全 文 ：植物病理学报
ＡＣＴＡ ＰＨＹＴＯＰＡＴＨＯＬＯＧＩＣＡ ＳＩＮＩＣＡ ４４(６): ７０５￣７０８(２０１４)
收稿日期: ２０１４￣０２￣２７ꎻ 修回日期: ２０１４￣０８￣１２
基金项目: 国家自然科学基金项目(３１２７００６７)
通讯作者: 黄 琼ꎬ教授ꎬ主要从事植物病理学研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ｈｕａｎｇｑｉｏｎｇ８８ｈｓ＠ｙａｈｏｏ.ｃｏｍ.ｃｎ
李永川ꎬ高级农艺师ꎬ主要从事植物保护研究ꎻ Ｅ￣ｍａｉｌ:ＫｍｙＯｎｇＣｈｕａｎ＠１６３.ｃｏｍꎮ
ｄｏｉ:１０.１３９２６ / ｊ.ｃｎｋｉ.ａｐｐｓ.２０１４.０６.０１９
研究简报
采后胡萝卜腐烂病病原菌鉴定
李 婕１ꎬ 隋 伟１ꎬ 高锦梅１ꎬ 韩永花１ꎬ 李 晓１ꎬ 李永川２∗ꎬ 黄 琼１∗
( １云南农业大学植物保护学院 农业生物多样性应用技术国家工程研究中心ꎬ 昆明 ６５０２０１ꎻ２云南省植保质检站ꎬ 昆明 ６５００３４)
Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｃａｕｓｉｎｇ ｐｏｓｔ ｈａｒｖｅｓｔ ｄｅｃａｙ ｉｎ ｃａｒｒｏｔ (Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ)
ＬＩ Ｊｉｅ １ ꎬ ＳＵＩ Ｗｅｉ１ꎬ ＧＡＯ Ｊｉｎ￣ｍｅｉ１ꎬ ＨＡＮ Ｙｏｎｇ￣ｈｕａ１ꎬ ＬＩ Ｘｉａｏ１ꎬ ＬＩ Ｙｏｎｇ￣ｃｈｕａｎ２ꎬ ＨＵＡＮＧ Ｑｉｏｎｇ １ (１Ｃｏｌｌｅｇｅ
ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ꎬ Ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｙｕｎｎａｎ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５０２０１ꎬＣｈｉｎａꎻ
２Ｙｕｎｎａｎ Ｐｌａｎｔ Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ Ｑｕａｒａｎｔｉｎｅ Ｓｔａｔｉｏｎꎬ Ｋｕｎｍｉｎｇ ６５００３４ꎬＣｈｉｎａ)
Ａｂｓｔｒａｃｔ: Ｉｎ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１２ꎬ ｉｎｆｅｃｔｅｄ ｐｏｓｔ ｈａｒｖｅｓｔ ｃａｒｒｏｔ ｒｏｏｔ ｗｅｒｅ ｆｏｕｎｄ ｗｉｔｈ ｄｅｃａｙ ｓｙｍｐｔｏｍ ｉｎ ｓｅｖｅｒａｌ ｆａｒｍｅｒ
ｍａｒｋｅｔｓ ａｒｏｕｎｄ Ｋｕｎｍｉｎｇ ｃｉｔｙ ｏｆ Ｙｕｎｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅꎬ Ｃｈｉｎａ. Ｔｈｅ ｓｙｍｐｔｏｍ ｗａｓ ｇｒｅｙ ｗｈｉｔｅ ｉｎｉｔｉａｌｌｙꎬ ｔｈｅｎ ｂｅｃａｍｅ
ｂｒｏｗｎ ｔｏ ｂｌａｃｋ ｗｉｔｈ ｖｉｓｉｂｌｅ ｐｅｒｉｔｈｅｃｉａ. Ａｃｃｏｒｄｉｎｇ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙꎬ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｏｆ ｔｈｅ ｒＤＮＡ ｉｎｔｅｒｎａｌ
ｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄ ｓｐａｃｅｒ ｒｅｇｉｏｎ ( ＩＴＳＩ￣５.８Ｓ￣ＩＴＳ２ )ꎬ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｗａｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄ ａｓ Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｆｉｍｂｒｉａｔａ. Ｔｈｅ ｄｉｓｅａｓｅ
ｈａｓ ｂｅｅｎ ｒｅｐｏｒｔｅｄ ｏｎｌｙ ｉｎ Ｂｒａｚｉｌ ｂｅｆｏｒｅꎬ ｔｈｉｓ ｉｓ ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ ｒｅｐｏｒｔ ｏｎ Ｃ. ｆｉｍｂｒｉａｔａ ａｓ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｏｆ ｃａｒｒｏｔ(Ｄａｕｃｕｓ
ｃａｒｏｔａ) ｄｅｃａｙ ｐｏｓｔ ｈａｒｖｅｓｔ ｉｎ Ｃｈｉｎａ .
