全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４６(１): １１￣１６(２０１６)
收稿日期: ２０１４￣１２￣０６ꎻ 修回日期: ２０１５￣１０￣１４
基金项目: 国家农业行业专项计划项目(ｎｙｈｙｚｘ２００９０３０１７￣０８)
通讯作者: 洪 霓ꎬ教授ꎬ主要研究方向为植物病毒学ꎻＥ￣ｍａｉｌ: ｗｈｎｉ＠ｍａｉｌ. ｈｚａｕ. ｅｄｕ. ｃｎ
第一作者: 朱晨熹ꎬ男ꎬ青岛市人ꎬ在读硕士生ꎬ主要研究方向为植物病毒学ꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１６.０１.００２
来源于猕猴桃的柑橘叶斑驳病毒的
ＲＴ￣ＰＣＲ检测及外壳蛋白基因序列分析
朱晨熹１ꎬ２ꎬ 王国平１ꎬ２ꎬ 郑亚洲１ꎬ 杨作坤１ꎬ 王利平１ꎬ 徐文兴１ꎬ 洪 霓１ꎬ２∗
( １华中农业大学植物科技学院ꎬ湖北省作物病害监测与安全控制重点实验室ꎬ武汉 ４３００７０ꎻ
２ 华中农业大学ꎬ农业微生物学国家重点实验室ꎬ武汉 ４３００７０)
摘要:柑橘叶斑驳病毒(Ｃｉｔｒｕｓ ｌｅａｆ ｂｌｏｔｃｈ ｖｉｒｕｓꎬＣＬＢＶ)为柑橘病毒属(Ｃｉｔｒｉｖｉｒｕｓ)代表种ꎮ 本研究采用 ＲＴ￣ＰＣＲ技术从我国
栽培猕猴桃上首次检测到 ＣＬＢＶꎬ总检出率为 １３.３％ꎮ 测定了 ５个 ＣＬＢＶ分离物的外壳蛋白基因(ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅꎬｃｐ)序
列ꎬ全长均为 １ ０９２ 核苷酸(ｎｔ)ꎬ分离物间 ｃｐ基因核苷酸和编码氨基酸序列相似性分别为 ８３.２％~９９.７％和 ９１.９％~９８.９％ꎬ
这些分离物与新西兰报道的 ＣＬＢＶ猕猴桃分离物Ｍ３￣Ａ核苷酸序列相似性仅为 ８３％左右ꎬ与来源于柑橘及近缘种的 ＣＬＢＶ
分离物 ｃｐ基因核苷酸序列相似性为 ８４％ ~ ８６％ꎮ 在基于该病毒 ｃｐ 基因核苷酸序列的系统进化树中ꎬ本研究所测定的
ＣＬＢＶ猕猴桃分离物与新西兰报道的除 Ｍ３￣Ａ外的猕猴桃分离物聚在同一组群ꎮ 研究结果为进一步明确 ＣＬＢＶ 在我国猕
猴桃上的侵染和危害特点及建立该病毒的分子检测技术提供了重要信息ꎮ
关键词:猕猴桃ꎻ 柑橘叶斑驳病毒ꎻ 检测ꎻ 序列分析
ＲＴ￣ＰＣＲ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｉｔｒｕｓ ｌｅａｆ ｂｌｏｔｃｈ
ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅｓ 　 ＺＨＵ Ｃｈｅｎ￣ｘｉ１ꎬ２ꎬＷＡＮＧ Ｇｕｏ￣ｐｉｎｇ１ꎬ２ꎬ ＺＨＥＮＧ Ｙａ￣ｚｈｏｕ１ꎬ ＹＡＮＧ
Ｚｕｏ￣ｋｕｎ１ꎬ ＷＡＮＧ Ｌｉ￣ｐｉｎｇ１ꎬ ＸＵ Ｗｅｎ￣ｘｉｎｇ１ꎬ ＨＯＮＧ Ｎｉ１ꎬ２ 　 ( １ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬＫｅｙ Ｌａｂ ｏｆ
Ｃｒｏｐ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ ａｎｄ Ｓａｆｅｔｙ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｉｎ ＨｕｂｅｉꎬＨｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＷｕｈａｎ ４３００７０ꎬＣｈｉｎａꎻ２ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｋｅｙ
Ｌａｂ ｏｆ ＡｇｒｏｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙꎬＨｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬＷｕｈａｎ ４３００７０ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｃｉｔｒｕｓ ｌｅａｆ ｂｌｏｔｃｈ ｖｉｒｕｓ (ＣＬＢＶ) ｉｓ ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｇｅｎｕｓ Ｃｉｔｒｉｖｉｒｕｓ. Ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙꎬ ＣＬＢＶ ｗａｓ
ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｉｎ ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ (Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｓｐｐ.) ｐｌａｎｔｓ ｇｒｏｗｎ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ｆｏｒ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｔｉｍｅ ｂｙ ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ＰＣＲ
