全 文 ：书西北植物学报!
"#$
!
%$
"
##
#$
!#&(!#)$
!"#$%&#%&()$*+,""-.)/#0-/
!!
文章编号$
#"""*$"!&
"
!"#$
#
#*!#&*")
!!!!!!!!!!!!!!!
!"#
$
#"+,)")
%
-
+.//0+#"""*$"!&+!"#$+##+!#&
收稿日期$
!"#$*")*"&
&修改稿收到日期$
!"#$*"*"
基金项目$国家自然科学基金"
%#!)"")$
!
%#$)"%&&
!
%#$)""&
#&云南省应用基础研究项目"
1123!"##!%"%
#
作者简介$文锦芬"
#,%(
#!女!博士!副教授!主要从事植物次生代谢产物方面的研究
4*56.7
$
890
-
:;;;
!
#)%+<=5
"
通信作者$邓明华!博士!副教授!主要从事分子生物学方面的研究
4*56.7
$
>90
?
5.0
?
@A6!"#%
!
#)%+<=5
小桐子
1"!2%3
基因克隆和序列分析
文锦芬#!龚
!
明!!陈
!
凯%!段小凡#!齐亚峰#!王欣欣#!辛
!
艳#!邓明华$"
"
#
昆明理工大学 现代农业工程学院!昆明
)&"&""
&
!
云南师范大学 生命科学院!昆明
)&"&""
&
%
保山学院 资源与环境学院!云
南保山
),;"""
&
$
云南农业大学 园林园艺学院!昆明
)&"!"#
#
摘
!
要$以小桐子"
!"#$%
&
"()$("*
#
为模板!克隆了酰基辅酶
3
结合蛋白"
3<
D
7*E=3*F.0>.0
?
GH=I9.0
#基因
"
!(+,-.
#的
EB2
序列!对其序列进行了生物信息学分析!并采用实时荧光定量
GEJ
方法!研究了
!(+,-.
基因
在小桐子不同器官和果实生长发育阶段的表达模式结果显示$
!(+,-.
基因完全阅读框"
<=>.0
?
/9
K
A90<9
!
EB2
#
全长
!,F
L
!编码
!
个氨基酸预测其编码蛋白质的分子量为
#"+%"MB
!具有
3ENG
家族典型的结构域
!(+,-.
基因推测氨基酸与油桐"
/0$12(2"
3
%$422
!
3OP)!#!&
#的亲缘关系最近"
)Q
#
!(+,-.
基因在小桐子
根(茎(叶(花(发育中的胚及果实等组织中都有表达!其中在花后
$">
的种子中表达最高!其次是果皮!而在根中表
达较少&在果实发育过程中的表达与果实油脂积累的变化趋势基本一致
关键词$酰基辅酶
3
结合蛋白&基因克隆&小桐子&表达分析
中图分类号$
R,;&
&
R,;)
文献标志码$
3
$%"&#&

(&!)*
+
,-..#"&/&(%
0
.#."1(2-3/4
0
%5$"/56#&!#&

7,"8-#&
"
1"!2%3
#
9!-&8#1#-!1,":1$#(&
4
5$"6("$7;<
S4CT.0:90
#
!
UVCUW.0
?
!
!
EX4C16.
%
!
BY3CZ.6=:60
#
!
R[\6:90
?
#
!
S3CUZ.0].0
#
!
Z[C\60
#
!
B4CUW.0
?
@A6
$
"
"
#O6D
=:W=>9H03
?
H.?
.099H.0
?
!
1A05.0
?
Y0.^9H/.I
D
=:2<.90<960>_9<@0=7=
?D
!
1A05.0
?
)&"&""
!
E@.06
&
!E=7*
79
?
9=: .`:92<.90<9
!
\A0060C=H567Y0.^9H/.I
D
!
1A05.0
?
)&"&""
!
E@.06
&
%E=79
?
9=:J9/=AH<9/60>40^.H=0590I
!
N6=/@60Y0.*
9^H/.I
D
!
N6=/@60
!
\A0060),;"""
&
$E=79
?
9=:X=HI. 6`0>/<6
L
9
!
\A00603
?
H.D
!
1A05.0
?
)&"!"#
!
E@.06
#
/6.8,(48
$
3<
D
7*E=3*F.0>.0
?L
H=I9.0
"
3ENG
#
@6/F990
L
H=
L
=/9>I=
L
76
D
6
L
.^=I67H=79.0I@9.0IH6<97A76H
IH6::.?
60>I@9AI.7.a6I.=0=:7=0
?