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ: ｃａｒｒｏｔ ｄｅｃａｙꎻ ｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｉｔｙꎻ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳꎻ Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｆｉｍｂｒｉａｔａ
文章编号: ０４１２￣０９１４(２０１４)０６￣０７０５￣０４
胡萝卜(Ｄａｕｃｕｓ ｃａｒｏｔａ)又名黄萝卜、丁香萝
卜ꎬ是伞形花科萝卜属的一、二年生草本植物ꎬ原产
亚洲西南部ꎬ约在 １３世纪从伊朗引入中国ꎬ主要用
作鲜冷冻蔬菜产品出口ꎬ我国现已成为世界胡萝卜
第一生产国和主要出口国[１]ꎮ ２０１２ 年云南省昆明
市农贸市场发现一种采后胡萝卜新病害ꎮ 症状表
现为:初期胡萝卜表面出现灰白色ꎬ后期变为黑色
且有肉眼可见的黑色子囊壳出现(图 １￣Ａ)ꎬ最后胡
萝卜表面腐烂ꎮ 为明确该病的病原菌ꎬ对其病原菌
进行了分离、致病性测定及形态、分子鉴定ꎬ以期为
病害防治提供一定的理论依据ꎮ
１ 材料与方法
１.１ 病原菌的分离和培养
２０１２年购买自云南农业大学农贸市场采后胡
萝卜ꎬ挑取子囊孢子在 ＭＥＡ 培养基上进行纯化、
培养和形态观察ꎬ所有的菌株经单孢分离获得单孢
菌株ꎬ常规分离方法见文献[２]ꎮ 选取 Ｄ１－Ｄ１０ 供
试菌株ꎬ分离到的菌株在 ＭＥＡ上 ２５℃恒温进行培
养和形态观察ꎬ４℃冰箱保存备用ꎮ
１.２ 致病性测定
１.２.１ 孢子悬浮液制备 供试菌株经单孢分离
(子囊孢子) 的病原菌在 ＭＥＡ 培养基上 ２５℃ 生
长 １０ ｄꎬ 然后将纯培养的病原菌用灭菌水洗下ꎬ倍
比稀释浓度为 １.０ × １０６个 / ｍＬꎮ
１.２.２ 新鲜胡萝卜接种 在健康成熟的胡萝卜表
面弄成 ０.５ ｃｍ × ０.５ ｃｍ伤口ꎬ涂抹 １００ μＬ孢子悬
浮液ꎬ放置在灭菌盘里培养观察ꎮ 用灭菌水为对
照ꎮ
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. １ Ｓｙｍｐｔｏｍｓ ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｗｉｔｈ Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｆｉｍｂｒｉａｔａ
Ａ: Ｖｉｓｉｂｌｅ ｂｌａｃｋ ｐｅｒｉｔｈｅｃｉａ ｉｎ ｃａｒｒｏｔ ｓｕｒｆａｃｅꎻ Ｂ: Ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｆｒｅｓｈ ｃａｒｒｏｔ ｒｏｏｔꎻ
Ｃ: Ｉｎｏｃｕｌａｔｅｄ ｔｗｏ￣ｍｏｎｔｈ￣ｏｌｄ ｐｌａｎｔｓ ｏｆ Ｄ. ｃａｒｏｔａ ａｆｔｅｒ ６ ｗｅｅｋｓ.
