全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ　 ４６(１): １￣１０(２０１６)
收稿日期: ２０１５￣０１￣３０ꎻ 修回日期: ２０１５￣１０￣２１
基金项目: 浙江省重大科技专项重点农业项目(２０１２Ｃ１２００９￣５)ꎻ国家公益性行业(农业)科研专项(２０１２０３０８９)
通讯作者: 戚行江ꎬ研究员ꎬ主要从事果树学及病理学研究ꎻＴｅｌ: ０５７１￣８６４０４５６８ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｑｉｘｊ＠ｍａｉｌ.ｚａａｓ.ａｃ.ｃｎ
第一作者: 任海英ꎬ女ꎬ博士ꎬ副研究员ꎬ主要从事果树病理学研究ꎻＴｅｌ: ０５７１￣８６４１０２６６ꎬＥ￣ｍａｉｌ:ｒｅｎｈｙ＠ｍａｉｌ.ｚａａｓ.ａｃ.ｃｎꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１６.０１.００１
利用常规 ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ检测杨梅凋萎病菌
任海英ꎬ 戚行江∗ꎬ 梁森苗ꎬ 郑锡良
(浙江省农业科学院园艺研究所ꎬ 杭州 ３１００２１)
摘要:凋萎病是近年来危害杨梅的主要病害ꎮ 为了快速灵敏的检测杨梅凋萎病菌(Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ 和 Ｐ. ｍｉｃｒｏｓｐｏ￣
ｒａ)ꎬ本研究开发了常规 ＰＣＲ和 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ实时荧光定量 ＰＣＲ技术各一套ꎮ 利用 Ｐ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ( ＪＮ８６１７７３)和 Ｐ. ｍｉｃｒｏｓ￣
ｐｏｒａ(ＪＮ８６１７７６)的 ＩＴＳ１￣５.８Ｓ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ２序列的相同部分设计引物对(Ｐｖｍ１Ｌ / Ｐｖｍ１Ｒ)ꎮ 该引物对利用常规 ＰＣＲ 技术能
特异性扩增出杨梅凋萎病菌 １８８ ｂｐ的目标产物ꎬ而对照菌株则呈阴性ꎮ 该常规 ＰＣＲ体系能够检测人工接种后 ２１ ｄ和田间
自然发病的有病症杨梅组织中的凋萎病菌ꎬ检测下限是 ０.６×１０５拷贝数ꎮ 利用 Ｐｖｍ１Ｌ / Ｐｖｍ１Ｒ 进行 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ 实时荧光
定量 ＰＣＲꎬ检测灵敏度是常规 ＰＣＲ的 １００倍ꎬ检测下限是 ０.６×１０３拷贝数ꎬ能够检测出人工接种及田间已经感染但尚未表现
症状的杨梅组织中的凋萎病菌ꎮ 这两项技术ꎬ简单、快速、灵敏ꎬ特异性强ꎬ可以应用于杨梅凋萎病的诊断和苗木检疫ꎮ
关键词:杨梅ꎻ 凋萎病菌ꎻ 常规 ＰＣＲꎻ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ实时荧光定量 ＰＣＲꎻ 分子检测
Ｕｓｅ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓꎬ ｔｈｅ
ｃａｕｓｅ ｏｆ ｂａｙｂｅｒｒｙ ｔｗｉｇ ｂｌｉｇｈｔ　 ＲＥＮ Ｈａｉ￣ｙｉｎｇꎬ ＱＩ Ｘｉｎｇ￣ｊｉａｎｇꎬ ＬＩＡＮＧ Ｓｅｎ￣ｍｉａｏꎬ ＺＨＥＮＧ Ｘｉ￣ｌｉａｎｇ
( Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ Ｈａｎｇｚｈｏｕ ３１００２１ꎬ Ｃｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｔｗｉｇ ｂｌｉｇｈｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｉｓ ｏｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｍａｉｎ ｄｉｓｅａｓｅｓ ｏｎ ｂａｙｂｅｒｒｙ (Ｍｙｒｉｃａ ｒｕｂｒａ Ｓｉｅｂ.＆Ｚｕｃｃ) . Ｗｅ ｄｅｖｅ￣
ｌｏｐｅｄ ａｎ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｍｅｔｈｏｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｆｙ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ａｎｄ Ｐ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ ｂｙ ｕ￣
ｓｉｎｇ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ａｎｄ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ. Ａ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔꎬ Ｐｖｍ１Ｌ / Ｐｖｍ１Ｒꎬ ｗａｓ ｄｅｓｉｇｎｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ
ａ ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｌ ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ (ＩＴＳ１￣５.８Ｓ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ２) ｒｅｇｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒｉｂｏｓｏｍａｌ ＤＮＡ
ｇｅｎｅ ｏｆ Ｐ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ (ＪＮ８６１７７３) ａｎｄ Ｐ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ (ＪＮ８６１７７６) . Ｔｈｅ １８８ ｂｐ ＤＮＡ ｆｒａｇｍｅｎｔｓ ｗｅｒｅ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ
ｆｒｏｍ ３０ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｐ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ａｎｄ ３０ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ Ｐ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａꎬ ａｎｄ ｎｏ ｐｒｏｄｕｃｔ ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｉｓｏｌａｔｅｓ ｏｆ
１１ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇａｌ ｇｅｎｅｒａ. Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ ｏｎ ｓｙｍｐｔｏｍａｔｉｃ ａｎｄ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｉｎｆｅｃ￣
ｔｅｄ ｂａｙｂｅｒｒｙ ｐｌａｎｔｓ ａｔ ２１ ｄａｙｓ ａｆｔｅｒ ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎꎬ ａｎｄ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｌｉｍｉｔ ｗａｓ ０.６×１０５ ｃｏｐｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ
ＤＮＡ. Ｉｎ ａｄｄｉｔｉｏｎꎬ ｔｈｅ Ｐｖｍ１Ｌ / Ｐｖｍ１Ｒ ｐｒｉｍｅｒ ｓｅｔ ｗｅｒｅ ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ ａｄａｐｔｅｄ ｔｏ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲꎬ
ｗｈｉｃｈ ｈａｄ ａ ｌｉｍｉｔ １００ ｔｉｍｅｓ ｌｏｗｅｒ (０.６×１０３) ｔｈａｎ ｔｈａｔ ｂｙ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ａｎｄ ｗａｓ ａｂｌｅ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｔｈｅ ｐａｔｈｏ￣
ｇｅｎｓ ｉｎ ｓｙｍｐｔｏｍｌｅｓｓꎬ ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｌｙ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄꎬ ａｎｄ ｎａｔｕｒａｌｌｙ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｌａｎｔｓ. Ｔｈｅ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ａｎｄ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｒｅ￣
ａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ ｗｅｒｅ ｓｉｍｐｌｅꎬ ｆａｓｔꎬ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅꎬ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃꎬ ａｎｄ ｃａｎ ｂｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ Ｐｅｓｔａ￣
ｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｓｐｐ. ｆｒｏｍ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｂａｙｂｅｒｒｙ ｉｎ ｔｈｅ ｆｉｅｌｄ.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: Ｍｙｒｉｃａ ｒｕｂｒａꎻ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｔｗｉｇ ｂｌｉｇｈｔ ｄｉｓｅａｓｅꎻ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲꎻ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ
ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲꎻ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ
中图分类号: Ｓ４３２.４４　 　 　 　 　 文献标识码: Ａ　 　 　 　 　 文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１６)０１￣０００１￣１０

　
植物病理学报 ４６卷
　 　 杨梅(Ｍｙｒｉｃａ ｒｕｂｒａ) 是中国南方特有的珍稀
水果ꎬ果实甜酸适口ꎬ风味独特ꎬ截止 ２０１３ 年全国
栽培面积约 ３５万 ｈｍ２ꎬ年产量约 １２０ 万吨ꎬ已成为
长江以南各省市果品发展的支柱产业ꎮ ２００４ 年首
先在浙江省发现杨梅凋萎病ꎬ逐步在福建、江西、广
西、广东等地也有陆续发生[１]ꎮ 凋萎病是近年来
危害杨梅产业的主要病害ꎬ首先引起杨梅部分嫩梢
干枯ꎬ然后整株树的嫩梢干枯数量逐渐增多ꎬ一般
３~５年整株死亡[１]ꎮ 凋萎病发生后影响杨梅树体
对氮、钙等营养元素的吸收和传递[２ꎬ３]ꎬ根际菌根
活力降低[４]ꎮ 该病发生速度快、传染力强ꎬ如不及
时控制其传播ꎬ将严重威胁到杨梅产业的可持续发
展ꎮ 因此ꎬ亟需一种能够在发病初期进行早期快速
检测的技术ꎬ为采取及时有效的防控措施提供
指导ꎮ
杨梅凋萎病的病原菌为异色拟盘多毛孢
(Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ ) 和小孢拟盘多毛孢
(Ｐ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ) [１]ꎬ主要定殖于杨梅枝干ꎬ两种真
菌可以利用的营养范围广泛ꎬ２０℃ ~３０℃菌丝生长
良好[５ꎬ６]ꎮ 拟盘多毛孢病菌也可以侵染杨梅叶片
引起叶斑病[７ꎬ８]ꎮ 拟盘多毛孢属真菌属于子囊菌
门ꎬ主要以内生菌的形式存在ꎬ也是重要的植物病
原菌ꎬ引起多种植物病害ꎬ如茶轮斑病、枇杷灰斑
病、咖啡轮斑病、苹果叶斑病、番石榴果斑病、粗榧
枯死病等[９~１５]ꎮ 引起这类真菌致病的原因复杂、
机理未知ꎬ这类病害防治困难ꎬ所以有效的检疫检
测技术对控制该类病害的大面积传播及带病苗木
的盲目调运是非常重要的ꎮ
传统的病害诊断主要依据植株的明显病症和
病原菌形态ꎬ操作难度大ꎬ耗时耗力ꎬ因此快速准确
的检测技术逐步发展起来ꎬ其中常规 ＰＣＲ 和荧光
定量 ＰＣＲ操作简单ꎬ快速准确ꎬ可以为病害防治赢
得时机ꎬ在病原真菌研究以及病害检测中发挥了重
要的作用[１６~１８]ꎮ 在拟盘多毛孢真菌分类鉴定中ꎬ
常使用 ＩＴＳ１￣５.８Ｓ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ２ 序列绘制系统进化
树[１９~２１]ꎬ但是尚未用于拟盘多毛孢和植物组织内
拟盘多毛孢的快速准确检测ꎬ本研究旨在利用
ＩＴＳ１￣５.８Ｓ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ２序列设计特异引物ꎬ建立杨
梅凋萎病菌的常规 ＰＣＲ 和实时荧光定量 ＰＣＲ 的
检测方法ꎬ以备应用于杨梅凋萎病的植物检疫及
防控ꎮ
１　 材料与方法
１.１　 菌株的培养、繁殖与 ＤＮＡ提取
　 　 本实验室分离保存鉴定异色拟盘多毛孢菌株
ＸＪ２７和小孢拟盘多毛孢菌株 ＹＳ２６[１]ꎮ 菌株保存
在 ４％的 ＰＤＡ斜面上置于 ４℃冰箱内备用ꎬ试验前
转接于 ＰＤＡ平板上 ２５℃生长 ５ ｄ(１２ ｈ光暗交替)
后备用ꎮ 杨梅凋萎病菌检测引物的特异性及灵敏
性ꎬ其他一些真菌菌株做对照(表 １)ꎮ 所有菌株于
ＰＤＡ平板上 ２５℃培养 １周(１２ ｈ 光暗交替)备用ꎮ
将菌丝用刀片轻轻刮下ꎬ加入液氮研磨至粉末状ꎮ
利用 ＤＮＡ提取试剂盒[天根生物科技(北京)有限
公司]提取菌株总 ＤＮＡꎮ
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｆｕｎｇｉ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
Ｎｏ. Ｉｓｏｌａｔｅ ｎｕｍｂｅｒｓ Ｓｐｅｃｉｅｓ Ｈｏｓｔ ｐｌａｎｔ Ｇｅｏｇｒａｐｈｉｃ ｏｒｉｇｉｎ Ｉｓｏｌａｔｅｄ ｔｉｍｅ
１ ７ＬＨ１￣Ｓ￣３ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒｉｃａ ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
２ ７ＲＡ３￣Ｌ￣３ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
３ ７ＬＨ１￣７￣２ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
４ ９ＲＡ３￣６￣１ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
５ ９ＲＡ３￣３￣１ Ｐ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
６ ９ＲＡ３￣３￣３ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
７ ９ＲＡ３￣７￣３ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
８ １１ＲＡ１￣０￣１ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
９ １１ＲＡ１￣２￣２ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
１０ １１ＲＡ１￣３￣１ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
１１ １１ＲＡ１￣３￣２ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
１２ １１ＲＡ１￣Ｌ￣３ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
１３ １１ＲＡ１￣５￣１ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
１４ １１ＲＡ１￣Ｓ￣１ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
１５ １１ＲＡ１￣５￣２ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
１６ １１ＲＡ１￣７￣３ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
２

　
　 １期 任海英ꎬ等:利用常规 ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ检测杨梅凋萎病菌
Ｃｏｎｔｉｎｕｅｄ Ｔａｂｌｅ １
１７ １１ＲＡ２￣７￣５ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
１８ １１ＲＡ２￣Ｓ￣４ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
１９ １１ＲＡ２￣０￣５ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
２０ １１ＲＡ３￣４￣５ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
２１ １１ＲＡ３￣Ｌ￣４ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
