全 文 ：书西北植物学报!
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文章编号$#"""*$"!&
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收稿日期$!"#$*")*"&
&修改稿收到日期$!"#$*"*"
基金项目$国家自然科学基金" %#!)"")$
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#&云南省应用基础研究项目"
1123!"##!%"%
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作者简介$文锦芬" #,%( #!女!博士!副教授!主要从事植物次生代谢产物方面的研究 4*56.7$
890
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通信作者$邓明华!博士!副教授!主要从事分子生物学方面的研究 4*56.7$
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5.0
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小桐子
1"!2%3
基因克隆和序列分析
文锦芬#!龚
!
明!!陈
!
凯%!段小凡#!齐亚峰#!王欣欣#!辛
!
艳#!邓明华$" " # 昆明理工大学 现代农业工程学院!昆明 )&"&"" & ! 云南师范大学 生命科学院!昆明 )&"&"" & % 保山学院 资源与环境学院!云 南保山 ),;""" &$
云南农业大学 园林园艺学院!昆明
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#
摘
!
要$以小桐子" !"#$%
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为模板!克隆了酰基辅酶
3
结合蛋白"
3<
D
7*E=3*F.0>.0
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GH=I9.0
#基因
"
!(+,-.
#的
EB2
序列!对其序列进行了生物信息学分析!并采用实时荧光定量
GEJ
方法!研究了
!(+,-.
基因
在小桐子不同器官和果实生长发育阶段的表达模式结果显示$!(+,-. 基因完全阅读框" <=>.0 ? /9 K A90<9 ! EB2 # 全长 !,F L !编码 ! 个氨基酸预测其编码蛋白质的分子量为 #"+%"MB !具有 3ENG 家族典型的结构域 !(+,-. 基因推测氨基酸与油桐" /0$12(2"
3
%$422 ! 3OP)!#!& #的亲缘关系最近" )Q # !(+,-. 基因在小桐子 根(茎(叶(花(发育中的胚及果实等组织中都有表达!其中在花后$">
的种子中表达最高!其次是果皮!而在根中表
达较少&在果实发育过程中的表达与果实油脂积累的变化趋势基本一致
关键词$酰基辅酶 3 结合蛋白&基因克隆&小桐子&表达分析 中图分类号$
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文献标志码$3$%"&#&

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"()$("*`+ & 9] L H9//.=06067 D /./ !! 小桐子" !"#$%
&
"()$("*`+ #又名麻疯树(膏 桐(黑皂树等!为大戟科落叶灌木或小乔木!主产于 美洲!非洲和亚洲等热带及亚热带地区!中国主要分 布于云南(广东(广西(贵州(四川(海南和台湾等省 区)#*!*小桐子生长迅速! % 年可挂果! & 年进入盛果 期果实采摘期长达 &" 年!种仁的含油率为 )"Q " ,"Q ) # * !经改性后的小桐子油可适用于各种柴油 发动机!并在闪点(凝固点(硫含量(一氧化碳排放 量(颗粒值等关键技术上均优于国内零号柴油!达到 欧洲二号排放标准!被称为生物柴油树!是世界公认 的!未来最有可能替代化石能源并具有巨大开发潜 力的能源植物树种)#*&*在生物柴油生产中!原料成 本占生物柴油总成本的 )"Q " ,&Q )* 近年来小 桐子油脂生物合成与调控机理的研究受到研究人员 的广泛关注!并取得了一定进展!分离了与小桐子油 脂生物合成有关的 6+7888 基因( !(9+:-# 基因( N 型 酰 基 3EG 硫 酯 酶 基 因( !(;.+: 基 因 和 6+788 基因的全序列!并进行了相关分析),*##* 植物油脂的生物合成是受一系列生物酶催化的 链式反应!酰基辅酶 3 结合蛋白" 3ENG #在其中发 挥重要作用)#!* 3ENG 普遍存在于真核细胞中!是 高度保守的蛋白)#%* 3ENG 的氨基酸组成在物种 内和物种间一致性都在 &"Q 以上!具有一个酰基辅 酶 3 结合结构域" 3EN #!能与长链的酰基辅酶 3 结 合)#$*!
C
端都含有一个疏水性的跨膜区)#&*在植
物的角果(根系(茎秆(花(叶和发育的胚胎中都有高
浓度
+,-.
基因的
5JC3
表达植物体内的
3ENG
主要分布于角果之中!与种子中油脂的形成
有关)#)*
作为酰基辅酶
3
的载体!