１.２.３ 苗期接种 选用苗期 ２ 个月的胡萝卜ꎬ用
Ｄ１和 Ｄ２菌株分别接种ꎬ每个接种菌株设置 ３ 个
重复ꎬ每个重复 １ 株ꎮ 接种方法:用微型注射器在
茎秆处注入 １００ μＬ孢子悬浮液ꎬ并用塑料膜包裹
少许湿的灭菌脱脂棉保湿ꎬ４８ ｈ 后取下ꎮ 用灭菌
水为对照ꎮ
１.３ 病原菌形态学观察
将菌株 Ｄ１ 和 Ｄ２ 接种到 ＭＥＡ 培养基上ꎬ于
２５℃恒温培养箱中培养 ７ ~ １５ ｄ 后ꎬ肉眼观察菌落
形态特征ꎬ用解剖针挑取少许菌丝体制片ꎬ在光学
显微镜下观察分生孢子、厚垣孢子、子囊壳及子囊
孢子形态ꎬ并测量其大小ꎮ
１.４ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ的 ＰＣＲ扩增与序列分析
１.４.１ 病原菌 ＤＮＡ的提取 基因组 ＤＮＡ提取采
用 ＡＢ 公司的 ＰｒｅｐＭａｎ Ｕｌｔｒａ Ｓａｍｐｌｅ Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ
Ｒｅａｇｅｎｔ(ｐ / ｎ４３１８９３０)快速提取真菌 ＤＮＡ试剂ꎬ方
法参照文献[３]ꎬ置于－２０℃冰箱保存备用ꎮ
１.４.２ 核糖体 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 区段扩增 以病菌基因
组 ｒＤＮＡ 为模板进行 ＰＣＲ 扩增ꎬ引物 ＩＴＳ１Ｆ ５′￣
ＣＴＴＧＧＴＣＡＴＴＴＡＧＡＧＧＡＡＧＴＡＡ￣３′ 和 ＩＴＳ４ ５′￣
ＴＣＣＴＣＣＧＣＴＴＡＴＴＧＡＴＡＴＧＣ￣３′ꎬ由上海捷瑞生
物工程有限公司合成ꎮ ＰＣＲ 反应体系(２５ μＬ):
２.５ μＬ １０×Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ、２.５ μＬ ｄＮＴＰｓ ０.２ ｍｍｏｌ / Ｌ、
１.５ μＬ ＭｇＣｌ２ １. ０ ｍｍｏｌ / Ｌ、１ μＬ 模板 ＤＮＡ、１. ０
μＬ ０.５ ｍｏｌ / Ｌ引物 ＩＴＳ１Ｆꎬ１.０ μＬ ０.５ ｍｏｌ / Ｌ 引物
ＩＴＳ４、 ０.５ μＬ Ｔａｑ 酶 １.５ Ｕ、１５ μＬ 双蒸水ꎮ 反应
条件:９４℃预变性 ９５ ｓꎻ９４℃变性 ３５ ｓꎬ５２℃退火
６０ ｓꎬ７２℃延伸 ６０ ｓꎻ３５ 个循环ꎻ最终 ７２℃延伸
１５ ｍｉｎꎬ４℃保存ꎮ
取 ２ μＬ ＰＣＲ 扩增产物和 ３ μＬ 核酸染料混
合ꎬ于 １.２％的琼脂糖凝胶上电泳检测ꎬ电泳缓冲液
为 ０.５ ｘ ＴＢＥꎬ在 １２０ Ｖ 电压下进行 ４５ ｍｉｎꎬ置于
ＵＰＶ紫外成像系统上观察成像ꎬ并拍照ꎮ
１.４.３ ＰＣＲ产物测序和序列分析 将 ＰＣＲ扩增产
物送华大基因公司进行正反双向测序ꎬ测序结果在
ＧｅｎＢａｎｋ ( ｈｔｔｐ: / / ｗｗｗ ｎｃｂｉ ｎｉｈ ｇｏｖ ) 中 进 行
ＢＬＡＳＴ 比对分析ꎻ利用 ＭＥＧＡ５.０ 软件构建系统
发育树ꎮ
２ 结果与分析
２.１ 病原菌形态观察
在 ＭＥＡ 上 ２５℃ 培养 ５ ~ ７ ｄ 的菌落直径为
５０ ｍｍ~６４ ｍｍꎬ１１ ｄ 左右长满全皿ꎮ 菌丝初为白
色ꎬ后变成浅棕绿色ꎬ最后为棕褐色ꎮ 培养 １周左右