*<@6.0:6II
D
6<
D
7*E=39/I9H/+_@9=F
-
9
D
./I=>95=0*
/IH6I9I@9/IHA:A0L
79I9EB2/9
K
A90<9=:3<
D
7*E=3*F.0>.0
?L
H=I9.0
?
909
"
!(+,-.
#
86/<7=09>:H=5I@9!"#$%
&
"()$("*`+S96067
D
a9>I@9/9
K
A90<960>/IHA./I.9>
L
H=I9.0
!
60>.I/9]
L
H9//.=0
L
6II9H0/.0I@9>.::9H90I=H
?
60./560>I@9>9^97=
L
590I=:
:HA.IF
DK
A60I.I
D
J_*GEJ+_@9<=5
L
79I9EB2/9
K
A90<9./!,F
L
!
60>90<=>9>!65.0=6<.>H9/.>A9/8.I@
6
L
AI6I.^95=79=09<=0/9H^9>>=56.0*3ENG/A
L
9H:65.7
D
+4^=*
7AI.=06H
D
H976I.=0/@.
L
/6067
D
/./H9^9679>6<7=/9H
?
909I.L
F9I8990I@9!5()$("*`+!(+,-.
?
90960>I@6I=:/0$12(2"
3
%$422
"
)Q
#
+!(+,-.9]
L
H9//.=0/.
?
0.:.<60I7
D
.0>.::9H90I=H
?
60./560>@6>I@9
@.
?
@9/IIH60/L
I
L
H=:.79.0I@9:HA.I
&
I@99]
L
H9//.=079^97=:!(+,-.@6>I@9/659IH90>/8.I@I@97.
L
.>6<*
=-
0
3",!.
$
3<
D
7*E=3*F.0>.0
?L
H=I9.0
&
?
909<7=09
&
!"#$%
&
"()$("*`+
&
9]
L
H9//.=06067
D
/./
!!
小桐子"
!"#$%
&
"()$("*`+
#又名麻疯树(膏
桐(黑皂树等!为大戟科落叶灌木或小乔木!主产于
美洲!非洲和亚洲等热带及亚热带地区!中国主要分
布于云南(广东(广西(贵州(四川(海南和台湾等省
区)#*!*小桐子生长迅速!
%
年可挂果!
&
年进入盛果
期果实采摘期长达
&"
年!种仁的含油率为
)"Q
"
,"Q
)
#
*
!经改性后的小桐子油可适用于各种柴油
发动机!并在闪点(凝固点(硫含量(一氧化碳排放
量(颗粒值等关键技术上均优于国内零号柴油!达到
欧洲二号排放标准!被称为生物柴油树!是世界公认
的!未来最有可能替代化石能源并具有巨大开发潜
力的能源植物树种)#*&*在生物柴油生产中!原料成
本占生物柴油总成本的
)"Q
"
,&Q
)*
近年来小
桐子油脂生物合成与调控机理的研究受到研究人员
的广泛关注!并取得了一定进展!分离了与小桐子油
脂生物合成有关的
6+7888
基因(
!(9+:-#
基因(
N
型 酰 基
3EG
硫 酯 酶 基 因(
!(;.+:
基 因 和
6+788
基因的全序列!并进行了相关分析),*##*
植物油脂的生物合成是受一系列生物酶催化的
链式反应!酰基辅酶
3
结合蛋白"
3ENG
#在其中发
挥重要作用)#!*
3ENG
普遍存在于真核细胞中!是
高度保守的蛋白)#%*
3ENG
的氨基酸组成在物种
内和物种间一致性都在
&"Q
以上!具有一个酰基辅
酶
3
结合结构域"
3EN
#!能与长链的酰基辅酶
3
结
合)#$*!
C
端都含有一个疏水性的跨膜区)#&*在植
物的角果(根系(茎秆(花(叶和发育的胚胎中都有高
浓度
+,-.
基因的
5JC3
表达植物体内的
3ENG
主要分布于角果之中!与种子中油脂的形成
有关)#)*
作为酰基辅酶
3
的载体!
3ENG
与长链脂酰基
辅酶
3
具有高度亲和力)#,*
3ENG
对脂酰基辅酶
3
的胞内贮存和转运!参与糖脂的生物合成及氧化
起重要作用)#;*在植物中除了小分子量的
3ENG
以外!还有分子量大于
#"MB
的大分子量
3ENG

对拟南芥
3ENG
研究表明!大分子量的
3ENG
对酰
基辅酶
3
酯具有不同的亲和性!这种亲和性的差别
暗示它们参与了多种生理功能)#*除了像小分子
3ENG
参与脂类代谢!大分子
3ENG
还影响植物的
发育!如在植物胚胎早期发育和叶片衰老时起调控
作用!此外!还参与逆境胁迫响应!如重金属胁迫!氧
化胁迫!冻害和抗病性等)#*!"*
目前在植物中!已经从蓖麻(油菜(水稻(拟南芥
和苹果等物种中分离鉴定了
3ENG
)
#,
!