２２ １１ＴＴ１￣Ｌ￣３ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
２３ １１ＴＴ１￣Ｌ￣１ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
２４ １１ＴＴ２￣Ｌ￣５ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
２５ １１ＴＴ３￣Ｓ￣３ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
２６ １１ＴＴ３￣４￣５ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
２７ １１ＬＨ２￣Ｌ￣１ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
２８ １１ＬＨＹＹ１￣１￣２ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
２９ １１ＬＨＹＹ１￣４￣３ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
３０ １１ＬＨＪ１￣Ｌ￣２ Ｐｅ. ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
３１ １１ＲＡ１￣４￣１ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
３２ １１ＲＡ２￣１￣４ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
３３ １１ＲＡ２￣５￣２ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
３４ １１ＲＡ３￣６￣４ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
３５ １１ＲＡ３￣７￣５ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
３６ １１ＲＡ３￣７￣１ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｒｕｉ′ａｎ ２０１２
３７ １１ＴＴ１￣７￣１ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
３８ １１ＴＴ１￣７￣３ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
３９ １１ＴＴ１￣８￣１ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
４０ １１ＴＴ１￣３￣４ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
４１ １１ＴＴ２￣６￣２ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
４２ １１ＴＴ２￣７￣２ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
４３ １１ＴＴ２￣１￣２ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
４４ １１ＴＴ２￣２￣２ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
４５ １１ＴＴ２￣２￣１ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
４６ １１ＴＴ３￣１￣１ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
４７ １１ＴＴ３￣５￣２ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
４８ １１ＴＴ３￣Ｌ￣２ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
４９ １１ＴＴ３￣５￣１ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
５０ １１ＴＴ３￣２￣３ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
５１ １１ＴＴ３￣８￣１ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
５２ １１ＴＴ３￣３￣４ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
５３ １１ＴＴ３￣０￣２ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｔｉａｎｔａｉ ２０１２
５４ １１ＬＨ１￣１￣２ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
５５ １１ＬＨ１￣３￣１ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
５６ １１ＬＨ１￣５￣２ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
５７ １１ＬＨ１￣５￣１ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
５８ １１ＬＨ２￣３￣１ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
５９ １１ＬＨ２￣２￣４ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
６０ １１ＬＨ３￣６￣２ Ｐｅ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
６１ ７８９∗ Ｐｅ. ｙｕｎｎａｎｅｉｓｉｓ Ｐｏｄｏｃａｒｐｕｓ ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌｕｓ Ｋｕｎｍｉｎｇ /
６２ ３９０∗ Ｐｅ. ｈａｎｇｚｈｏｕｅｎｓｉｓ Ｃａｍｅｌｌｉａ ｓｉｎｅｎｓｉｓ Ｈａｎｇｚｈｏｕ /
６３ ６８６∗ Ｐｅ. ｋａｒｓｔｅｎｉｉ Ｃａ. ｊａｐｏｎｉｃａ Ｈａｎｇｚｈｏｕ /
６４ ７６６∗ Ｐｅ. ｋｕｎｍｉｎｇｅｎｓｉｓ Ｐｏ. ｍａｃｒｏｐｈｙｌｌｕｓ Ｈａｎｇｚｈｏｕ /
６５ Ｍｍ１ Ｍｙｃｏｓｐｈａｅｒｅｌｌａ ｍｙｒｉｃａｅ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
６６ Ｖｃ１ Ｖａｌｓａ ｃｏｒｏｎａｔａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
６７ Ｐｍ１ Ｐｈｏｍｏｐｓｉｓ ｍｙｒｉｃｉｎａ Ｍｙｒ. ｒｕｂｒａ Ｌｉｎｈａｉ ２０１２
６８ ＦａＪＹ Ｓ１３ ᶊ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ａｒｄｅ Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍＬｉｎｎ / /
６９ ＰＨ￣１Ｆｇ ᶊ Ｆｕ. ｇｒａｍｉｎｅａｒｕｍ Ｔ. ａｅｓｔｉｖｕｍＬｉｎｎ / /
７０ ＢＣ１ ※ Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ Ｆｒａｇａｒｉａ ａｎａｎａｓｓａ / /
７１ ＣＧ１ ※ Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ Ｆｒ. ａｎａｎａｓｓａ /
∗: Ｔｈｅ ｇｉｆｔ ｏｆ Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｗｅｉ Ｊｉｇｕａｎｇꎬ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｇｕａｎｇｘｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ. ᶊ: Ｔｈｅ ｇｉｆｔ ｏｆ Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｍａ Ｚｈｏｎｇｈｕａꎬ Ｃｏｌ￣
ｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙꎬ Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ. ※: Ｔｈｅ ｇｉｆｔ ｏｆ Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ Ｚｈａｎｇ Ｃｈｕａｎｑｉｎｇꎬ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅꎬ
Ｚｈｅｊｉａｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ ａｎｄ Ｆｏｒｅｓｔｒｙ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ.
