生病毒的通用引物(PA/PB)对检测样品
进行PCR扩增,样品1~12号都能得到预期约480bp
大小的片段(见图1)。选择样品1~6进行测序,检
测片段的序列完全一致。在此基础上设计引物扩增
DNA-A余下约2 260bp片段(以样品1~6的总
DNA为模板,扩增结果如图1中13~18泳道),并
予以测序。DNA-A 全长序列(GenBank登录号:
JX861210)分析比较如图2所示,在引起棉花曲叶病
的 8 种 病 毒 中,检 测 样 品 的 DNA-A 序 列 与
CLCuMV相似性最高,其中与CLCuMV广东分离
物(JX286664)和广西分离物(JQ317603)的相似性
高达99.6%以上,说明引起福州朱槿曲叶病的病原
是CLCuMV。
图1 福州朱槿曲叶病的PCR检测及DNA-A的扩增
Fig.1 PCR detection of leaf curl disease on H.rosa-sinensis plants and PCR amplification of the geminivirus DNA-A
图2 基于双生病毒的DNA-A核酸
全序列构建的亲缘关系树
Fig.2 Phylogenetic tree based on complete
sequence of Begomovirus DNA-A
2.3 烟粉虱生物型鉴定和烟粉虱带毒率检测
烟粉虱生物型鉴定应用相应的特异性引物进
行PCR扩增,结果如图3所示,用鉴定B型烟粉
虱的特异性引物PCR扩增能得到预期的、约480
bp大小的DNA产物(B1~B6),而用鉴定 Q型的
特异性引物进行 PCR扩增,未得到预期的、约
300bp大小的DNA带条(Q1~Q6),说明采集于
烟草和健康或发病朱槿上的烟粉虱生物型是
B型。
朱槿病株上烟粉虱的带毒率应用引物PA/PB
进行PCR扩增,以已经鉴定的病株和健株上采集
的烟粉虱分别做阳性和阴性对照,结果如图4所
示。22头朱槿病株上采集的烟粉虱样品PCR扩
增皆能得到预期的、约480bp大小的DNA条带,
所检测的烟粉虱带毒率100%,说明烟粉虱的带毒
效率很高。
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39卷第2期 章松柏等:福州市发生由木尔坦棉花曲叶病毒引起的朱槿曲叶病
3 讨论
试验证实福州市朱槿曲叶病是由CLCuMV侵
染引起的。CLCuMV是引起棉花曲叶病的主要病
原之一,而棉花曲叶病是棉花生产上最具毁灭性的病
毒病害,多次在巴基斯坦、印度、苏丹、埃及和南非等
国棉花产区暴发流行,造成巨大的经济损失[3-4]。已
报道从棉花曲叶病样中检测到8种双生病毒[3,8],分
别为木尔坦棉花曲叶病毒(CLCuMV)、阿拉巴德棉花
曲叶病毒(Coton leaf curl Alabad virus,CLCuAV)、
Kokhran棉花曲叶病毒(Coton leaf curl Kokhran vi-
rus,CLCuKV)、番木瓜曲叶病毒(Papaya leaf curl
virus,PaLCuV)、杰济拉棉花曲叶病毒(Cotton leaf
curl Gezira virus,CLCuGV)、拉贾斯坦棉花曲叶病
毒 (Cotton leaf curl Rajasthan virus,CLCuRV)、
班加罗尔番茄曲叶病毒 (Tomato leaf curl Banga-
lore virus,ToLCBV)和布里瓦拉棉花曲叶病毒
(Cotton leaf curl Burewala virus,CLCuBuV),这
8种病毒在自然条件下由烟粉虱以持久方式传播,也
可以嫁接传播,不能通过其他方式传播,自然寄主包
括棉花、黄秋葵、朱槿、垂花悬铃花和蔟生黄麻等植
物[8]。目前,我国长江流域、黄河流域和西北内陆三
大棉花产区尚未发现棉花曲叶病毒危害,但在广东、