3ENG
与长链脂酰基
辅酶
3
具有高度亲和力)#,*
3ENG
对脂酰基辅酶
3
的胞内贮存和转运!参与糖脂的生物合成及氧化
起重要作用)#;*在植物中除了小分子量的
3ENG
以外!还有分子量大于
#"MB
的大分子量
3ENG

对拟南芥
3ENG
研究表明!大分子量的
3ENG
对酰
基辅酶
3
酯具有不同的亲和性!这种亲和性的差别
暗示它们参与了多种生理功能)#*除了像小分子
3ENG
参与脂类代谢!大分子
3ENG
还影响植物的
发育!如在植物胚胎早期发育和叶片衰老时起调控
作用!此外!还参与逆境胁迫响应!如重金属胁迫!氧
化胁迫!冻害和抗病性等)#*!"*
目前在植物中!已经从蓖麻(油菜(水稻(拟南芥
和苹果等物种中分离鉴定了
3ENG
)
#,
!
#
*
而在能源
植物小桐子中尚未见有关
3ENG
的报道鉴于
3ENG
在脂类代谢中的重要作用!本研究利用电子
克隆的方法!从小桐子中克隆了
!(+,-.
基因!并
进行了初步的生物信息学分析!通过
K
J_*GEJ
技
术调查其在不同组织以及果实发育过程中的表达规
律!以期为进一步探讨小桐子种子含油量累积的分
子机理及抗逆性提供基础资料
#
!
材料和方法
>+>
!
实验材料
实验材料为种植于昆明理工大学现代农业工程
学院实验基地的
$年生小桐子在盛花期取根(茎( 叶(花(果皮和花后$">
的种子!液氮速冻后保存在
(;"b
的环境中备用&同时取授粉后不同发育阶段
"
#"
(
!"
(
%"
(
$" ( &" 和 )"> #小桐子果实!液氮速冻后 保存在 (;"b 的环境中备用 每种组织从 #" 株小桐子树上取样!来源于 % 株 树上的组织混合作为 # 个组织样品!$
次重复
>+?
!
方
!
法
>+?+>
!
基因克隆
!
各材料的
JC3
用
_H.a=7
提取!
合成用
X.
?
@O.>97.I
D
GH.592L
#
J_*GEJ
1.I
试剂盒!操作过程参考使用说明
小桐子
+,-.
基因特异引物根据蓖麻
+,-.
基因保守区及与之高度一致的小桐子
42_
设计!引
物为
!(+,-.*O
"
&c*EEEUU3_3EU__E_3_33*
3_E*%c
#和
!(+,-.*J
"
&c*EEE3E3EUE33U3U*
33U3E3E_3*%c
#
GEJ
产物连接到
L
WB#;*_
并双向测序!每个基因至少测
&
个克隆
>+?+?
!
生物信息学及系统进化分析
!
测序结果使
用
BC32_3J
"
BC32I6H[0<+
!
W6>./=0
!
S./<+
#软
件初步编辑(比对!人工校对利用
U902<60/=:I*
86H9
"
@II
L
$%%
?
909/+5.I+9>A
%
U4C2E3C+@I57
#进
行
BC3
序列预测!利用
_@9E=0/9H^9>>B=56.0
3H<@.I9I.=067E90I9H:=HN.=I9<@0=7=
?D
[0:=H56I.=0
"
CE*
N[
#
/9H^9H
"
@II
L
$%%
888+0?
=^
%
N` 32_
#进行蛋白质保守结构域的预测和分析!利
用
_@9E=5
L
AI9
L
[
%
W8 _==7
"
@II
L
$%% 888+9]* L 6/ D +=H ? % I==7/ % L . + I==7+@I57 #对预测的蛋白质的等 电点和分子量进行预测!利用 2VGW3 " @II L$%%
0
L
/6*
L
F.7+.F<
L
+:H
%#对所推导的蛋白质序列的二级
")#!
西
!
北
!
植
!
物
!
学
!
报
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
%$卷 结构进行预测 2. ? 067G%+"/9H^9H " @II L$%%
888+
IA+>M
%
/9H^.<9/
%
2.
?
067G
%#分析信号肽!
G2=HI
$" @II L$%%
L
/=HI+@
?
<+
-L
%#分析亚细胞定位!
_W*
XWW*!+"/9H^9H
"
@II
L
$%%
888+IA+>M
%
/9H^*
.<9/
%
_WXWW*!+"
%#预测跨膜区域利用
E7A/I*
67Z
!
W9
?
6$+"
和
B06W60/=:I86H9
进行氨基酸比
对和系统发育树的构建
>+?+@
!
基因表达分析
!
用实时荧光定量
GEJ
进行
基因表达定量分析各材料
JC3
用
_H.a=7
提取!
合成用
GH.592L
I
_W
J_H96
?
90I1.I8.I@
?
BC34H6/9H
"
G9H:9#试剂盒!操作过
程参考使用说明
荧光定量
GEJ
应用
2\NJ
#
GH95.]4]:"
<
_W
$" _7.JC6/9XG7A/ #试剂盒!根据生产商推荐的方 法!在罗氏 .` ? @IE D <79H$;"
系统上进行
所用
!(+,-.