产生大量子囊壳ꎬ子囊壳棕褐色至黑色ꎬ基部球形ꎬ
６０７
６期 李 婕ꎬ等:采后胡萝卜腐烂病病原菌鉴定
子囊壳基部宽(１５７.３~２６２.１) μｍꎬ高(１６５.３~２６８.９)
μｍꎬ具细长的喙ꎬ喙长(６３５.０~９６５.５) μｍ(图 ２￣Ａ)ꎬ
喙顶端呈须状ꎬ帽状的子囊孢子从顶端喷出时类似
奶油球ꎬ大小为 (５. ０ ~ ６. １) μｍ × (３. ６ ~ ４. ６) μｍ
(图 ２￣Ｂ、Ｃ)ꎻ圆柱形分生孢子 (８.７~３２.４) μｍ ×
(２.４~４.０)μｍ(图 ２￣Ｃ)ꎻ厚垣孢子椭圆形棕褐色ꎬ大
小为(１２.０~１４.０)μｍ×(７.３~１０.０)μｍ(图 ２￣Ｃ、Ｄ)ꎮ
２.２ 致病性测定
２.２.１ 新鲜胡萝卜接种 接种后 ５ ｄ 胡萝卜表面
可见明显黑色病斑(图 １￣Ｂ)ꎬ一周以后在胡萝卜表
面有肉眼可见黑色子囊壳ꎮ 从接种发病组织中重
新分离到该病原菌ꎬ而对照没有发病也未分离到任
何真菌ꎮ
２.２.２ 苗期接种 ５ ｄ 即可在接种部位看到茎秆
变黑ꎬ６ 周后接种植株出现叶片枯黄及枯萎症状
(图 １￣Ｃ)ꎮ 对接种发病植株进行病原菌的分离ꎬ均
能获得与原分离菌株形态和 ＩＴＳ 一致的病原菌ꎮ
对照植株未发病ꎬ也未分离到任何真菌ꎮ
根据柯赫氏法则ꎬ证明接种菌株 Ｄ１ 和 Ｄ２ 为
胡萝卜腐烂病的致病菌ꎮ
２.３ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列分析
ＰＣＲ产物经 １.２％的琼脂糖凝胶电泳检测ꎬ获
得 ５００~６００ ｂｐ 的清晰条带ꎬ测序得到 ２ 条 ５５１ ｂｐ
的 ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ 序列ꎬ将该序列提交至 ＧｅｎＢａｎｋ
(Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ:ＫＦ３５６１８４、 ＫＦ３５６１８５)ꎬ将测序结
果与 ＧｅｎＢａｎｋ 上已经发表的基因进行同源性比
较ꎮ 结果表明ꎬ供试菌株与 Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｆｉｍｂｒｉａｔａ
同源性为 ９９％ꎮ
利用 ＭＥＧＡ５.０软件构建系统发育树(图 ３)ꎬ
由图 ３ 可以看出ꎬ ＫＦ３５６１８４ 和 ＫＦ３５６１８５ 与
Ｃ. ｆｉｍｂｒｉａｔａ处于同一个分支ꎬ进化上的距离最近ꎮ
根据上述病原菌的形态特征以及 ＩＴＳ 序列同源性
比较的结果ꎬ鉴定该病原菌为甘薯长喙壳菌
(Ｃ. ｆｉｍｂｒｉａｔａ)ꎮ
Ｆｉｇ. ２ Ｉｓｏｌａｔｅ ｆｅａｔｕｒｅｓ ｏｆ Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｆｉｍｂｒｉａｔａ
Ａ: Ｐｅｒｉｔｈｅｃｉｕｍꎻ Ｂ:Ｏｓｔｉｏｌａｒ ｈｙｐｈａｅ ａｎｄ ａｓｃｏｓｐｏｒｅꎻ Ｃ: Ｃｙｌｉｎｄｒｉｃａｌ ｅｎｄｏｃｏｎｉｄｉａꎬ ａｌｅｕｒｉｏｃｏｎｉｄｉａ ａｎｄ ａｓｃｏｓｐｏｒｅꎻ
Ｄ: Ａｌｅｕｒｉｏｃｏｎｉｄｉａꎻ Ｂａｒｓ: Ａꎬ １００ μｍꎻ Ｂꎬ Ｃ: １０ μｍꎻ Ｄꎬ ２０ μｍ.