#
*
而在能源
植物小桐子中尚未见有关
3ENG
的报道鉴于
3ENG
在脂类代谢中的重要作用!本研究利用电子
克隆的方法!从小桐子中克隆了
!(+,-.
基因!并
进行了初步的生物信息学分析!通过
K
J_*GEJ
技
术调查其在不同组织以及果实发育过程中的表达规
律!以期为进一步探讨小桐子种子含油量累积的分
子机理及抗逆性提供基础资料
#
!
材料和方法
>+>
!
实验材料
实验材料为种植于昆明理工大学现代农业工程
学院实验基地的
$
年生小桐子在盛花期取根(茎(
叶(花(果皮和花后
$">
的种子!液氮速冻后保存在
(;"b
的环境中备用&同时取授粉后不同发育阶段
"
#"
(
!"
(
%"
(
$"
(
&"
和
)">
#小桐子果实!液氮速冻后
保存在
(;"b
的环境中备用
每种组织从
#"
株小桐子树上取样!来源于
%
株
树上的组织混合作为
#
个组织样品!
$
次重复
>+?
!
方
!
法
>+?+>
!
基因克隆
!
各材料的
JC3
用
_H.a=7
提取!
合成用
X.
?
@O.>97.I
D
GH.592L
#
J_*GEJ
1.I
试剂盒!操作过程参考使用说明
小桐子
+,-.
基因特异引物根据蓖麻
+,-.
基因保守区及与之高度一致的小桐子
42_
设计!引
物为
!(+,-.*O
"
&c*EEEUU3_3EU__E_3_33*
3_E*%c
#和
!(+,-.*J
"
&c*EEE3E3EUE33U3U*
33U3E3E_3*%c
#
GEJ
产物连接到
L
WB#;*_
并双向测序!每个基因至少测
&
个克隆
>+?+?
!
生物信息学及系统进化分析
!
测序结果使
用
BC32_3J
"
BC32I6H[0<+
!
W6>./=0
!
S./<+
#软
件初步编辑(比对!人工校对利用
U902<60/=:I*
86H9
"
@II
L
$%%
?
909/+5.I+9>A
%
U4C2E3C+@I57
#进
行
BC3
序列预测!利用
_@9E=0/9H^9>>B=56.0
3H<@.I9I.=067E90I9H:=HN.=I9<@0=7=
?D
[0:=H56I.=0
"
CE*
N[
#
/9H^9H
"
@II
L
$%%
888+0?
=^
%
N` 32_
#进行蛋白质保守结构域的预测和分析!利
用
_@9E=5
L
AI9
L
[
%
W8 _==7
"
@II
L
$%%
888+9]*
L
6/
D
+=H
?
%
I==7/
%
L
.
+
I==7+@I57
#对预测的蛋白质的等
电点和分子量进行预测!利用
2VGW3
"
@II
L
$%%
0
L
/6*
L
F.7+.F<
L
+:H
%#对所推导的蛋白质序列的二级
")#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
结构进行预测
2.
?
067G%+"/9H^9H
"
@II
L
$%%
888+
IA+>M
%
/9H^.<9/
%
2.
?
067G
%#分析信号肽!
G2=HI
$
"
@II
L
$%%
L
/=HI+@
?
<+
-L
%#分析亚细胞定位!
_W*
XWW*!+"/9H^9H
"
@II
L
$%%
888+IA+>M
%
/9H^*
.<9/
%
_WXWW*!+"
%#预测跨膜区域利用
E7A/I*
67Z
!
W9
?
6$+"
和
B06W60/=:I86H9
进行氨基酸比
对和系统发育树的构建
>+?+@
!
基因表达分析
!
用实时荧光定量
GEJ
进行
基因表达定量分析各材料
JC3
用
_H.a=7
提取!
合成用
GH.592L
I
_W
J_H96
?
90I1.I8.I@
?
BC34H6/9H
"
G9H:9#试剂盒!操作过
程参考使用说明
荧光定量
GEJ
应用
2\NJ
#
GH95.]4]:"
<
_W
$
"
_7.JC6/9XG7A/
#试剂盒!根据生产商推荐的方
法!在罗氏
.`
?
@IE
D
<79H$;"
系统上进行
所用
!(+,-.