的引物为
!(+,-.*
K
O
"
&c*33*
U3_E3U_E_3UU333_EE__E*%c
#和
!(+,-.*
K
J
"
&c*UE3_333__3UU333____3U3U_*
U_*%c
#!内参基因
!
="(#21
的引物为
!
="(#21*O
"
&c*
E_U33EEE333UUE_33_EU*%c
#和
!
="(#21*J
"
&c*3E_UUEU_3U3UUU333U33*%c
#
基因表达的数据分析根据
.`^6M
等)!!*报道的
!
(
%%
E_法进行在组织表达分析中用表达量最低的
组织作为校正子!在果实发育过程中的时序表达分
析中用第一发育阶段"
#">
#的样品作校正子
!
!
结果与分析
?<>
!
1"!2%3
的克隆与鉴定
克隆获得的
序列全长
&#"F
L
"图
#
#!整
个
EB2
为
!,F
L
!可以翻译成含有
!
个氨基酸残
基的蛋白质"图
!
#!分子量为
#"+%"MB
!其理论等电
点为
&+&%
负电荷残基"
3/
L
dU7A
#总数为
#&
个!
正电荷残基"
3H
?
d`
D
/
#总数为
#$个!不稳定系数 为 %&+% !属于稳定蛋白蛋白质保守域预测表明 所获得的 !(+,-. 序列包含一个 +,-. 超家族 细胞定位预测显示! (+,-. 编码的蛋白位于 细胞质中对 !(+,-. 编码的蛋白进行跨膜分析 表明该蛋白为膜外蛋白信号肽预测表明该蛋白不 含信号肽 ??<br! 1"!2%3 基因编码氨基酸序列一致性及系统 演化分析 用 CEN[N76/IZ 对 !(+,-. 基因编码氨基酸 序列进行同源搜索!发现小桐子 !(+,-. 基因编码 的氨基酸序列与其他植物 3ENG 氨基酸序列"油桐 3OP)!#!& (人参 N3N;&;, (毛果杨 ZG""!%"%$
(蓖
麻
V"$")) (葡萄 ZG""!!)%$!#
(狭叶洋地黄
E3N*
&))%
#高度一致!其中与大戟科油桐"
/0$12(2" 3 %$=
422
#的一致性为
)Q
!与杨柳科毛果杨"
.%
&
)>)*
#$2(%("$
&
"
#的一致性为
%Q
!与五加科人参"
."=
1"?
@
21*01
@
#和大戟科的蓖麻"
A2(21)*(%BB)12*
#
的一致性均为
!Q
!与葡萄科葡萄"
/2#2*C212
3
0$" # 的一致性为 #Q !与玄参科狭叶洋地黄" D2 @ 2#">2* >"1"#" #的一致性为 "Q 氨基酸多序列比对显示 植物 3ENG 具 有较 高的保守性 "图 % #利用 W4U3$+"
软件构建
,
种植物
3ENG
进化树"图
$
#!结果表明!小桐子
!(+,-.
基因编码的氨基酸
序列和同科的油桐
3ENG
聚类!五加科人参和杨柳
科的毛果杨聚类!反映了同源
+,-.
基因系统发生
上的密切关系
图
#
!
小桐子
+,-.
基因电泳检测图
W+BC356HM9H
&
#++,-.
的
GEJ
产物
O.
?
+#
!
GEJ
L
H=>A?
909.0!5()$("*
W+BC356HM9H
&
#+GEJ
L
H=>A图
!
!
小桐子
!(+,-.
核酸和氨基酸序列
O.
?
+!
!
CA<79=I.>960>65.0=6<.>/9
K
A90<9/=:!(+,-..0!5()$("* #)#! ## 期 !!!!!!!!!!!!! 文锦芬!等$小桐子
!(+,-.
基因克隆和序列分析
图
%
!
小桐子与其他物种
+,-.
基因推导氨基酸序列比对
1E;,&; $$+ 小桐子& 3OP)!#!&+ 油桐& N3N;&;,+ 人参& ZG""!%"%$+ 果杨& V"$"))+ 蓖麻& ZG""!!)%$!#+ 葡萄& E3N&))%+ 狭叶洋地黄 O. ? +% ! 37. ? 0590I=:>9>A<9>65.0=6<.>/9 K A90<9/=:+,-.:H=5!5()$("*`+60>=I@9H L 760I/ 1E;,&;$$ +!"#$% & "()$("*
&
3OP)!#!&+/0$12(2" 3 %$422
&
N3N;&;,+."1"?