３

　
植物病理学报 ４６卷
１.２　 人工接种及自然发病的杨梅样品制备及检测
　 　 病原菌使用异色拟盘多毛孢菌株 ＸＪ２７ 和小
孢拟盘多毛孢菌株 ＹＳ２６ꎬ接种东魁杨梅 １ 年生容
器苗ꎮ 接种位置选择杨梅幼苗距离土壤以上 ５ ｃｍ
处的茎干基部ꎬ用解剖刀片切开一个 １.５ ~ ２.０ ｃｍ
的小口ꎬ把培养 ５ ｄ的 ＰＤＡ 菌块(１ ~ ２ ｍｍ２)菌丝
朝向杨梅茎干伤口处ꎬ脱脂棉吸灭菌水保湿ꎬ保鲜
膜缠绕保湿 ３ ｄꎬ２３℃ ~２５℃下生长ꎬ分别在接种后
７、１４、２１和 ２８ ｄ取样ꎬ取样位置距离接种点位置:０
~１０、１０ ~ ２０、２０ ~ ３０ ｃｍꎮ 每部分样品平均分成 ２
份ꎬ一份用于组织分离真菌菌株ꎬ统计分离到的菌
落数目ꎮ 一份用于提取 ＤＮＡꎬ作为模板进行常规
ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ检测ꎮ 每处理设 ３ 次重
复ꎬ每个菌株接种 ３ 棵杨梅幼苗ꎬ不接种的幼苗作
为对照ꎮ 杨梅样品的基因组 ＤＮＡ提取采用 ＣＴＡＢ
方法[２２]ꎮ 下同ꎮ
分别从浙江省瑞安、仙居、天台选择发生凋萎
病的杨梅植株ꎬ采集有病症枝条和无病症枝条ꎬ浙
江省诸暨的健康杨梅树的枝条作为空白对照ꎬ带回
实验室后提取总 ＤＮＡꎬ按照常规 ＰＣＲ 和实时荧光
定量 ＰＣＲ体系进行检测ꎮ 在所有 ＰＣＲ 中ꎬ每样品
重复 ３次ꎮ
１.３　 特异引物设计
　 　 异色拟盘多毛孢菌株 ＸＪ２７ 的 ＩＴＳ 序列
(ＪＮ８６１７７３)和小孢拟盘多毛孢菌株 ＹＳ２６ 的 ＩＴＳ
序列(ＪＮ８６１７７６)用 ＤＮＡ Ｓｔａｒ 做 ａｌｉｇｎｉｎｇꎬＣＬＵＳＴ￣
ＡＬＷ (ｈｔｔｐ: / / ｃｌｕｓｔａｌｗ. ｄｄｂｊ. ｎｉｇ. ａｃ. ｊｐ / ｔｏｐ￣ｅ. ｈｔｍｌ)
进行序列的比较ꎬ以其相同区域使用 Ｐｒｉｍｅｒ ３ ｓｏｆｔ￣
ｗａｒｅ(ｈｔｔｐ: / / ｐｒｉｍｅｒ３.ｕｔ.ｅｅ / )在线设计两个种的通
用引 物 ( Ｐｖｍ１Ｌ / Ｐｖｍ１Ｒ )ꎬ Ｐｖｍ１Ｌ: ５′￣ ＧＡＡＡ￣
ＴＧＡＣＧＣＴＣＧＡＡＣＡＧＧＣ ￣３′ꎬ Ｐｖｍ１Ｒ: ５′￣
ＴＧＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＣＧＡＡＡＴＧＣ ￣３′ꎬ ＰＣＲ 产物预
期大小 １８８ ｂｐꎮ ＮＣＢＩ ＧｅｎＢａｎｋ ｄａｔａｂａｓｅ (ｈｔｔｐ: / /
ｗｗｗ.ｎｃｂｉ. ｎｌｍ. ｎｉｈ. ｇｏ ｖ / ＢＬＡＳＴ)内使用 ＢＬＡＳＴｎ
验证引物的特异性ꎮ
１.４　 常规 ＰＣＲ
　 　 利用 １.１和 １.２提取的真菌或者植物的基因组
ＤＮＡ为模板ꎬＰｖｍ１Ｌ / Ｐｖｍ１Ｒ 为引物ꎬ２５ μＬ 反应
体系ꎬ模板 ＤＮＡ ５０ ~ １００ ｎｇꎬ包括 １０ ×ｂｕｆｆｅｒ ２. ５
μＬꎬ２.５ ｍｍｏｌ􀅰Ｌ￣１ ｄＮＴＰｓ １ μＬꎬ１０ μｍｏｌ􀅰Ｌ￣１的正
反引物各 １ μＬꎬＴａｑ酶 ０.５ μＬꎬ加无菌水至 ２５ μＬꎮ
ＰＣＲ程序:９５℃ ５ ｍｉｎꎻ９５℃ ３０ ｓꎬ５５℃ ３０ ｓꎬ７２℃
３０ ｓꎬ３０ 个循环ꎻ７２℃ １０ｍｉｎꎮ ＰＣＲ 产物分别用
ＤＮＡ片段纯化试剂盒(ＴａＫａＲａꎬ大连)和 ＤＮＡ 片
段回收试剂盒(ＴａＫａＲａꎬ大连)纯化和回收ꎬ然后连
接至 ｐＭＤ􀅹１８￣Ｔ 载体上(ＴａＫａＲａꎬ大连)ꎬ送生工
生物工程(上海)股份有限公司测序ꎬ检测序列的
正确性ꎮ
１.５　 实时荧光定量 ＰＣＲ及标准曲线的制作
　 　 梯度稀释 １.４ 制备的阳性质粒备用ꎮ 多次预
备实验后选择 ０.１ ｎｇ􀅰μＬ￣１(相当于 ０.６×１０８拷贝
数)的标准品浓度进行 １０倍梯度稀释ꎬ共稀释 ５个
梯度(０.１×１０￣１ ｎｇ􀅰μＬ￣１ꎬ０.１×１０￣２ ｎｇ􀅰μＬ￣１ꎬ０.１×
１０￣３ ｎｇ􀅰μＬ￣１ꎬ０. １ ×１０￣４ ｎｇ􀅰μＬ￣１ꎬ０. １ ×１０￣５ ｎｇ􀅰
μＬ￣１)的溶液作为模板ꎬ参照 ＴａＫａＲａ ＳＹＢＲ Ｐｒｅｍｉｘ
ＤｉｍｅｒＥｒａｓｅｒ ＴＭ(Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅꎬ货号 ＲＲ０９１Ａ)
的荧光定量试剂盒选择 ２０ μＬ 的体系说明进行操
作ꎬ在 ＡＢＩ ＰＲＩＳＭ ７５００ 的荧光定量 ＰＣＲ仪上进行
扩增ꎬ重复 ３次ꎬ扩增标准品ꎬ以标准品拷贝数的 ｌｇ
值为纵坐标 ( ｙ)ꎬ以扩增得到的 Ｃｔ 值为横坐标
(ｘ)ꎬ做出标准曲线ꎬ得到线性和可靠的标准曲线
(Ｒ２>０.９９)ꎮ
将基因组 ＤＮＡ 模板浓度稀释到标准曲线范
围内(１００~２００ ｎｇ􀅰μＬ￣１左右)ꎬ按照 Ｔａｋａｒａ ＳＹＢＲ