的引物为
!(+,-.*
K
O
"
&c*33*
U3_E3U_E_3UU333_EE__E*%c
#和
!(+,-.*
K
J
"
&c*UE3_333__3UU333____3U3U_*
U_*%c
#!内参基因
!
="(#21
的引物为
!
="(#21*O
"
&c*
E_U33EEE333UUE_33_EU*%c
#和
!
="(#21*J
"
&c*3E_UUEU_3U3UUU333U33*%c
#
基因表达的数据分析根据
.`^6M
等)!!*报道的
!
(
%%
E_法进行在组织表达分析中用表达量最低的
组织作为校正子!在果实发育过程中的时序表达分
析中用第一发育阶段"
#">
#的样品作校正子
!
!
结果与分析
?<>
!
1"!2%3
的克隆与鉴定
克隆获得的
序列全长
&#"F
L
"图
#
#!整
个
EB2
为
!,F
L
!可以翻译成含有
!
个氨基酸残
基的蛋白质"图
!
#!分子量为
#"+%"MB
!其理论等电
点为
&+&%
负电荷残基"
3/
L
dU7A
#总数为
#&
个!
正电荷残基"
3H
?
d`
D
/
#总数为
#$
个!不稳定系数
为
%&+%
!属于稳定蛋白蛋白质保守域预测表明
所获得的
!(+,-.
序列包含一个
+,-.
超家族
细胞定位预测显示!
(+,-.
编码的蛋白位于
细胞质中对
!(+,-.
编码的蛋白进行跨膜分析
表明该蛋白为膜外蛋白信号肽预测表明该蛋白不
含信号肽
?!
1"!2%3
基因编码氨基酸序列一致性及系统
演化分析
用
CEN[N76/IZ
对
!(+,-.
基因编码氨基酸
序列进行同源搜索!发现小桐子
!(+,-.
基因编码
的氨基酸序列与其他植物
3ENG
氨基酸序列"油桐
3OP)!#!&
(人参
N3N;&;,
(毛果杨
ZG""!%"%$
(蓖
麻
V"$"))
(葡萄
ZG""!!)%$!#
(狭叶洋地黄
E3N*
&))%
#高度一致!其中与大戟科油桐"
/0$12(2"
3
%$=
422
#的一致性为
)Q
!与杨柳科毛果杨"
.%
&
)>)*
#$2(%("$
&
"
#的一致性为
%Q
!与五加科人参"
."=
1"?
@
21*01
@
#和大戟科的蓖麻"
A2(21)*(%BB)12*
#
的一致性均为
!Q
!与葡萄科葡萄"
/2#2*C212
3
0$"
#
的一致性为
#Q
!与玄参科狭叶洋地黄"
D2
@
2#">2*
>"1"#"
#的一致性为
"Q
氨基酸多序列比对显示
植物
3ENG
具 有较 高的保守性 "图
%
#利用
W4U3$+"
软件构建
,
种植物
3ENG
进化树"图
$
#!结果表明!小桐子
!(+,-.
基因编码的氨基酸
序列和同科的油桐
3ENG
聚类!五加科人参和杨柳
科的毛果杨聚类!反映了同源
+,-.
基因系统发生
上的密切关系
图
#
!
小桐子
+,-.
基因电泳检测图
W+BC356HM9H
&
#++,-.
的
GEJ
产物
O.
?
+#
!
GEJ
L
H=>A?
909.0!5()$("*
W+BC356HM9H
&
#+GEJ
L
H=>A图
!
!
小桐子
!(+,-.
核酸和氨基酸序列
O.
?
+!
!
CA<79=I.>960>65.0=6<.>/9
K
A90<9/=:!(+,-..0!5()$("*
#)#!
##
期
!!!!!!!!!!!!!
文锦芬!等$小桐子
!(+,-.
基因克隆和序列分析
图
%
!
小桐子与其他物种
+,-.
基因推导氨基酸序列比对
1E;,&;$$+
小桐子&
3OP)!#!&+
油桐&
N3N;&;,+
人参&
ZG""!%"%$+
果杨&
V"$"))+
蓖麻&
ZG""!!)%$!#+
葡萄&
E3N&))%+
狭叶洋地黄
O.
?
+%
!
37.
?
0590I=:>9>A<9>65.0=6<.>/9
K
A90<9/=:+,-.:H=5!5()$("*`+60>=I@9H
L
760I/
1E;,&;$$+!"#$%
&
"()$("*
&
3OP)!#!&+/0$12(2"
3
%$422
&
N3N;&;,+."1"?
@
21*01
@
&
ZG""!%"%$+.%
&
)>)*#$2(%("$
&
"
&
V"$"))+A2(21)*(%BB)12*
&
ZG""!!)%$!#+/2#2*C212
3
0$"
&
E3N&))%+D2
@
2#">2*>"1"#"
图
$
!