@
21*01
@
&
ZG""!%"%$+.% & )>)*#$2(%("$& " & V"$"))+A2(21)*(%BB)12*
&
ZG""!!)%$!#+/2#2*C212 3 0$"
&
E3N&))%+D2
@
2#">2*>"1"#"
图
$! 小桐子与其他物种 +,-. 基因 推导氨基酸序列进化树 标尺代表遗传距离&数值代表从 #""" 次重复 计算得到的 N==I/IH6 L 百分比值 O. ? +$
!
_@99^=7AI.=06H
D
IH99=:65.0=6<.>/9
K
A90<9/
=:+,-.:H=5!5()$("*60>=I@9H
L
760I/
_@9/<679F6HH9
L
H9/90I/
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909I.<>./I60<9
&
CA5F9H/
H9
L
H9/90II@9N==I/IH6
LL
9H<90I6
?
9 6^7A9/
<67:H=5#"""H9
L
7.<6I9/
图
&
!
小桐子
!(+,-.
基因在不同器官中的表达
O.
?
+&
!
4]
L
H9//.=079^97/=:!(+,-.
?
909
.0>.::9H90I=H
?
60/=:!5()$("* ?<@ ! 1"!2%3 基因表达分析 以 ! ="(#21 作为内参!对小桐子 !(+,-. 在不 同组织和果实不同发育阶段的表达情况进行 K J_* GEJ 分析!分析结果"图 & #表明!小桐子 !(+,-. 在根(茎(叶(花(发育中的果皮和种子等组织中都有 图 ) ! 小桐子 !(+,-. 基因在果实不同发育阶段中的表达 O. ? +) ! 4] L H9//.=079^97/=:!(+,-. ? 909.0:HA.I/ 6I>.::9H90I>9^97= L 590I/I6 ? 9/=:!5()$("*
表达!其中在花后
$"> 的种子中表达量最高!其次 是果皮!而在根中表达量较少 !(+,-. 基因在果实发育过程中的定量分析 表明$该基因在果实生长发育的前期!随着果实的生
长发育!其表达水平不断增加!在种子生长发育的后
期"
&">
#达到最高峰!然后略有下降"图
)
#
%
!
讨
!
论
本研究以近缘物种的同源基因序列为基础!结
合
U90N60M
中大量
42_
序列!搜寻与该基因高度
一致的
42_
拼接!再利用电子克隆此物种该基因的
完整
EB2
序列!该方法对于从全基因组背景缺乏的
物种中克隆特定基因!具有快速(经济和简便的优
势)!%*利用该方法克隆了小桐子的
!(+,-.
基
因!亲缘关系分析表明与多种植物的
+,-.
基因高
度同源
酰基辅酶
3
结合蛋白"
3ENG
#家族的蛋白结构
保守!具有一个能与长链的酰基辅酶
3
结合的酰基
辅酶
3
结合结构域"
3EN
#
)
#$* 目前已经测定的 3ENG 大多数都由约 " 个氨基酸组成!分子量约为 #"MB !其序列在不同物种中高度保守!这些现象表 !)#! 西 ! 北 ! 植 ! 物 ! 学 ! 报 !!!!!!!!!!!!!!!!!!! %$
卷
明
3ENG
蛋白可能具有保守的生理功能)!$*本文 克隆了小桐子的 !(+,-. 基因!亲缘关系分析表 明!小桐子的 !(+,-. 基因编码氨基酸与油桐 " 3OP)!#!& #的亲缘关系最近!与人参" N3N;&;, #( 葡萄" ZG""!!)%$!#
#(狭叶洋地黄
E3N&))%
#等高
度一致!氨基酸多序列比对显示植物
3ENG
具有较
高的保守性进一步的研究表明!
3ENG
本身与游
离脂肪酸或辅酶
3
不具有亲和性!但对
;
碳以上的
长链酰基辅酶
3
酯具有高度的亲和性)!&*通过与
酰基辅酶
3
酯结合!
3ENG
在酰基辅酶
3
代谢中发
挥重要作用
3ENG
能介导膜间酰基辅酶
3
转运!
将酰基辅酶
3
转运到线粒体或微体中!分别参与
&
*
氧化或甘油酯生物合成)!)*除此而外!
3ENG
还能
保护长链酰基辅酶
3
酯不被酰基辅酶
3
水解酶水
解)!,*本文中报道的小桐子
3ENG
基因编码区全
长为
!,F
L
!编码
!
个氨基酸残基氨基酸序列中
含有多个
E=3
结合位点序列分析和结构特征表
明
T<3ENG
蛋 白 属 于
+,-.
超 家 族!推 定 的
T<3ENG
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基因在小桐子果实生
长发育阶段的表达呈,先升高再降低-的单峰曲线!
且与小桐子种仁的油脂含量的变化趋势基本一致
结合
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基因在组织表达中表现为在果实中表
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基因在小桐子果实油脂生
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