(ＲＴ￣ＰＣＲ) . ＣＬＢＶ ｗａｓ ｔｅｓｔｅｄ ｉｎ ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ ｐｌａｎｔｓ ｗｉｔｈ ａ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒａｔｅ ｏｆ １３.３％. Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅ ｃｐ ｇｅｎｅ ｏｆ ｆｉｖｅ
ＣＬＢＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｗａｓ １ ０９２ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ (ｎｔｓ) ｉｎ ｌｅｎｇｔｈ ａｎｄ ｓｈａｒｅｄ ８６.６％－９９.７％ ｎｔ ａｎｄ ９６.４％－９９.４％ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
(ａａ) ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ ｗｉｔｈ ｅａｃｈ ｏｔｈｅｒꎬ ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ. Ｈｏｗｅｖｅｒꎬ ｔｈｅｙ ｓｈａｒｅｄ ｏｎｌｙ ａｂｏｕｔ ８３％ ｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ａ
ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ ｉｓｏｌａｔｅ Ｍ３￣Ａ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｉｎ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄꎬ ａｎｄ ８４％－８６％ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｗｉｔｈ ＣＬＢＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｃｉｔｒｕｓ ａｎｄ
ｉｔｓ ｒｅｌａｔｉｖｅｓ. Ｉｎ ｔｈｅ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｂａｓｉｎｇ ｏｎ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｐ ｇｅｎｅｓꎬ ＣＬＢＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ
ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｅｓｅｎｔ ｓｔｕｄｙ ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ ｉｎｔｏ ａ ｇｒｏｕｐ ｗｉｔｈ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ ＣＬＢＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｅｘｃｅｐｔ ｆｏｒ ｉｓｏｌａｔｅ Ｍ３￣Ａ.
Ｏｕｒ ｓｔｕｄｉｅｓ ｗｏｕｌｄ ｂｅ ｆａｖｏｒａｂｌｅ ｔｏ ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄ ｔｈｅ ｏｃｃｕｒｒｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｉｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｎ Ｃｈｉｎａ ａｎｄ ｔｏ ｅｓｔａｂｌｉｓｈ ａ ｍｏｒｅ
ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ＲＴ￣ＰＣＲ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＬＢＶ ｉｎｆｅｃｔｉｎｇ ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ ｔｒｅｅｓ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｓｐｐ.ꎻ Ｃｉｔｒｕｓ ｌｅａｆ ｂｌｏｔｃｈ ｖｉｒｕｓꎻ ＲＴ￣ＰＣＲꎻ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｎａｌｙｓｉｓ
中图分类号: Ｓ４３２.４１　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１６)０１￣００１１￣０６

　
植物病理学报 ４６卷
　 　 柑橘叶斑驳病毒 ( Ｃｉｔｒｕｓ ｌｅａｆ ｂｌｏｔｃｈ ｖｉｒｕｓꎬ
ＣＬＢＶ)为b线性病毒科(Ｂｅｔａｆｌｅｘｉｖｉｒｉｄａｅ)柑橘病毒
属(Ｃｉｔｒｉｖｉｒｕｓ)的代表种[１]ꎮ ＣＬＢＶ 基因组为 ８. ７
ｋｂ的正单链 ＲＮＡ(＋ｓｓＲＮＡ)ꎬ包含 ３ 个开放阅读
框(Ｏｐｅｎ ｒｅａｄｉｎｇ ｆｒａｍｅꎬ ＯＲＦ)ꎬ分别编码复制相关
多聚合蛋白、运动蛋白和外壳蛋白ꎬ５′末端有甲基
化帽子结构ꎬ３′末端具有 ｐｏｌｙ(Ａ) [２]ꎮ
　 　 在自然条件下ꎬＣＬＢＶ主要侵染柑橘属植物ꎬ最
早是在西班牙金桔[Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ ｍａｒｇａｒｉｔａ (Ｌｏｕｒ.)