Ｐｒｅｍｉｘ ＤｉｍｅｒＥｒａｓｅｒＴＭ ( Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｒｅａｌ Ｔｉｍｅꎬ 货号
ＲＲ０９１Ａ)的荧光定量试剂盒选择 ２０ μＬ 的体系说
明进行操作ꎮ Ｒｅａｌ ｔｉｍｅ ＰＣＲ程序:９５℃ ３０ ｓꎻ ９５℃
５ ｓꎬ５５℃ ３０ ｓꎬ７２℃ ３４ ｓꎬ４０ 个循环ꎮ 实时荧光定
量 ＰＣＲ的每个样品重复 ３次ꎮ 得出每个样品的 Ｃｔ
值ꎬ然后根据标准曲线计算出目标片段的拷贝数ꎮ
１.６　 引物的灵敏性、特异性及抗干扰性
　 　 利用建立标准曲线的质粒 ＤＮＡ 梯度稀释样
品作为模板ꎬ进行常规 ＰＣＲ 和实时荧光定量 ＰＣＲ
检测ꎬ以确定两种技术对特定目标片段的检测灵
敏度ꎮ
利用表 １ 不同地点的异色拟盘多毛孢和小孢
拟盘多毛孢各 ３０ 个菌株、其他 ４ 种拟盘多毛孢、３
个杨梅寄主上分离得到的真菌菌株、２ 个小麦和 ２
个草莓上分离的真菌菌株的菌丝 ＤＮＡ 作为模板ꎬ
４

　
　 １期 任海英ꎬ等:利用常规 ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ检测杨梅凋萎病菌
进行常规 ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ 检测ꎬ同时以
ｄｄＨ２Ｏ作为对照ꎬ以确定常规 ＰＣＲ 和实时荧光定
量 ＰＣＲ对特定菌种的检测特异性ꎮ
在拟盘多毛孢菌株菌丝 ＤＮＡ 内随机加入 １ / ５
体积的其他对照菌株菌丝 ＤＮＡꎬ进行常规 ＰＣＲ 和
实时荧光定量 ＰＣＲ 检测ꎬ同时以 ｄｄＨ２Ｏ 作为对
照ꎬ以确定常规 ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ 对特定
菌种检测的抗干扰性ꎮ
２　 结果与分析
２.１　 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ 实时荧光定量 ＰＣＲ 检测体系
的建立
　 　 对 ５个稀释梯度进行实时荧光定量 ＰＣＲꎬ结果
表明ꎬ５个梯度浓度的扩增效率良好ꎬ扩增曲线是
从最大基线之后开始ꎬ扩增曲线平滑有序ꎬ标准品
达到了实验预期要求(图 １￣Ａ)ꎮ ５ 个梯度浓度的
标准品进行荧光定量 ＰＣＲ扩增过程后得出的溶解
曲线图ꎬ只有单一峰且峰值出现在 Ｔｍ 值上ꎬ说明
引物是特异性扩增的ꎬ没有引物二聚体产生ꎬ结果
可用(图 １￣Ｂ)ꎮ 依据初始模板拷贝数的对数( ｌｇ)
与 Ｃｔ循环数的关系建立标准曲线(图 １￣Ｃ)ꎬ由标
准曲线得出克隆质粒 ＤＮＡ 拷贝数的对数值与 Ｃｔ
值的线性关系为:ｙ ＝ ￣０.３０５ ８ｘ＋１１.９１２ꎬ相关系数
Ｒ２ ＝０.９９４ ７ꎬ因此标准曲线可以作为后续检测样品
的可靠定量参考ꎮ 该荧光定量 ＰＣＲ 的检测体系ꎬ
检测 ＤＮＡ的灵敏度达到 ０.１×１０￣５ ｎｇ􀅰μＬ￣１(０.６×
１０３拷贝数)ꎮ
综合上述扩增曲线、溶解曲线和标准曲线数
据ꎬ可以确定本文的实时荧光定量 ＰＣＲ 的引物、扩
增体系及程序科学合理ꎬ结果可靠ꎮ
２.２　 常规 ＰＣＲ检测灵敏度
　 　 用克隆质粒 ＤＮＡ 的 １０ 倍梯度稀释的 ５ 个样
品分别作为模板进行常规 ＰＣＲꎬ结果表明ꎬ浓度为
０.１×１０￣１ ｎｇ􀅰μＬ￣１和 ０.１×１０￣２ ｎｇ􀅰μＬ￣１的能扩增出
明显条带ꎬ浓度为 ０.１×１０￣３ ｎｇ􀅰μＬ￣１的能扩增出非
常模糊的条带ꎬ浓度为 ０.１×１０￣４ ｎｇ􀅰μＬ￣１和 ０.１×
１０￣５ ｎｇ􀅰μＬ￣１的没有条带扩增出来(图 ２)ꎮ 表明
常规 ＰＣＲ检测克隆质粒 ＤＮＡ的扩增灵敏度为 ０.１
×１０￣３ ｎｇ􀅰μＬ￣１(０.６×１０５拷贝数)ꎮ
Ｆｉｇ. １ 　 Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ｏｆ ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅｓ ｂｙ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ
Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｓｐｐ. ｃａｕｓｉｎｇ ｔｗｉｇ
ｂｌｉｇｈｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｂａｙｂｅｒｒｙ
Ａ: Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅꎻＢ: Ｍｅｌｔ ｃｕｒｖｅ ａｎａｌｙｓｉｓꎻ
Ｃ: Ｓｔａｎｄａｒｄ ｃｕｒｖｅ.