小桐子与其他物种
+,-.
基因
推导氨基酸序列进化树
标尺代表遗传距离&数值代表从
#"""
次重复
计算得到的
N==I/IH6
L
百分比值
O.
?
+$
!
_@99^=7AI.=06H
D
IH99=:65.0=6<.>/9
K
A90<9/
=:+,-.:H=5!5()$("*60>=I@9H
L
760I/
_@9/<679F6HH9
L
H9/90I/
?
909I.<>./I60<9
&
CA5F9H/
H9
L
H9/90II@9N==I/IH6
LL
9H<90I6
?
9 6^7A9/
<67:H=5#"""H9
L
7.<6I9/
图
&
!
小桐子
!(+,-.
基因在不同器官中的表达
O.
?
+&
!
4]
L
H9//.=079^97/=:!(+,-.
?
909
.0>.::9H90I=H
?
60/=:!5()$("*
?<@
!
1"!2%3
基因表达分析
以
!
="(#21
作为内参!对小桐子
!(+,-.
在不
同组织和果实不同发育阶段的表达情况进行
K
J_*
GEJ
分析!分析结果"图
&
#表明!小桐子
!(+,-.
在根(茎(叶(花(发育中的果皮和种子等组织中都有
图
)
!
小桐子
!(+,-.
基因在果实不同发育阶段中的表达
O.
?
+)
!
4]
L
H9//.=079^97/=:!(+,-.
?
909.0:HA.I/
6I>.::9H90I>9^97=
L
590I/I6
?
9/=:!5()$("*
表达!其中在花后
$">
的种子中表达量最高!其次
是果皮!而在根中表达量较少
!(+,-.
基因在果实发育过程中的定量分析
表明$该基因在果实生长发育的前期!随着果实的生
长发育!其表达水平不断增加!在种子生长发育的后
期"
&">
#达到最高峰!然后略有下降"图
)
#
%
!
讨
!
论
本研究以近缘物种的同源基因序列为基础!结
合
U90N60M
中大量
42_
序列!搜寻与该基因高度
一致的
42_
拼接!再利用电子克隆此物种该基因的
完整
EB2
序列!该方法对于从全基因组背景缺乏的
物种中克隆特定基因!具有快速(经济和简便的优
势)!%*利用该方法克隆了小桐子的
!(+,-.
基
因!亲缘关系分析表明与多种植物的
+,-.
基因高
度同源
酰基辅酶
3
结合蛋白"
3ENG
#家族的蛋白结构
保守!具有一个能与长链的酰基辅酶
3
结合的酰基
辅酶
3
结合结构域"
3EN
#
)
#$
*
目前已经测定的
3ENG
大多数都由约
"
个氨基酸组成!分子量约为
#"MB
!其序列在不同物种中高度保守!这些现象表
!)#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷
明
3ENG
蛋白可能具有保守的生理功能)!$*本文
克隆了小桐子的
!(+,-.
基因!亲缘关系分析表
明!小桐子的
!(+,-.
基因编码氨基酸与油桐
"
3OP)!#!&
#的亲缘关系最近!与人参"
N3N;&;,
#(
葡萄"
ZG""!!)%$!#
#(狭叶洋地黄
E3N&))%
#等高
度一致!氨基酸多序列比对显示植物
3ENG
具有较
高的保守性进一步的研究表明!
3ENG
本身与游
离脂肪酸或辅酶
3
不具有亲和性!但对
;
碳以上的
长链酰基辅酶
3
酯具有高度的亲和性)!&*通过与
酰基辅酶
3
酯结合!
3ENG
在酰基辅酶
3
代谢中发
挥重要作用
3ENG
能介导膜间酰基辅酶
3
转运!
将酰基辅酶
3
转运到线粒体或微体中!分别参与
&
*
氧化或甘油酯生物合成)!)*除此而外!
3ENG
还能
保护长链酰基辅酶
3
酯不被酰基辅酶
3
水解酶水
解)!,*本文中报道的小桐子
3ENG
基因编码区全
长为
!,F
L
!编码
!
个氨基酸残基氨基酸序列中
含有多个
E=3
结合位点序列分析和结构特征表
明
T<3ENG
蛋 白 属 于
+,-.
超 家 族!推 定 的
T<3ENG
蛋白无跨膜区和信号肽!暗示
T<3ENG
蛋
白是细胞质中的蛋白在
T<3ENG
蛋白中存在与多
个
6<
D
7*E=3F.0>.0
?L
=!表明
T<3ENG
蛋白像
其他
3ENG
蛋白一样参与酰基酯
E=3
的运输而参
与脂肪酸的合成
以前的研究表明
+,-.