Ｓｗｉｎｇ]上检测到该病毒[３]ꎬ随后从多个国家的柑橘
及近缘种上发现该病毒ꎬ主要引起金桔和枳壳的芽
接合部失调、橘橙(‘Ｄｗｅｅｔ’ ｔａｎｇｏｒꎬ Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａ￣
ｔａ)叶片斑驳和香橼(‘Ｅｔｒｏｇ’ ｃｉｔｒｏｎꎬＣｉｔｒｕｓ ｍｅｄｉｃａ)
茎痘ꎬＣＬＢＶ 某些分离物可引起甜橙脉明[４~６]ꎮ 新
西兰首次从中国引进的中华猕猴桃上检测到该病
毒ꎬＣＬＢＶ侵染的猕猴桃植株有的出现脉明、花叶和
脉间黄化症状[７]ꎮ 目前ꎬ新西兰与意大利合作深入
开展了猕猴桃病毒相关研究ꎬ已报道的猕猴桃病毒
有 １３种[８ꎬ９]ꎮ 我国早期已发现栽培猕猴桃植株上有
病毒及类似病害的发生[１０]ꎬ日本也报道了猕猴桃嫁
接传染性病害[１１]ꎬ但均未对其病原开展研究ꎮ 为明
确我国猕猴桃的病毒侵染状况ꎬ本研究组自 ２０１３年
起开展了猕猴桃病毒病的调查与病毒鉴定ꎬ并从我
国种植猕猴桃上检测出猕猴桃病毒 Ａ(Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｖｉ￣
ｒｕｓ ＡꎬＡｃＶＡ)和猕猴桃病毒 Ｂ (Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｖｉｒｕｓ Ｂꎬ
ＡｃＶＢ) [１２]ꎮ 本研究在田间调查的基础上ꎬ采用
ＲＴ￣ＰＣＲ技术ꎬ对来自中国部分地区的猕猴桃栽培种
和保存猕猴桃资源的 ＣＬＢＶ侵染状况进行了分析ꎬ
并通过对该病毒外壳蛋白编码基因的序列分析初步
揭示了 ＣＬＢＶ猕猴桃分离物的分子多样性ꎬ研究结
果为探索猕猴桃病毒病防控及深入研究该病毒分子
特性奠定了基础ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 材料收集及总 ＲＮＡ提取
　 　 ２０１４年 ６ 月分别从湖北省果茶所、中国科学
院武汉植物研究所和安徽省六安市采集猕猴桃
(Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｓｐｐ.)叶片样品 ７５ 份ꎮ 多数采样植株的
叶片表现褪绿斑驳、褪绿环纹、脉黄、花叶和叶片畸
形等类似病毒病症状ꎮ 取嫩叶 ０.１ ｇꎬ加液氮磨碎ꎬ
快速转入 １.５ ｍＬ 离心管中ꎬ加入 １ ｍＬ ＲＮＡ 提取
缓冲液(含 ５０％异硫氰酸胍ꎬ５ ｍｏｌ / Ｌ苯酚)充分混
匀ꎬ室温静置 ５ ｍｉｎ后离心ꎬ上清液经氯仿抽提２次
后加入 ２ / ３体积的异丙醇沉淀核酸ꎬ沉淀物经 ７５％
乙醇洗涤 ２次ꎬ风干后溶于 ３０ μＬ ＤＥＰＣ 处理水ꎬ
－２０℃保存ꎮ
１.２　 引物
　 　 用于该病毒检测的引物 ＣＬＢＶ１Ｆ / ＣＬＢＶ５Ｒ:５′￣
ＡＧＣＣＡＴＡＧＴＴＧＡＡＣＣＡＴＴＣＣＴＣ￣３′ / ５′￣ＧＣＡＧＡＴ
ＣＡＴＴＣＡＣＣＡＣＡＴＧＣ￣３′参照 Ｃｈａｖａｎ 等[１３]报道的
序列合成ꎬ扩增片段为 ４２５ ｂｐꎬ扩增区域为部分
ｃｐ基因ꎻ用于扩增完整 ｃｐ序列的引物 ＣＰ１Ｆ / ＣＰ１Ｒ:
５′￣ＴＧＴＴＡＡＧＴＣＴＧＡＡＡＣＴＧＣＧＴＣＴ￣３′ / ５′￣ＴＣＲＣＧ￣
ＧＴＡＴＣＣＣＣＴＴＴＡＧＣＡＴＣ￣３′根据已报道的 ＣＬＢＶ
序列[７]设计合成ꎬ扩增片段全长为 １ ５２５ ｂｐꎬ扩增区
域为部分运动蛋白基因(ｍｏｖｅｍｅｎｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅꎬ
ｍｐ)、外壳蛋白基因(ｃｏａｔ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｅｎｅꎬ ｃｐ)和部分
３′非翻译区(３′￣ｕｎｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ ｒｅｇｉｏｎꎬ ３′￣ＵＴＲ)ꎮ 所用
引物由上海生工生物技术有限公司合成ꎮ
１.３　 ＲＴ￣ＰＣＲ
　 　 以提取的总 ＲＮＡ 为模板ꎬ参照试剂使用说明
合成 ｃＤＮＡ第一链ꎮ 反应体系为 ２０ μＬꎬ含 ５×反
转录缓冲液 ４ μＬ、ｄＮＴＰｓ(２.５ ｍｍｏｌ / Ｌ)１ μＬ、ＲＮＡ
酶抑制剂(ＲＮａｓｉｎꎬ４０ Ｕ / μＬ)０.５ μＬ、Ｍ￣ＭＬＶ(２００
Ｕ / μＬ) ０. ５ μＬ、随机引物 ( １００ ｐｍｏｌ / μＬ) １ μＬ、
ＲＮＡ模板 ５ μＬ和 ＤＥＰＣ处理水 ８ μＬꎮ
　 　 ＰＣＲ 扩增条件:９４℃变性 ３ ｍｉｎꎻ９４℃ ３０ ｓꎬ
５４℃ ３０ ｓꎬ７２℃ ９０ ｓꎬ３５ 个循环ꎻ１２℃终止反应ꎮ
采用引物 ＣＬＢＶ１Ｆ / ＣＬＢＶ５Ｒ 的 ＰＣＲ 反应总体系
为 ２５ μＬꎬ含 １０ × Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶缓冲液 ２.５ μＬ、
ｄＮＴＰｓ( ５ μｍｏｌ / μＬ) ０. ５ μＬ、 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶
(５ Ｕ / μＬ)０.２ μＬ、正向和反向引物(１０ μｍｏｌ / μＬ)
各 ０.５ μＬ、ｃＤＮＡ ２ μＬ 和灭菌去离子水 １８.８ μＬꎮ
采用引物 ＣＰ１Ｆ / ＣＰ１Ｒ 的 ＰＣＲ 反应总体系为
２５ μＬꎬ含 １０ × Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶缓冲液 ２.５ μＬ、
ｄＮＴＰｓ( ２. ５ ｍｍｏｌ / Ｌ) １. ５ μＬ、 Ｔａｑ ＤＮＡ 聚合酶
(５ Ｕ / μＬ)０.２ μＬ、正向和反向引物(１０ μｍｏｌ / μＬ)
各 ０.５ μＬ、ｃＤＮＡ ２ μＬ和灭菌去离子水 １７.８ μＬꎮ
１.４　 克隆及测序
　 　 ＲＴ￣ＰＣＲ产物经 １.２％琼脂糖凝胶电泳后ꎬ切
取含目标产物的凝胶ꎬ按琼脂糖凝胶 ＤＮＡ 纯化回
收试剂盒 Ｖ３.０(北京道普生物科技有限公司)说明
２１

　
　 １期 朱晨熹ꎬ等:来源于猕猴桃的柑橘叶斑驳病毒的 ＲＴ￣ＰＣＲ检测及外壳蛋白基因序列分析
书的方法回收目标 ＤＮＡꎬ与载体 ｐＭＤ１８￣Ｔ 连接ꎬ
转化大肠杆菌(Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ)ＤＨ５α菌株感受态
细胞ꎬ涂布在含 ５０ ｍｇ / Ｌ 氨苄青霉素(Ａｍｐｉｃｉｌｌｉｎꎬ
Ａｍｐ)的 ＬＢ固体培养基上ꎬ于 ３７℃培养过夜ꎮ 随
机挑取一定数量的白色单菌落ꎬ分别在含 ５０ ｍｇ / Ｌ
Ａｍｐ的 ＬＢ液体培养基中振荡培养ꎬＰＣＲ 鉴定为
阳性克隆后ꎬ将菌液送至南京金斯瑞生物科技有限
公司进行测序ꎮ
　 　 ＣＬＢＶ的 ｃｐ 基因核苷酸序列比对及推导编码
氨基酸序列比对ꎬ采用生物学软件 Ｃｌｕｓｔａｌｘ(１.８１)
和 ＤＮＡＳＴＡＲ 中的 ＭｅｇＡｌｉｇｎ 程序完成ꎬ系统发育
树构建采用 ＭＥＧＡ６.０ 软件中的邻接法(Ｎｅｉｇｈｂｏｒ