７０７
植物病理学报 ４４卷
Ｆｉｇ. ３ Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒｅｅ ｏｆ ｒＤＮＡ￣ＩＴＳ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｔｈｅ ｐａｔｈｏｇｅｎ ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｒｅｌａｔｅｄ ｓｐｅｃｉｅｓ
３ 结论与讨论
本研究于 ２０１２年从采后胡萝卜上分离到的真
菌菌株ꎬ接种新鲜胡萝卜根发病症状与自然发病一
致ꎬ接种胡萝卜苗后产生叶片枯黄和整株枯萎症
状ꎬ并且从接种植株上都分别重新分离到了原接种
真菌ꎬ经柯赫氏法则证明该菌为采后胡萝卜腐烂病
害的致病菌ꎮ 经过病原菌形态和分子鉴定分析ꎬ将
该病原菌确定为 Ｃ. ｆｉｍｂｒｉａｔａꎮ 此次分离到的真菌
菌株 Ｄ１ 和 Ｄ２ 与国外芋头菌株(Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ:
ＫＣ４９３１６９、ＡＹ５２６２８７)的同源性达到 ９９％ꎬ与我国
发现的引起芋头黑斑病病原菌 (Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ:
ＡＭ７１２４４７)和石榴枯萎病病原菌 (Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮＯ:
ＡＭ６９０７６７)同源性达到 ９７％ꎮ
据报道 Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ 和 Ｔ. ｔｈｉｅｌａ￣
ｖｉｏｉｄｅｓ引起市场上胡萝卜表面产生霉层[４]ꎮ
Ｃ. ｆｉｍｂｒｉａｔａ引起采后胡萝卜腐烂仅在巴西有报
道[５]ꎬ但是没有对该真菌进行子囊壳、子囊孢子、
分生孢子和厚垣孢子的测量与致病性鉴定ꎮ 甘薯
长喙壳菌引起采后胡萝卜腐烂在中国属首次报道ꎮ
参考文献
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中国农业出版社)ꎬ ２００６.
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ｂｅｔｔｅｒ ｋｎｏｗｎ: Ｔｈｉｅｌａｖｉｏｐｓｉｓ ｂａｓｉｃｏｌａ ａｎｄ Ｔ. ｔｈｉｅｌａ￣
ｖｉｏｉｄｅｓꎬ ｔｗｏ ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓ ｍｏｕｌｄｓ ｏｎ ｃａｒｒｏｔｓ ｓｏｌｄ ｉｎ ｓｈｏｐｓ
[Ｊ] . Ｍｙｃｏｌｏｇｉｓｔꎬ ２００４ꎬ １８: ６－１０.
[５] Ｃａｒｖａｌｈｏ Ａ Ｏꎬ Ｃａｒｍｏ Ｍ Ｇ Ｆ. Ｐｏｓｔ ｈａｒｖｅｓｔ ｄｅｃａｙ ｏｆ
ｃａｒｒｏｔ ｃａｕｓｅｄ ｂｙ Ｃｅｒａｔｏｃｙｓｔｉｓ ｆｉｍｂｒｉａｔａ [ Ｊ] . Ｆｉｔｏｐａｔｏ￣
ｌｏｇｉａ Ｂｒａｓｉｌｅｉｒａꎬ ２００３ꎬ ２８ (１): １０８.
责任编辑:于金枝
８０７