５

　
植物病理学报 ４６卷
Ｆｉｇ. ２ 　 Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ
ＰＣＲ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｐｒｉｍｅｒ ｐａｉｒ Ｐｖｍ１Ｌ /
Ｐｖｍ１Ｒ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ
Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｓｐｐ. ｃａｕｓｉｎｇ ｔｗｉｇ
ｂｌｉｇｈｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｆ ｂａｙｂｅｒｒｙ ｏｎ ｔｈｅ
ｐｌａｓｍｉｄ
Ｍ:ＤＮＡ ｍａｒｋｅｒ ＤＬ２０００ꎻ１: ０.１× １０￣１ ｎｇ􀅰μＬ￣１ꎻ ２: ０.１ ×
１０￣２ ｎｇ􀅰μＬ￣２ꎻ ３: ０. １ × １０￣３ ｎｇ􀅰μＬ￣１ꎻ ４:０. １× １０￣４ ｎｇ􀅰
μＬ￣１ꎻ ５: ０.１ ×１０￣５ ｎｇ􀅰μＬ￣１ .
２.３　 常规 ＰＣＲ与实时荧光定量 ＰＣＲ 检测凋萎病
菌菌丝 ＤＮＡ的特异性
　 　 使用特异引物和常规 ＰＣＲ体系(菌丝 ＤＮＡ浓
度 ２~４ ｎｇ􀅰μＬ￣１)都能扩增出特异性阳性条带ꎬ异
色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢结果一致(图 ３)ꎬ
在凋萎病菌 ＤＮＡ内按 １ / ５体积混合入杂菌的 ＤＮＡ
时仍能扩增出相同的特异条带ꎮ 而针对非凋萎病菌
的 １１个真菌菌株却没有任何特异条带扩增出来ꎮ
这说明常规 ＰＣＲ 体系可以有效检测分离纯化后的
凋萎病菌基因组 ＤＮＡꎮ
在凋萎病菌菌丝 ＤＮＡ浓度 ２~３ ｎｇ􀅰μＬ￣１时实
时荧光定量 ＰＣＲ大约 １８个循环就可以检测到有效
荧光ꎬ检测下限是 ２~３ ｆｇ􀅰μＬ￣１ꎬ非目标菌株 Ｐｙ７８９
即使 ＤＮＡ浓度达到 ３００ ｎｇ􀅰μＬ￣１也检测不到有效
荧光(表 ２)ꎮ 针对其他 ６０ 个凋萎病菌菌株的菌丝
ＤＮＡ、非凋萎病菌的 １１个真菌菌株以及按 １ / ５体积
混合入杂菌的 ＤＮＡ进行实时荧光定量 ＰＣＲ进行检
测ꎬ结果与 Ｐｙ７８９相似ꎮ 这说明实时荧光定量 ＰＣＲ
体系可以有效检测杨梅组织分离培养后的真菌
ＤＮＡꎬ与常规 ＰＣＲ 相比检测下限更低ꎬ而且不需要
琼脂糖电泳后处理ꎬ检测速度更快ꎮ
Ｆｉｇ. ３　 Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｍｙｃｅｌｉａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｓｐｐ.
Ｍ: ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｓｔａｎｄａｒｄ ＤＬ２０００ꎻ Ｌａｎｅ １ꎬ ３ꎬ ５ꎬ ７ꎬ ９ꎬ １１ꎬ １３ꎬ １５ꎬ １７ꎬ １９ꎬ ２１ꎬ ２３ꎬ ２５ꎬ ２７ꎬ ２９ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ
Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｖｅｒｓｉｃｏｌｏｒꎻ Ｌａｎｅ ３２ꎬ ３４ꎬ ３６ꎬ ３８ꎬ ４０ꎬ ４２ꎬ ４４ꎬ ４６ꎬ ４８ꎬ ５０ꎬ ５２ꎬ ５４ꎬ ５６ꎬ ６０ ｗｅｒｅ ｔｈｅ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｐ. ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ.
６

　
　 １期 任海英ꎬ等:利用常规 ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ检测杨梅凋萎病菌
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ＰＣＲ ｔｏ ｄｅｔｅｃｔ ｍｙｃｅｌｉａｌ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｏｆ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｓｐｐ.