基因的表达存在组织
特异性)!#!;*在本研究中!小桐子
!(+,-.
在根(
茎(叶(花(果皮和发育中种子等组织中都有表达!其
中在花后
$">
的种子中表达量最高!其次是果皮!
而在根中表达量较少这与前人在部分其他物种的
研究结果有一定的差异)!#!;*!这可能与小桐子果实
中油脂含量多有关
前人研究表明
+,-.
基因与脂肪酸的合成有
关!而且其表达量与组织脂肪酸合成量呈正相
关)#$*本研究表明
!(+,-.
基因在小桐子果实生
长发育阶段的表达呈,先升高再降低-的单峰曲线!
且与小桐子种仁的油脂含量的变化趋势基本一致
结合
+,-.
基因在组织表达中表现为在果实中表
达最高!可以推断
+,-.
基因在小桐子果实油脂生
物合成中具有重要作用
参考文献!
)
#
*
!
S3CUZ
"王
!
曦#!
V`CUEX`
"龙春林#
+[0^9/I.
?
6I.=060>9^67A6I.=0=:!"#$%
&
"()$("*
"
4A
L
@=HF.6<969
#
H9/=AH<9.0\A0060GH=^.0<9
)
T
*
++(#"-%#"12("E)11"12("
"云南植物研究#!
""
!
@>
"
&
#$
&&($)"
"
.0E@.09/9
#
+
)
!
*
!
S3CUX"王海燕#!
S4CWO
"文明富#!
[`Y2X2X
"刘石生#!
0#">+3H9^.98=0I@9H9/96H<@
L
H=
?
H9//.0F.=7=
?D
60>AI.7.a6I.=0=:
!"#$%
&
"()$("*`+
)
T
*
+,210*0!%)$1">%
3
:$%
&
2(">,$%
&
*
"热带作物学报#!
"#"
!
@>
"
$
#$
),"(),&
"
.0E@.09/9
#
+
)
%
*
!
TVXC2VC_2
!
42S3J3CC
!
2YT3_X3 W+W=79LL
H=6<@9/I=.5
L
H=^9590I=:!"#$%
&
"()$("* .`00+6/6/A/I6.06F79909H
?D
L
)
T
*
5.>"1#,0>>A0
&
%$#*
!
"##
!
@A
"

#$
#&,%(#&#+
)
$
*
!
W3113JXG2
!
N4E14J1+!"#$%
&
"()$("*
!
6
L
H=5./.0
?
L
:=HI@9
?
909H6I.=0=:F.=>.9/9760>^ 67A9*6>>9><=
L
H=>A)
T
*
+F)$%
&
0"1
!%)$1">%
3
G2
&
247(201(0"14:0(1%>%
@H
!
""
!
>>>
"
;
#$
,,%(,;,+
)
&
*
!
EY[W1
"崔明昆#!
[`CT
"林
!
锦#!
[`XEX
"李红朝#!
0#">+2IA>.9/=0909H
?DL
760IH9/=AH<9/.0\A0060
)
T
*
+!%)$1">%
3
E)11"1I%$=
B">J12C0$*2#
H
"云南师范大学学报#!
""
!
?B
"
)
#$
%($)
"
.0E@.09/9
#
+
)*
!
\3CUTU
"杨继国#!
[`C S_
"林炜铁#!
SYT`
"吴军林#
+3>^60<9/.090a
D
56I.D
0I@9/./=:F.=>.9/97
)
T
*
+F1C2$%1B01#">.$%#0(#2%1
"14,0B2(">814)*#$
H
"化工环保#!
""$
!
?C
"
!
#$
##)(#!"
"
.0E@.09/9
#
+
)
,
*
!
[`T
!
[`WJ
!
SYGP
!
0#">+W=79?
60>9]
L
H9//.=06067
D
/./=:6
?
90990<=>.0
?
6
L
AI6I.^9*M9I=6<
D
7*6<
D
7<6HH.9H
L
H=I9.0
"
3EG
#
/
D
0I@6/9

"
6+7

#
:H=5!"#$%
&
"()$("*
)
T
*
+:$00.
H
*2%>%
@H
!
"";
!
?D
"
)
#$
!#(!,+
)
;
*
!
SYGP
!
[`T
!
S4[R
!
0#">+E7=0.0
?
60>:A0D
7*6<
D
7<6HH.9H
L
H=I9.0I@.=9/I9H6/9
"
!(9+:-#
#
:H=5!"#$%
&
"
()$("*
)
T
*
+:$00.