广西、海南3省已经发现CLCuMV危害朱槿、黄秋葵
等植物,危害范围日益扩大[7-11]。与广西情况相似[8],
福建的朱槿苗木最初也是主要来源于广东,经过若干
年的发展,朱槿已经成为城市公路、公园、工厂、学校、
政府机关等常用的绿化植物。由于CLCuMV福州分
离物DNA-A与广东分离物的相似性高达99.6%以
上,推测CLCuMV可能是通过朱槿的苗木调运而从
广东省入侵福建省的。入侵后的CLCuMV经过B型
烟粉虱在苗圃间传播,同时病枝扦插繁殖、苗木交易
加速了病毒病的发生和蔓延扩散。更为重要的是,朱
槿和棉花同属锦葵科,且我国广西已经发现有
CLCuMV危害棉花的报道[17],如果该病毒分离物一
旦入侵棉区,势必造成严重后果。此外,试验也验证
了福州市朱槿曲叶病病株上烟粉虱的生物型是B型,
该生物型是我国烟粉虱种群中的优势种,南北多数省
市均有分布,携带和传播棉花曲叶病毒的能力较强。
因此有必要在广东、广西、海南、福建等省开展对木尔
坦棉花曲叶病毒引起的植物病害综合治理研究,以控
制其扩散和蔓延,特别要警惕CLCuMV随烟粉虱传
播、扩散至内陆棉区暴发流行。
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殤
殤殤
殤
794-795.
学会活动 “中国植物保护学会第十一次全国会员代表大会
暨学术年会”第一轮通知
中国植物保护学会决定于2013年10月下旬在山东省青岛市召开“中国植物保护学会第十一次全国会员代表大会暨学术
年会”。大会由中国植物保护学会主办,中国农业科学院植物保护研究所、植物病虫害生物学国家重点实验室、山东省植物保
护学会、青岛农业大学、山东省农科院植物保护研究所协办。在会议期间同期举办第二届国际生物入侵大会等活动。现将有
关事项通知如下:
一、会议主题
生物入侵与生态安全、粮食安全
二、时间、地点和规模
1.全国会员代表大会暨学术年会会议时间:2013年10月22-25日。10月22日报到,10月23日全国会员代表大会,10
月24日大会学术报告和分组学术交流,10月25日考察或离会。
2.第二届国际生物入侵大会会议时间:2013年10月23-27日。10月23日报到,10月24-26日学术交流,10月27日考
察或离会。会议注册、提交会议论文摘要请登录会议网站www.icbi2013.org在线完成。
3.地点:山东省青岛市(详细会址及交通路线见第二轮通知)。
4.规模:1000人。
三、大会报告和分组报告
大会报告将特邀国内外著名科学家做专题报告;分组报告将设植物病害与综合治理、农业昆虫与害虫防治和园艺植物病
虫害绿色防控技术3个分会场,演讲人除邀请外将从优秀论文中挑选。
四、会议内容
1.召开第十一届全国会员代表大会选举产生第十一届理事会和学会领导;2.召开中国植物保护学会第十一届理事会第一
次会议;3.大会和分会场学术交流;4.举行中国植物保护学会第四届青年科技奖、先进省级学会、先进学会工作者、中青年优秀
论文奖等颁奖典礼;5.召开第二届国际生物入侵大会(The 2nd International Congress on Biological Invasions),大会交流语言为英
文;6.《植物保护》创刊50周年座谈会。7.附设国际会议论文墙报展示和植保产品及出版物等展览,有关参展事宜另文通知。
五、论文征集及优秀论文评选
征文内容及要求详见中国植物保护学会网站:http://ipmchina.net/。
六、联系方式
联系单位:中国植物保护学会秘书处 联系人:文丽萍、冯凌云、胡静明
电话:010-62815913,62811917, 传真:010-62815913, 电子信箱:cspp62@163.com
二○一三年三月十日
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