－Ｊｏｉｎｉｎｇ)进行ꎮ 参照的已报道 ＣＬＢＶ 的 ｃｐ 基因
序列见表 １ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＲＴ￣ＰＣＲ检测
　 　 采用引物 ＣＬＢＶ１Ｆ / ＣＬＢＶ５Ｒ 对 ７５ 份猕猴桃
样品进行 ＣＬＢＶ 的 ＲＴ￣ＰＣＲ 检测ꎬ从 １０ 份样品中
获得 ＣＬＢＶ 目标扩增产物ꎬ平均检出率为 １３.３％
(表 ２)ꎮ 其中ꎬ中华猕猴桃(Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ)和
美味猕猴桃(Ａ. ｄｅｌｉｃｉｏｕｓ)的 ＣＬＢＶ 检出率分别为
１３.５％和 ９.１％ꎮ 其他杂交种或野生种类检出率为
２５.０％ꎮ 软枣猕猴桃 ( Ａ. ａｒｇｕｔａ)和毛花猕猴桃
(Ａ. ｅｒｉａｎｔｈａ)各 ２份样品均为 ＣＬＢＶ阴性ꎮ
２.２　 ＣＬＢＶ分离物的 ｃｐ基因序列分析
　 　 采用引物 ＣＰ１Ｆ / ＣＰ１Ｒ 分别对以上检测结果
为阳性的 １０个样品进行扩增ꎬ从来自安徽省的样
品 ＡＨ１２、ＡＨ１４、ＡＨ１７ꎬ 湖北省果茶所样品 Ｇ１５和
中国科学院武汉植物园的样品 Ｚ３ 中扩增获得预
期大小的产物ꎬ对扩增产物进行了克隆和测序ꎬ共
得到 １５个克隆的序列ꎮ
　 　 序列分析结果显示ꎬ扩增得到的 １５ 个克隆产
物全长为 １ ５２５ ｂｐꎬ均包含 ＣＬＢＶ 的部分 ｍｐ 基因
(２４４ ｂｐ)、间隔区(５６ ｂｐ)和部分 ３′￣ＵＴＲ(１３３ ｂｐ)
及完整的 ｃｐ基因 (１ ０９２ ｂｐ)ꎮ ５ 个分离物内各克
隆的核苷酸序列相似性均为 ９９％以上ꎬ从各 ＣＬＢＶ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｏｒｉｇｉｎｓ ａｎｄ ＧｅｎＢａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ｎｕｍｂｅｒｓ ｏｆ ｔｈｅ ｃｐ ｇｅｎｅ ｏｆ ＣＬＢＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ
ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ ａｎｄ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ
Ｉｓｏｌａｔｅ Ｈｏｓｔ Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｏｕｒｃｅ Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ. Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ
Ｆ１￣Ａ Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｉｎａ ＪＱ０１３９６１ [７]
Ｍ３￣Ａ Ａ. ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｉｎａ ＪＮ９００４７７ [７]
Ｆ１￣Ｎ Ａ. ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｉｎａ ＪＮ９３６２７５ [７]
Ｆ￣ＨＹ Ａ. ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｉｎａ ＪＱ０１３９６６ [７]