H
*2%>%
@H
!
""
!
?B
"
#"
#$
#!(#%"&+
)

*
!
B3C[1U
!
X3__[12
!
J3e[1YW3JG
!
0#">+2IHA:A0D
/9/=:6/6IAH6I9>6<
D
73EGI@.=9/I9H6/9
!
I
DL
9N:H=5.5*
56IAH9/99>I.//A9=:!"#$%
&
"()$("*
)
T
*
+.>"1#-2%>%
@H
!
"##
!
>@
"
%
#$
&%($)#+
)
#"
*
!
PX3CUC
"张
!
楠#!
ZYJX
"徐荣华#!
[`YZPX
"刘小烛#!
0#">+E7=0.0
?
60>/9
K
A90<96067
D
/./=:*1*
?
7
D
<9H=7*%*
L
@=/
L
@6I96<
D
7IH60/*
:9H6/9
?
909
"
!(;.+:
#
:H=5!"#$%
&
"()$("*`+
)
T
*
+.>"1#.
H
*2%>%
@H
!%)$1">
"植物生理学报#!
"##
!
CE
"
!
#$
#;#(#;;
"
.0E@.09/9
#
+
)
##
*
!
S4[R
!
[`T
!
PX3CU`
!
0#">+E7=0.0
?
60><@6H6&
*M9I=6<
D
7*6<
D
7<6HH.9H
L
H=I9.0/
D
0I@6/9
$
:H=5!"#$%
&
"()$("*
)
T
*
+
%)#!
##
期
!!!!!!!!!!!!!
文锦芬!等$小桐子
!(+,-.
基因克隆和序列分析
!%)$1">%
3
.>"1#.
H
*2%>%
@H
!
"#!
!
>FB
"
;
#$
;#)(;!$+
)
#!
*
!
2` VEVWN42G
!
EVJC3XT
!
G[CO[4` B*S4` 2`X
!
0#">+V.76<.H9F
D
5=>.:.<6I.=0=::6II
D
6<.>FH96M>=80
60>7.
L
.>/
D
0I@9/./
L
6I@86
D
/
)
T
*
+.>"1#-2%#0(1%>%
@H
!%)$1">
!
""
!
E
"
,
#$
)$(,"%+
)
#%
*
!
1[JY_X[13T
!
J3T42X2
!
GVCC[3X 3U
!
0#">+W=79?
60><@6H6D
7*E=3F.0>.0
?L
H=I9.0
"
+,-.
#
?
909
:H=5/@H.5
L
.01"0)*B%1%4%19]
L
=/9>I=/67.0.I
D
/IH9//
)
T
*
+D0C0>%
&
B01#">"14,%B
&
"$"#2C08BB)1%>%
@H
!
"#%
!
CA
"
#
#$
,;(;!+
)
#$
*
!
NYJ_VCW
!
JV24_W
!
O34JU4W3CCT
!
0#">+4^=7AI.=0=:I@96<
D
7*E=3F.0>.0
?L
H=I9.0
"
3ENG
#)
T
*
+-2%(0B2(">!%)$1">
!
""&
!
@B?
"
!
#$
!(%",+
)
#&
*
!
SX[_C4\XW
!
W[EX34` 2VC`e
!
23\3CVe3V
!
0#">+OA0D
I=<@H=59F&:A/.=0>9/6IAH6/9/:H=5
3095=0979^9.79.
$
I@9A09]
L
9.>90I.:.<6I.=0=:6:6II
D
6<.>B97I6)>9/6IAH6/9
)
T
*
+.>"1#"
!
""%
!
?>E
"
)
#$
;%(!+
)
#)
*
!
X[UX__VS4JJ
!
N3B4CE
!
G4CP4244]
L
H9//.=0=:60I.:H99a9
L
H=I9.0/.0IH60/
?
90.<
L
760I
)
T
*
+.>"1#K%>0()>"$-2%>%
@H
!
##
!
>E
"
&
#$
!#(%$+
)
#,
*
!
Z[3V2
!
EX\4W`+C98H=79/:=H6<
D
7*E=3*F.0>.0
?L
H=I9.0/
"
3ENG/
#
.0
L
760I>9^97=
L
590I
!
/IH9//H9/
L
=0/9/60>7.
L
.>59I6F=7./5
)
T
*
+
.$%
@
$0**21G2
&
24A0*0"$(
!
"##
!
GA
"
!
#$
#$#(#&#+
)
#;
*
!
2X[CVP31[1
!
\3W3UCEX[*2X[CVP31[1+W=79L
=0/9/>9@
D
>H6I.=060>7=8I95
L
9H6IAH9
$
>.::9H90<9/60>I8990I8=/IH9///.