ＸＪ２７ ｍｙｃｅｌｉａｌ ＤＮＡ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ / ｆｇ􀅰μＬ￣１
Ｃｔ
ＹＳ２６ ｍｙｃｅｌｉａｌ ＤＮＡ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ / ｆｇ􀅰μＬ￣１
Ｃｔ
Ｐｙ７８９ ｍｙｃｅｌｉａｌ ＤＮＡ
Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ / ｆｇ􀅰μＬ￣１
Ｃｔ
２０６.７７×１０６ １２.７２ ３１５.１６×１０６ １２.３２ ３００.１６×１０６ ４０
２０.６７７×１０６ １５.２４ ３１.５１６×１０６ １５.０５ ３０.０１６×１０６ ４０
２.０６７７×１０６ １８.３１ ３.１５１６×１０６ １８.０９ ３.００１６×１０６ ４０
２０６.７７×１０３ ２１.６８ ３１５.１６×１０３ ２１.１２ ３００.１６×１０３ ４０
２０.６７７×１０３ ２４.９３ ３１.５１６×１０３ ２４.０５ ３０.０１６×１０３ ４０
２.０６７７×１０３ ２８.５６ ３.１５１５×１０３ ２７.６８ ３.００１６×１０３ ４０
２０６.７７ ３１.５０ ３１５.１６ ３０.１０ ３００.１６ ４０
２０.６７７ ３４.６５ ３１.５１６ ３３.００ ３０.０１６ ４０
２.０６７７ ３７.８４ ３.１５１６ ３６.１２ ３.００１６ ４０
０.２０６７７ ４０.００ ０.３１５１６ ３９.２３ ０.３００１６ ４０
　
２.４　 常规 ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ 检测人工接
种杨梅组织中的凋萎病菌
　 　 常规 ＰＣＲ在杨梅接种后 ２１ ｄ 距离接种点 ０ ~
２０ ｃｍ 的位置能检测出凋萎病菌ꎬＤＮＡ 拷贝数在
２.１１×１０７􀅰μＬ￣１ ~ １.７５×１０８􀅰μＬ￣１之间ꎬ但是在接
种 ７~１４ ｄ 后无法检出(表 ３)ꎮ 这说明病菌 ＤＮＡ
拷贝数大于 １０７􀅰μＬ￣１时ꎬ常规 ＰＣＲ才能检测出植
物组织中的凋萎病菌ꎮ
接种病菌 ７、 １４ 和 ２１ ｄ 后ꎬ使用 Ｐｖｍ１Ｌ /
Ｐｖｍ１Ｒ进行荧光定量 ＰＣＲ只需要 ２１ ~ ２５、１８ ~ ２０、
１２~１８个循环就可以检测出有效荧光ꎬ凋萎病菌的
ＤＮＡ拷贝数分别是 ０.１８ ~ ３.０９×１０５􀅰μＬ￣１、０.６３ ~
２.５６×１０５􀅰μＬ￣１、０.０２６~ １.７５×１０８􀅰μＬ￣１ꎬ对照样品
没有检测到有效荧光 (表 ３)ꎮ 这说明 Ｐｖｍ１Ｌ /
Ｐｖｍ１Ｒ引物可以用来检测携带有凋萎病菌的杨梅
苗木ꎬ做到有效检疫带菌苗木ꎮ
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｂａｙｂｅｒｒｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ａｎｄ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
Ｄａｙｓ ｐｏｓｔ￣ｉｎｏｃｕｌａｔｉｏｎ
Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ
Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｅｓ
Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ Ｃｔ
Ｍｙｃｅｌｉａｌ ＤＮＡ
ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ
７
ＣＫ ５ ｎｅｇａｔｉｖｅ ３８ /
０￣１０ １０ ｎｅｇａｔｉｖｅ ２１ ３.０９×１０５
１０￣２０ ９ ｎｅｇａｔｉｖｅ ２２ １.５３×１０５
２０￣３０ ８ ｎｅｇａｔｉｖｅ ２５ ０.１８×１０５
１４
ＣＫ ６ ｎｅｇａｔｉｖｅ ３９ /
０￣１０ ２０ ｎｅｇａｔｉｖｅ １８ ２.５６×１０６
１０￣２０ １５ ｎｅｇａｔｉｖｅ １９ １.２６×１０６
２０￣３０ １４ ｎｅｇａｔｉｖｅ ２０ ６.２５×１０５
２１
ＣＫ ４ ｎｅｇａｔｉｖｅ ４０ /
０￣１０ ３０ ｐｏｓｉｔｉｖｅ １２ １.７５×１０８
１０￣２０ ２５ ｐｏｓｉｔｉｖｅ １５ ２.１１×１０７
２０￣３０ ２０ ｎｅｇａｔｉｖｅ １８ ２.５６×１０６
　
７

　
植物病理学报 ４６卷
２.５　 常规 ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ 检测田间发
病杨梅样品
　 　 常规 ＰＣＲ能有效检测出有病症杨梅枝条内病
菌ꎬ但是未检测出无病症枝条内病菌(表 ４)ꎮ 荧光
定量 ＰＣＲ能有效检测出有病症和无病症杨梅枝条
内病菌ꎬ１２~１５个循环就能检测到有病症枝条样品
的有效荧光ꎬ凋萎病菌的 ＤＮＡ 拷贝数在 ２.１×１０７
􀅰μＬ￣１ ~１.８×１０８􀅰μＬ￣１ꎬ１８~ ２５ 个循环能检测出无
病症枝条的有效荧光ꎬ凋萎病菌的 ＤＮＡ 拷贝数在
０.１８×１０５􀅰μＬ￣１ ~ ２.５６×１０６􀅰μＬ￣１(表 ４)ꎮ 这说明
荧光定量 ＰＣＲ 的检测灵敏度大约是常规 ＰＣＲ 的
１００倍ꎮ
３　 讨 论
杨梅凋萎病危害重、传播快ꎬ有效检疫检测病
菌及带菌苗木是防控的重要措施之一ꎮ 本研究开
发的常规 ＰＣＲ 和实时荧光定量 ＰＣＲ 检测技术特
异性强、速度快、灵敏度高ꎬ有一定的应用价值ꎮ 与
现有的病菌检测常规 ＰＣＲ 技术相比ꎬ该常规 ＰＣＲ
检测克隆质粒 ＤＮＡ的扩增灵敏度为 ０.１×１０￣２ ｎｇ􀅰
μＬ￣１(１ ｐｇ􀅰μＬ￣１)ꎬ比百合炭疽病病原菌检测灵敏
度 ５０ ｐｇ[２３]略高ꎬ与常规 ＰＣＲ 检测香蕉软腐细菌
(ＸＪ８￣３ ￣３)靶片段克隆质粒 ＤＮＡ 的灵敏度 ２.４ ×
１０￣３ ｎｇ􀅰μＬ￣１ [２４]和巢式 ＰＣＲ 检测葡萄座腔菌至 １
ｐｇ的基因组 ＤＮＡ[２５]相似ꎬ低于荧光 ＬＡＭＰ 方法
检测植物组织中疫霉属病菌限值 ２００~ ５２７ ｆｇ 病菌
ＤＮＡ 的量[２６ꎬ２７]ꎮ 实时荧光定量 ＰＣＲ 是在常规
ＰＣＲ反应体系中加入一条荧光标记探针或者染
料ꎬ通过荧光信号积累实现对 ＰＣＲ 反应的实时监
控ꎬ目前已应用于医学及植物病理学的病原诊断ꎮ
在植物病理学上可以用来检测细菌[２４ꎬ ２８ꎬ ２９]、真
菌[１６ꎬ １７]、病毒[３０]等ꎮ 本研究首次尝试从发病植株
中检测凋萎病菌ꎬ建立了利用 ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ 染料法
检测凋萎病菌的实时荧光定量 ＰＣＲ 体系ꎮ 该荧光
定量 ＰＣＲ的检测体系ꎬ检测克隆质粒 ＤＮＡ的灵敏
度达到 ０.１×１０￣５ ｎｇ􀅰μＬ￣１ꎬ比香蕉软腐细菌(ＸＪ８￣
３￣３)靶片段克隆质粒 ＤＮＡ 的检测灵敏度 ２. ４ ×
１０￣５ ｎｇ􀅰μＬ￣１ [２４]略高ꎻ检测到凋萎病菌菌丝 ＤＮＡ
的下限是 ２ ~ ３ ｆｇ􀅰μＬ￣１ꎬ大大高于荧光定量 ＰＣＲ
能够检测出 １００ ｆｇ􀅰μＬ￣１的 Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｓｙｒｉｎｇａｅ
的目标 ＤＮＡ[２９]ꎬ甚至高于利用核糖体 ＤＮＡ( ｒＤ￣