Ｆ３￣Ｅ４ Ａ. ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｉｎａ ＪＱ０１３９６２ [７]
ＤＭＶ￣９３２ Ｃｉｔｒｕｓ ｒｅｔｉｃｕｌａｔｅ ｘ Ｃ. ｓｉｎｅｎｓｉｓ ＵＳＡ ＦＪ００９３６７ [６]
ＳＲＡ￣１５３ Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ ｍａｒｇａｒｉｔａ Ｆｒａｎｃｅ ＡＪ３１８０６１ [５]
ＮＺ＿Ｇ１８ Ｃ. ｌｉｍｏｎ Ｎｅｗ Ｚｅａｌａｎｄ ＥＵ８５７５３９ [１０]
ＮＺ＿Ｇ７８ Ｐｏｎｃｉｒｕｓ ｔｒｉｆｏｌｉａｔａ ｘ Ｃ. ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｃｈｉｎａ ＥＵ８５７５４０ [１０]
　
Ｔａｂｌｅ ２　 ＲＴ￣ＰＣＲ ｒｅｓｕｌｔｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ＣＬＢＶ ｉｎ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｋｉｗｉｆｒｕｉｔ ｓｐｅｃｉｅｓ
Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｎｏ. ｏｆ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ Ｎｏ. ｏｆ ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｓａｍｐｌｅｓ Ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ / ％
Ａｃｔｉｎｉｄｉａ ｃｈｉｎｅｎｓｉｓ ３７ ５ １３.５
Ａ. ｄｅｌｉｃｉｏｕｓ ２２ ２ ９.１
Ａ. ａｒｇｕｔａ ２ ０ －
Ａ. ｅｒｉａｎｔｈａ ２ ０ －
Ｏｔｈｅｒ １２ ３ ２５.０
Ｔｏｔａｌ ７５ １０ １３.３
３１

　
植物病理学报 ４６卷
分离物中各选取一个代表性克隆 ( ＡＨ１２￣２、
ＡＨ１４￣１、ＡＨ１７￣１、Ｇ１５￣１和 Ｚ３￣２)进行 ｃｐ基因序列
分析ꎮ 来自我国猕猴桃的 ５ 个分离物中ꎬＡＨ１４ 和
Ｚ３的 ｃｐ基因与新西兰报道的猕猴桃分离物Ｆ１￣Ｎ、
Ｆ１￣Ａ、Ｆ３￣Ｅ４ 和 Ｆ￣ＨＹ 相应基因的核苷酸序列相似
性均达 ９８％以上ꎬ而与新西兰报道的 ＣＬＢＶ 猕猴
桃分离物 Ｍ３￣Ａ相应基因的核苷酸序列相似性仅
为 ８３％左右ꎬ与来自柑橘及近缘种的 ＣＬＢＶ 分离
物(ＤＭＶ￣９３２、ＳＲＡ￣１５３、ＮＺ＿Ｇ１８ 和 ＮＺ＿Ｇ７８)的
ｃｐ基因核苷酸序列相似性为 ８４％ ~ ８６％ꎮ ＣＬＢＶ
分离物 ＡＨ１２、ＡＨ１７ 和 Ｇ１５ 间及与其他猕猴桃和
柑橘(或其近缘种)的 ＣＬＢＶ 分离物的 ｃｐ 基因核
苷酸序列相似性为 ８２.６％~８８％(表 ３)ꎮ
　 　 本研究测定的 ５ 个 ＣＬＢＶ 分离物外壳蛋白均
由 ３６３个氨基酸组成ꎬ这些分离物间及与新西兰报
道的猕猴桃分离物(除 ＣＬＢＶ Ｍ３￣Ａ 外)间的 ＣＰ
氨基酸序列相似性为 ９５％以上ꎬ与来自柑橘及其
近缘种的 ＣＬＢＶ 分离物的 ＣＰ 氨基酸序列相似性
为 ９２.５％~９６.４％(表 ３)ꎮ
　 　 在基于该病毒 ｃｐ基因核苷酸序列的系统进化
树中(图 １￣Ａ)ꎬ除 Ｍ３￣Ａ 单独为一分支外ꎬ本研究