?
067.0
?L
6I@86
D
/
)
T
*
+,)$$5L
&
215.>"1#-2%>5
!
"""
!
@
"
%
#$
!#,(!!%+
)
#
*
!
_313_V3X
!
2X[W[BPYNW
!
32X[P3S33!
0#">+306<
D
7*E=3*F.0>.0
?L
H=I9.0:H=5
?
H6
L
9I@6I./.0>A<9>I@H=A
?
@4J/IH9//<=0*
:9H/5=H
L
@=7=
?
.<67<@60
?
9/60>>./96/9H9/./I60<9.0+$"M24%
&
*2*
)
T
*
+!%)$1">%
3
.>"1#.
H
*2%>%
@H
!
"#%
!
>EA
"
)
#$
&#()""+
)
!"
*
!
\YJEX4C1VVG
!
S424` 314JT+[0^=7^9590I=:7=85=79D
7*E=3*F.0>.0
?L
H=I9.0.0/99>=.7F.=/
D
0I@9/./
)
T
*
+
I0N-2%#0(1%>%
@H
!
"##
!
?D
"
!
#$
,(##"+
)
!#
*
!
N3[2X
"柏素花#!
PXYT
"祝
!
军#!
B3[X "戴洪义#
+E7=0.0
?
60>9]
L
H9//.=06067
D
/./=:60986<
D
7*E=3*F.0>.0
?L
H=I9.0!
"
K4+,-.!
#
.>90I.:.9>:H=5K">)*4%B0*#2("
)
T
*
++(#"O%$#2()>#)$"07212("
"园艺学报#!
"#!
!
@B
"
#"
#$
#;%(#"!
"
.0E@.09/9
#
+
)
!!
*
!
W4CUS
!
2Y\EO
!
23YCB4J2JW1
!
0#">+_@9H.<96<
D
7*E=3*F.0>.0
?L
H=I9.0
?
909:65.7
D
$
G@
D
7=
?
90
D
!
9]
L
H9//.=060>:A0067
D
/./
)
T
*
+I0N.
H
#%>%
@
2*#
!
"##
!
>DB
"
$
#$
##,"(##;$+
)
!%
*
!
X3JB[2VCJE+E=5
L
6H6I.^9
?
90=5.)
T
*
5.>%7-2%>%
@H
!
""%
!
#
$
&;+
)
!$
*
!
1J3U4` YCBNN
!
1CYB24CT
!
GVY` 24COW+3<
D
7*<=90a
D
593F.0>.0
?L
H=I9.0
"
3ENG
#)
T
*
+-2%(2B2("0#-2%
&

H
*2("+(#"=K%>0(=
)>"$"14,0>>-2%>%
@H
%
3
G2
&
24*
!
#
!
>CC>
"
!
#$
#&"(#)#+
)
!&
*
!
W[114` 24CT
!
XVTJYGG
!
C[4` 24CGO
!
0#">+35.0=6<.>/9
K
A90<9=:6<
D
7*E=3*F.0>.0
?
/9
K
A90<9:H=5<=87.^9H
)
T
*
+-2%(0B2(">
!%)$1">
!
#;,
!
$&
$
;&,(;)#+
)
!)
*
!
J32WY224CT_
!
O34JU4W3CCT
!
1J[2_[3C24C1
!
0#">+3<
D
7*E=3F.0>.0
?L
H=I9.0
"
3ENG
#
<6059>.6I9.0I9H595FH6096<
D
7*
E=3IH60/
L
=HI60>>=06I96<
D
7*E=3:=HF9I6*=].>6I.=060>
?
7
D
<9H=7.
L
.>/
D
0I@9/./
)
T
*
+-2%(0B2(">!%)$1">
!
#$
!

$
#)&(#,"+
)
!,
*
!
J32WY224CT_
!
JV24CB3` T
!
1CYB24CT+[0I9H6D
7*E=3F.0>.0
?L
H=I9.0
"
3ENG
#
=0
L
H=<9//9/:=H8@.<@6<
D
7*E=3./6
/AF/IH6I9
!
L
H=>A)
T
*
+-2%(0B2(">!%)$1">
!
#%
!
!
$
",(#%+
)
!;
*
!
X[` 2`WT
!
B3CCJ
!
\`B[3_4B
!
0#">+W=79?
=:6&
)*`+:=H6@=5=7=
?
A9=:6<
D
*7E=3*F.0>.0
?
L
H=I9.0
)
T
*
+.>"1#K%>0()>"$-2%>%
@H
!
#$
!
?G
"
&
#$
#,(!"+
$)#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$
卷