ＮＡ)基因间隔区设计 Ｔａｑｍａｎ 探针进行荧光定量
ＰＣＲ检测 Ｆ. ｖｉｒｇｕｌｉｆｏｒｍｅ基因组 ＤＮＡ的检出下限
(１００ ｆｇ) [１６]ꎮ
ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ染料法特异性与 ＴａｑＭａｎ 探针相
比略差ꎬ并且不同试剂盒产品也存在一定差异ꎬ从而
使阴性对照能检测到较弱的非 Ｓ 型荧光信号ꎬ但可
根据阴性对照的 Ｃｔ值确定检测的下限值ꎬ从而确保
了检测的相对准确性[３１]ꎮ 在本试验中ꎬ阴性对照在
Ｃｔ值为 ４０时才开始出现非 Ｓ 型扩增信号ꎬ根据阴
性样品的 Ｃｔ值确定实时荧光 ＰＣＲ检测发病植株中
凋萎病菌的 ＤＮＡ的下限 Ｃｔ值应为 ３９ꎮ
本研究中建立的常规 ＰＣＲ体系适于检测分离
纯化的凋萎病菌ꎬＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ 实时荧光定量 ＰＣＲ
体系适用于检测杨梅组织内的凋萎病菌ꎬ两个技术
体系都具有成本相对低廉ꎬ检测速度快ꎬ无需后续
处理等诸多优点ꎬ可用于病菌诊断、国内外进境检
疫和国内区域间杨梅种质和种苗的检疫ꎮ
Ｔａｂｌｅ ４　 Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｉｓｅａｓｅｄ ｂａｙｂｅｒｒｙ ｉｎ ｆｉｅｌｄ ｂｙ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ｔｉｓｓｕｅ ｉｓｏｌａｔｉｏｎ
ｍｅｔｈｏｄ ｗｉｔｈ ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ ａｎｄ ｒｅａｌ￣ｔｉｍｅ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ＰＣＲ
Ｄｉｓｅａｓｅｄ ｓａｍｐｌｅｓ Ｄｉｓｅａｓｅｄ
Ｒｅｌａｔｉｖｅ ｎｕｍｂｅｒ
ｏｆ ｃｏｌｏｎｉｅｓ
Ｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌ ＰＣＲ Ｃｔ
Ｈｙｐｈａｅ ＤＮＡ
ｃｏｐｙ ｎｕｍｂｅｒｓ
Ｚｈｕｊｉ(Ｈｅａｌｔｙ) Ｎｏ ０ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ４０ /
Ｒｕｉ′ａｎ(ｄｉｓｅａｓｅｄ) Ｖｉｓｉｂｌｅ ４ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ １５ ２.１×１０７
Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ ２ Ｎｅｇａｔｉｖｅ １８ ２.５６×１０６
Ｔｉａｎｔａｉ(ｄｉｓｅａｓｅｄ) Ｖｉｓｉｂｌｅ １ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ １２ １.８×１０８
Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ ２ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ２５ ０.１８×１０５
Ｌｉｎｈａｉ(ｄｉｓｅａｓｅｄ) Ｖｉｓｉｂｌｅ ６ Ｐｏｓｉｔｉｖｅ １２ １.８×１０８
Ｉｎｖｉｓｉｂｌｅ ２ Ｎｅｇａｔｉｖｅ ２０ ６.２５×１０５
８

　
　 １期 任海英ꎬ等:利用常规 ＰＣＲ和实时荧光定量 ＰＣＲ检测杨梅凋萎病菌
参考文献
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ｂｅｒｒｙ ｔｗｉｇ ｂｌｉｇｈｔ ｄｉｓｅａｓｅ ｏｎ ｃａｌｃｉｕｍ ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｄｉｓ￣
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ｆａｃｔｏｒｓ ｏｎ ｍｙｃｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ ｓｐｏｒｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉ￣
ｏｐｓｉｓ ｍｉｃｒｏｓｐｏｒａ ｓｔｒａｉｎｓꎬ ｔｈｅ ａｇｅｎｔ ｏｆ ｂａｙｂｅｒｒｙ ｔｗｉｇ
ｂｌｉｇｈｔ ｉｎ ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｈｉｎａ [ Ｊ ] . Ａｓｉａ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓꎬ
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ｔｗｉｇ ｂｌｉｇｈｔ ｉｎ ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｃｈｉｎａ ( ｉｎ Ｃｈｉｎｅｓｅ) [ Ｊ] . Ａｃｔａ
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ｂｌｕｅｂｅｒｒｙ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｐｅｓｔａｌｏｔｉｏｐｓｉｓ ｐｈｏｔｉｎｉａｅ ( ｉｎ Ｃｈｉ￣
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植物病理学报 ４６卷
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ｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｎ ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ ａｓ ａ ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｍａｒｋｅｒ ｉｎ
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ｃｕｒｌ ｓａｒｄｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ ｉｎ ｔｏｍａｔｏ ｐｌａｎｔｓ ａｎｄ ｉｎ ｉｔｓ ｉｎｓｅｃｔ
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ａｎｄ ｙｉｅｌｄ ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｄｉｃｋｅｙａ ｓｐｐ. ｓｔｒａｉｎｓ ｉｓｏ￣
ｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｐｏｔａｔｏ ａｎｄ ｒｉｖｅｒ ｗａｔｅｒ ｉｎ Ｆｉｎｌａｎｄ [Ｊ] . Ｅｕｒｏ￣
ｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐａｔｈｏｌｏｇｙꎬ２０１０ꎬ １２６: ２４９￣２６２.
责任编辑:曾晓葳
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