所获得ＣＬＢＶ猕猴桃分离物与新西兰报道的猕猴
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｉｅｓ (％) ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ (ｂｅｌｏｗ ｄｉａｇｏｎａｌ) ａｎｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ
(ａｂｏｖｅ ｄｉａｇｏｎａｌ) ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｃｐ ｇｅｎｅ ｏｆ ＣＬＢＶ ｉｓｏｌａｔｅｓ
Ｉｓｏｌａｔｅｓ∗ ＡＨ１２￣２ ＡＨ１７￣１ Ｇ１５￣１ ＡＨ１４￣１ Ｚ３￣２ Ｆ１￣Ａ Ｍ３￣Ａ ＤＭＶ￣９３２ ＳＲＡ￣１５３ ＮＺ￣Ｇ１８ ＮＺ￣Ｇ７８
ＡＨ１２￣２ ９５.９ ９７.３ ９７.３ ９７.３ ９６.７ ９３.１ ９５.１ ９５.１ ９３.７ ９５.３
ＡＨ１７￣１ ８６.３ ９５.３ ９５.３ ９５.９ ９４.８ ９０.８ ９２.９ ９２.９ ９１.８ ９３.２
Ｇ１５￣１ ８８.０ ８６.２ ９７.５ ９７.５ ９７.０ ９３.１ ９４.２ ９４.２ ９２.９ ９４.５
ＡＨ１４￣１ ８８.５ ８６.４ ８７.４ ９８.９ ９８.４ ９３.９ ９５.３ ９５.３ ９４.０ ９５.１
Ｚ３￣２ ８８.６ ８６.６ ８７.５ ９９.７ ９８.４ ９３.９ ９５.３ ９５.３ ９４.２ ９５.１
Ｆ１￣Ａ ８８.４ ８６.３ ８７.５ ９９.３ ９９.４ ９３.３ ９５.３ ９５.３ ９４.０ ９５.１
Ｍ３￣Ａ ８３.４ ８２.９ ８２.６ ８２.８ ８２.９ ８２.９ ９１.９ ９１.９ ９０.６ ９１.７
ＤＭＶ￣９３２ ８５.７ ８３.７ ８４.９ ８４.９ ８５.０ ８５.２ ８４.２ ９８.９ ９７.３ ９８.４
ＳＲＡ￣１５３ ８５.７ ８３.２ ８４.７ ８４.７ ８４.７ ８５.０ ８４.０ ９７.４ ９７.３ ９８.４
ＮＺ＿Ｇ１８ ８４.６ ８３.０ ８３.６ ８４.２ ８４.２ ８４.４ ８２.７ ９８.４ ９６.７ ９６.７
ＮＺ＿Ｇ７８ ８５.４ ８３.２ ８４.６ ８４.６ ８４.６ ８４.９ ８２.９ ９８.３ ９８.４ ９６.７
　 “∗”: Ｆ１￣Ａꎬ Ｍ３￣Ａꎬ ＤＭＶ￣９３２ꎬ ＳＲＡ￣１５３ꎬ ＮＺ＿Ｇ１８ ａｎｄ ＮＺ＿Ｇ７８ ａｒｅ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ.
Ｆｉｇ. １　 Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｃｉｔｒｕｓ ｌｅａｆ ｂｌｏｔｃｈ ｖｉｒｕｓ(ＣＬＢＶ) ｉｓｏｌａｔｅｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ(Ａ)ａｎｄ ｄｅｄｕｃｅｄ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ(Ｂ)ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅｉｒ ｃｐ ｇｅｎｅ
▲ Ｔｈｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｒｅｆｅｒｒｅｄ ｆｒｏｍ ＧｅｎＢａｎｋ.
４１

　
　 １期 朱晨熹ꎬ等:来源于猕猴桃的柑橘叶斑驳病毒的 ＲＴ￣ＰＣＲ检测及外壳蛋白基因序列分析
桃其他分离物聚为一组(组 Ｉ)ꎬ来自柑橘及其近缘
种的分离物聚为另一组(组 ＩＩ)ꎮ 在组 Ｉ 中ꎬＡＨ１４
和 Ｚ３ 与新西兰报道的猕猴桃分离物亲缘关系较
近ꎬＡＨ１２、Ｇ１５和 ＡＨ１７则与这些分离物亲缘关系
较远ꎮ 在基于该病毒 ＣＰ 氨基酸序列的系统进化
树中(图 １￣Ｂ)ꎬ除来自柑橘及其近缘种的分离物聚
在一组外ꎬ其他分离物间均存在一定的遗传距离ꎬ
进一步表明来自猕猴桃的 ＣＬＢＶ 分离物存在较大
的分子变异ꎮ
３　 讨论
　 　 本研究首次对侵染我国猕猴桃的 ＣＬＢＶ 进行
分子检测ꎬ发现中华猕猴桃和美味猕猴桃均存在该
病毒侵染ꎬ该病毒在这 ２种猕猴桃上的检出率分别
达 １３.５％和 ９.１％ꎮ 本研究未从软枣猕猴桃和毛花
猕猴桃上检测到该病毒ꎬ但因分析的样品数较少ꎬ
该结果不能完全代表这 ２ 种猕猴桃上 ＣＬＢＶ 的侵
染状况ꎮ ＣＬＢＶ主要通过种苗和无性繁殖材料调
运而远距离传播ꎬ侵染柑橘的 ＣＬＢＶ 可通过种子
传播[１４]ꎮ 因此ꎬ加强对种苗及繁殖材料的病毒检
验对防止该病毒扩散将起到重要作用ꎮ
　 　 分析 ＣＬＢＶ不同分离物的完整 ｃｐ基因序列的
结果显示ꎬ来源于我国猕猴桃的 ＣＬＢＶ 具有较大
的分子变异ꎬ分离物间最大差异接近 １３％ꎮ 在这
些分离物中ꎬ仅部分分离物与新西兰报道的猕猴桃
分离物有较近的遗传距离ꎬ但未发现与 Ｍ３￣Ａ在分
子特性上相似的分离物[７]ꎮ 新西兰报道的 ＣＬＢＶ
分离物均来自从中国陕西引进的中华猕猴桃和美
味猕猴桃ꎮ 因此ꎬ这些结果均表明侵染我国猕猴桃
的 ＣＬＢＶ具有高度的遗传多样性ꎬ且与侵染柑橘
类植物的 ＣＬＢＶ分离物在系统进化上有较大的遗
传距离ꎬ但该病毒的变异是否与其寄主地理和种类
来源直接相关还需要进行大量样品的分析ꎮ 此外ꎬ
本研究从 １０ 份猕猴桃样品中检测到 ＣＬＢＶꎬ但仅
从其中 ５ 份上扩增到该病毒的 ｃｐ 基因ꎬ推测可能
与所设计引物靶标序列的变异有关ꎮ Ｖｉｖｅｓ 等[１５]
研究发现来源于不同地理区域的 １４ 个柑橘 ＣＬＢＶ
分离物分子变异很小ꎬ导致分类上明显不同的 ２ 种
果树的 ＣＬＢＶ 分子特性差异的原因ꎬ及其分子特
性与该病毒生物学特性的关系等还有待进一步深
入研究ꎮ 目前ꎬ柑橘 ＣＬＢＶ 的检测主要采用基于
该病毒分子特性的 ＲＴ￣ＰＣＲ 和分子杂交技
术[１５ꎬ１６]ꎬ而侵染猕猴桃的 ＣＬＢＶ 存在高度的分子
变异ꎬ因此有必要在对该病毒分子特性研究基础
上ꎬ建立适合猕猴桃 ＣＬＢＶ 检测的分子技术ꎮ 我
国是猕猴桃的重要起源地ꎬ具有丰富的种质资
源[１７]ꎬ猕猴桃产业正进入快速发展阶段ꎬ加强对猕
猴桃病毒病监控将对猕猴桃产业可持续发展具有
促进作用ꎮ
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责任编辑:于金枝　 　
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